酵母双杂交

X-gal
blue color
We'll start by making transformed yeast expressing X
Fishing with the yeast two-hybrid system
b a it
p r o t e in X
c D N A f o r X
DNAbinding domain
W e w i l l u s e X a s b a i t . . . . t o t r y t o c a t c h Y .
As reference in this description, here is how the yeast two-hybrid expression system works.
Fishing with the yeast two-hybrid system
in other words is there a protein Y?
bait
X
p r e d a to r
Y
d o e s X b in d w ith a p ro te in ?
To find out we are going to go fishing with the two-hybrid system.
y e a s t p la s m id e x p r e s s io n v e c to r
p re d a to r
u n k n o w
tis s u e
bait
X
p r e d a to r
Y
d o e s X b in d w ith a p ro te in ?
t r a n s f e c t i o n t o t a l m R N A
t r a n s f e c t i o n
activation dom ain
Now we'll make transformed yeast expressing Y, if Y
does indeed exist.
Fishing with the yeast two-hybrid system
猎物或靶蛋白 (prey or target
protein)
这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎 物”相互作用的基因称为报道基因 （reporter gene）
X
Ga14 的DB
Y
Ga14 的AD 猎物(prey)
诱饵(bait)
报道基因
表达
报道基因的 基因产物
通过对报道基因表达产物的检测，反过来可判别作为“诱 饵”和“猎物”的两个蛋白之间是否可存在相互作用。
酵母双杂交技术
主要内容
一 酵母双杂交技术的基本原理 二 酵母双杂交技术的应用 三 酵母双杂交技术的改造 四 结束语
一 酵母双杂交技术的基本原理
酵母双杂交系统的建立基于“真核生物调控转录起始”。
酵母转录子Gal4分子由一条多肽链组成，含有881个氨 基酸。它有两个结构域： 1、 DNA结合结构域（DNA binding domain, DB ）由位于 N-末端1~147个氨基酸构成，能识别位于Gal 1基因的上游激 活序列（UAS, upstream activating sequence）,此外， 在其N-端还具有一段核定位序列； 2、转录激活结构域（activation domain, AD）由位于C-末 端的768~881位氨基酸构成。
Fishing with the yeast two-hybrid system
b a it
p r o t e in X
c D N A f o r X
bait
X
p r e d a to r
Y
d o e s X b in d w ith a p ro te in ?
DNAbinding domain
X
y e a s t p la s m id e x p r e s s io n v e c to r
bait
XY
prey
t r a n s f e c t i o n
tra n s fo rm e d y e a s t
transcription machinery
lac 2
-galactosidase
r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e
X
tra n s fo rm e d
y e a s t
c D N A
tra n s fo rm e d y e a s t
?Y
y e a s t p l a s m i d e x p r e s s i o n v e c t o r
他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型， 将前者与Ga14的DB结构域融合，另一个与Ga14的AD结构域的酸性区 域结合。（形成融合蛋白）
Snf1
Ga14 的DB
诱饵 (bait)
Snf2
Ga14 的AD
如果Snf1和Snf2之间存在相互作用， 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和 AD就能重新形成有活性的转录激活因子， 从而激活相应基因的转录与表达。
C N
UAS
768~881 AD
Gal 1基因
激活转录
不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正 常的激活转录的功能。
融合
结合到 Ga14结合
位点
DB
酵母细胞的 Ga14蛋白的DB
AD
大肠杆菌的一 个酸性激活结
构域B42
激活转录
DB AD
DB ADUASG源自l 1基因激活转录Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立
b a it
p r o t e in X
常用的报告基因有：HIS3，URA3,LacZ 和ADE等。如HIS3，可以通过该基因是否 表达在选择性培养基上筛选含有相互作 用蛋白的酵母；LacZ基因（β-半乳糖苷 酶基因），在X-Gal存在时利用它的颜色 反应对选择培养筛出来的阳性克隆作进 一步筛选。并可通过测定颜色反应的强 弱，分析蛋白X、Y间的相互作用的强弱 。
当Gal4 的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空 间上充分接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性.
酵母转录子Gal4分子
DB（DNA binding domain ） 1-147
768~881
C
AD (activation domain)
N
UAS（上游激活序列G） al 1基因
DB 1~147