CD4+T细胞分离、纯化及鉴定技术
CD4+T细胞体外刺激制备流程
CD4+T细胞体外刺激制备流程1. 按照小鼠或人源CD4+ T 细胞分离kit (Thermo) 说明书分离得到CD4+ T 细胞。
2. 取所需体积的PBS，按照5 μg/ml的终浓度加入Anti-mouse CD3e和Anti-mouse CD28抗体，500 μl/孔包被 Non-Treated 24-well plate，室温放置4h，吸掉抗体悬液，加入500 μl 1% BSA（PBS 配置）室温封闭30 min，封闭结束加入500 μl PBS洗孔一次。
注：请在分离细胞的同时准备好平板，包括后续感染所需的量。
3．将分离得到的CD4+ T按照浓度5´105 cell/ml重悬在完全T 细胞培养基中（1640, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 50 mM β-mercaptoethanol, 100 U/ml IL-2），将细胞加入步骤2中包被处理好的平板，2 ml每孔（1´106 cell/well），然后放入37℃ CO2培养箱刺激培养48h。
细胞在刺激24h后体积略微增大，进入活化状态，刺激48h后可进行病毒感染。
四. CD4+ T细胞感染（以过表达GFP的病毒为例）1. 收集活化好的CD4+ T细胞，400g离心5min。
用T细胞培养基重悬计数备用，在收集的过程中发现有些细胞会贴壁，此为正常现象，可反复吹打至贴壁的细胞也呈悬浮状态。
2. 另取一Anti-mouse CD3e和Anti-mouse CD28抗体包被好的24孔板，每孔加入2-5´105的细胞（若为96孔板，加入2´104细胞/孔）。
若考虑长期表达目的基因，按MOI=50-100加入T细胞专用逆转录病毒mTRv-GFP或者hTRv-GFP，注意鼠源和人源原代T细胞所适合的逆转录病毒种类差别；若考虑瞬时（一周以内）表达目的基因，可按MOI=500-1000加入悬浮细胞专用腺病毒Ads-GFP。
小鼠CD4^+CD25^+T细胞的分离、鉴定和体外功能的检测
小鼠CD4^+CD25^+T细胞的分离、鉴定和体外功能的检测周洁;袁劲;周鸿敏;杜敦峰;陈必成;昌盛;陈忠华【期刊名称】《免疫学杂志》【年(卷),期】2005(21)2【摘要】目的建立CD4 + CD2 5 + T细胞的免疫磁性分离(MACS)方法,并检测其体外免疫抑制功能。
方法分离C5 7BL 6小鼠和Balb c小鼠脾脏细胞后运用MACS法分离CD4 + CD2 5 + T淋巴细胞,用台盼蓝染色法和流式细胞法检测选出细胞的活性和纯度,用淋巴细胞转化实验分析其免疫抑制功能。
结果MACS分选法分选出的CD4 + CD2 5 + T细胞活性>97% ,纯度>95 % ;此方法获得的CD4 + CD2 5 + T细胞在体外不增殖,经丝裂原活化后可以抑制同品系小鼠和异品系小鼠的CD4 + CD2 5 -T细胞增殖,这种抑制作用具有剂量依赖性。
结论MACS法可简单迅速分选出高纯度无菌CD4 + CD2 5 + T细胞,且不影响细胞活力。
CD4 + CD2 5 + T调节性细胞在体外具有免疫无能和免疫抑制作用;丝裂原活化的该细胞免疫抑制功能具有剂量依赖性,但不具有抗原特异性。
【总页数】5页(P92-95)【关键词】CD4^+CD25^+T细胞;免疫磁性分离;AlamarBlue;免疫无能;免疫抑制【作者】周洁;袁劲;周鸿敏;杜敦峰;陈必成;昌盛;陈忠华【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院同济器官移植研究院器官移植教育部卫生部重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.针灸及其血清对荷瘤小鼠CD4~+CD25~+Treg细胞体外增殖的影响 [J], 刘志丹;裴建;傅勤慧;李海燕;余奇文;张继英;张冬青2.CD4^+ CD25^+ Foxp3^+及CD4^+ CD25^- Foxp^(3+)调节性T细胞在小鼠衰老过程中的变化规律 [J], 高琦;马湉;张霞;姜杨;张利宁3.Foxp3转染小鼠CD4^+CD25^-T细胞抑制树突状细胞功能 [J], 周浩;黎纬明;张敏;刘峥嵘;邹萍4.致敏小鼠CD4^+ CD25^+调节性T细胞磁珠分选及体外扩增 [J], 潘莉;翁文骏;许吕宏;魏菁;方建培5.体外扩增CD4^+ CD25^+ Treg细胞的效果比较及体外免疫抑制功能鉴定 [J], 翁文骏;潘莉;方建培;许吕宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
原代SD大鼠CD4+T细胞的分离纯化及鉴定
原代SD大鼠CD4+T细胞的分离纯化及鉴定杨艳华;戴迟兵【摘要】目的:建立一种获得高质量、数量多的原代CD4+T细胞的有效可靠的方法.方法:依次采用密度梯度离心(procell density Centrifugation)和免疫磁珠分选法从SD大鼠新鲜脾脏中分选出CD4+T细胞,CD4+T细胞生长状况及特点采用倒置相差显微镜观察、提取细胞的纯度以流式细胞术鉴定.结果:流式细胞术鉴别CD4+T细胞纯度为96％,其中(CD4+T+CD62 L双标)初始CD4+T细胞纯度为60.7％,与密度梯度离心收集的单核细胞(CD4+T细胞纯度为0.2％)比较,差异均有统计学意义(P<0.01).通过形态学观察从原代SD大鼠脾脏中分离的CD4+T细胞,表现为透明圆颗粒状悬浮生长,48h内活性最高.结论:采用密度梯度离心分离,免疫磁珠分选纯化原代大鼠初始CD4+T细胞具有数量多、活性好、纯度高、生物学特性稳定的优点,可用于相关研究.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2018(031)021【总页数】4页(P3161-3164)【关键词】原代初始CD4+T细胞;CD4+T细胞;细胞分选;密度梯度离心;免疫磁珠分选纯化【作者】杨艳华;戴迟兵【作者单位】恩施土家族苗族自治州中心医院消化内科,湖北省恩施市 445000;三峡大学仁和医院消化内科【正文语种】中文【中图分类】R310.14+34CD4+T细胞是人体免疫系统中重要的免疫细胞，在差异的细胞因子及环境作用下初始CD4+T细胞可分化成功能各异的亚型：Th1、Th2、Th17、Treg。
在免疫学相关研究中CD4+T细胞有着显著的研究价值，但CD4+T细胞原代提取以及体外培养存活难度较大，因此需建立一套快捷、高效的体外分离，培养，纯化方法。
本研究在常规提取T细胞的基础上，提出一套高效率的提取CD4+T细胞的方法，得到纯度高、细胞数多、生物活性稳定的CD4+T细胞，为进一步深入相关研究提供稳定的初始细胞。
t细胞分离方法和分离原理
t细胞分离方法和分离原理（最新版4篇）目录（篇1）1.T 细胞的概述2.T 细胞分离的常用方法3.T 细胞分离的原理4.T 细胞分离的应用5.总结正文（篇1）T 细胞是免疫系统中的一种重要细胞类型，它在免疫应答中扮演着关键的角色。
T 细胞的分离和纯化对于研究免疫系统和疾病的免疫机制具有重要意义。
一、T 细胞的概述T 细胞，即 T 淋巴细胞，是一种重要的免疫细胞，主要参与细胞免疫应答。
根据功能和表型的不同，T 细胞可分为多种亚型，如 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、CD4+ CD25+调节性 T 细胞等。
二、T 细胞分离的常用方法目前，常用的 T 细胞分离方法主要有以下几种：1.贴壁粘附法：利用 T 细胞与特定抗原结合的能力，使 T 细胞粘附在固相载体上，从而与其他细胞分离。
2.磁珠法：通过连接有磁珠的特异性单抗与 T 细胞表面抗原结合，在外加磁场中，利用磁珠与细胞间的相互作用力，实现 T 细胞的分离。
3.流式细胞术：利用 T 细胞表面特异性抗原与荧光标记的抗体结合，通过流式细胞仪对细胞进行分选。
4.尼龙毛柱分离法：利用尼龙毛对 T 细胞的吸附能力，与其他细胞进行分离。
三、T 细胞分离的原理T 细胞分离的原理主要基于其表面抗原与特定抗体或物质的特异性结合。
通过这种结合，可以利用外力（如磁场、离心力等）使 T 细胞与其他细胞分离。
目录（篇2）1.T 细胞的概述2.T 细胞分离的必要性3.T 细胞分离的方法a.免疫磁珠法b.尼龙毛柱分离法c.贴壁粘附法d.Percoll 分层液法4.T 细胞分离的原理a.免疫磁珠法的原理b.尼龙毛柱分离法的原理c.贴壁粘附法的原理d.Percoll 分层液法的原理5.T 细胞分离的应用6.总结正文（篇2）T 细胞是免疫系统中的一种重要细胞类型，它在免疫应答中起着关键作用。
T 细胞的分离和纯化对于研究免疫系统和疾病机制具有重要意义。
本文将介绍 T 细胞分离的方法和分离原理。
免疫磁珠法纯化人外周血CD4+T细胞
免疫磁珠法纯化人外周血CD4+T细胞
周晓荣;丁润生;孙晓雷
【期刊名称】《交通医学》
【年(卷),期】2003(017)006
【摘要】目的:采用Dynal免疫磁珠法从人外周血单个核细胞(MNC)中分离和纯化CD4+T细胞.结果:经过流式细胞仪测定纯度达到(96.4±2.6)%,0.2%台盼兰染色细胞活力为(96.9±3.6)%,增殖试验表明分离后的CD4+T细胞对植物血凝素(PHA)的刺激保持了良好的增殖能力,为进一步纯化CD4+T细胞的生物学特性创造了条件.【总页数】2页(P625-626)
【作者】周晓荣;丁润生;孙晓雷
【作者单位】南通医学院微生物教研室,江苏,226001;南通医学院附属医院血液科;南通医学院微生物教研室,江苏,226001
【正文语种】中文
【中图分类】R392-33
【相关文献】
1.免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞及向成软骨细胞分化 [J], 徐鹏;赵子义;高鹏;秦大明
2.Percoll分离法结合免疫磁珠法分离提纯人外周血中性粒细胞方法的建立 [J], 郑小莉;罗波;梅志强;李申;刘佳佳
3.免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞及向神经细胞定向分化 [J], 徐鹏;舒畅;赵子义;张伟
4.免疫磁珠法分离人外周血T淋巴细胞 [J], 牟贤龙;郑茂荣;方跃明
5.免疫磁珠法分离人外周血CD4^+ CD25^+调节性T细胞 [J], 牛微;杨曌;尚小云;傅晓岚;唐艳;黎万玲;姜曼;王莉;吴玉章
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CD4细胞分选SOP
CD4细胞分选实验计划Dynabeads洗涤（Dynabeads使用前必须清洗）1.重悬瓶中Dynabeads2.转移需要量的Dynabeads到离心管，200ul×32只×2个时间点=12.8ml，一次6.4ml，分7管洗涤。
3.加入同样体积的Buffer 1，或者至少1ml，混匀4.将离心管放在磁力架上1min，弃去上清5.移去磁力架，同样体积的Buffer 1重悬Dynabeads样品准备1x107淋巴细胞，细胞悬液体积100ul细胞分离关键步骤1.使用能提供离心和倾斜的混匀器，确保Dynabeads不会沉淀于管底2.每1x107淋巴细胞所用的Dynabeads不得少于200ul3.严格按照磁力架建议，确保成功分离从小鼠脾或淋巴结中分离CD4+T细胞本操作流程基于1x107淋巴细胞，可分离1x107至1x107个细胞。
1.将100ul(1x107)淋巴细胞（悬于Buffer 1）加入离心管中2.加入20ul热失活的FCS, 加入20ul抗体混合液3.混匀，孵育2-8℃，20min4.加入2ml Buffer 1洗涤细胞。
通过倾斜离心管多次来混匀细胞，离心300 xg，8min，4℃。
弃去上清5.800ul Buffer 1重悬细胞6.加入200ul 已洗涤过的Dynabeads7.孵育15min，18-25℃。
轻柔地倾斜离心。
8.轻轻抽吸5次以重悬磁珠结合的细胞（1000或5ml头）9.加入1ml Buffer 110.静置在磁力架上2min, 转移上清到新管中，上清中即为阴性选择的小鼠CD4+T细胞。
cd4t细胞亚群流式分选
cd4t细胞亚群流式分选
CD4+T细胞亚群是人体免疫系统中的重要组成部分，它们在维持免疫平衡和抵御疾病方面发挥着关键作用。
流式分选技术是一种高效、精确的方法，用于分离和鉴定这类细胞。
在流式分选中，首先需要收集所需的细胞样本，通常是外周血或淋巴结穿刺液。
样本经过适当的处理后，会被标记上荧光抗体，这些抗体能够特异结合CD4+T细胞表面的抗原。
抗体标记的细胞通过流式细胞仪进行检测和分析，该仪器能够快速分析大量细胞，并根据荧光信号将它们分成不同的亚群。
流式分选的关键在于抗体标记的选择，以及流式细胞仪的参数设置。
针对CD4+T细胞的不同亚群，需要选择相应的特异性抗体，以便准确地区分不同的细胞类型。
此外，还需要调整流式细胞仪的参数，包括激光波长、滤片、电压等，以确保最佳的检测效果。
通过流式分选，我们可以获得高纯度的CD4+T细胞亚群，这对于研究免疫细胞的生理和病理功能、开发新的治疗方法具有重要的意义。
例如，某些疾病如艾滋病、风湿性关节炎等与CD4+T细胞的功能异常有关，通过流式分选可以深入了解这些疾病的发病机制。
此外，流式分选技术还可以用于监测疾病的进展和治疗反应。
例如，在艾滋病治疗中，通过监测CD4+T细胞亚群的动态变化，可以评估治疗效果和调整治疗方案。
总之，CD4+T细胞亚群的流式分选技术是一种强大的工具，有助于我
们深入了解免疫系统的功能和疾病的发生发展机制。
随着技术的不断进步和应用领域的拓展，流式分选将在未来的医学研究中发挥更加重要的作用。
树突状细胞的分离纯化
DC的来源和分布
DC分布全身各组织脏器（除脑组织外）。 langgerhans cells（LC） ，分布于表皮、胃肠道上皮 interstitial DC，分布于心、肝、肺、肾等脏器 follicular dendritic DC（FDC），分布于淋巴结滤泡区 interdigitating cell（IDC ），胸腺依赖区和胸腺髓质
CD4+ 血液树突状细胞的直接 、阳性选择
1.将富含树突状细胞的悬液离心 1.将富含树突状细胞的悬液离心 2.加磁珠标记的CD4单克隆抗体 2.加磁珠标记的CD4单克隆抗体 3.离心 3.离心 4.分离柱冲洗 4.分离柱冲洗 冲出即为CD4标记的树突状细胞 冲出即为CD4标记的树突状细胞
•
用FITC 标记HLA-DR, 与表达HLA-DR 细胞结合,通过与 对照组相比去除假阳性率 M1, M2为所测样本阳性细胞百 分比。在 PBMC 中HLA-DR+细胞占13%左右( 图1) ,而在 纯化的CD4+DC细胞中HLA-DR 的表达率达到80%以上 (图1) 。
Discussion
斯坦曼获得诺贝尔医学奖说明了现在科学 界对通过免疫治疗各种疾病是十分有信心 的。 免疫磁珠方法选择性很强，但选择性强的 话干扰就变大了，我们可以在这一方面入 手。
References
• 唐岩，唐军民，李银生，伊焕发，戴燕。 免疫磁珠技术在分离人外周血树突状细胞 中的应用。解剖学通报，2003 • 陈向荣，石汉平。树突状细胞的分离纯化 与鉴定。上海免疫学杂志，2001 • 伊焕发，唐 岩，甄昱，唐军民，孙红亚。 人外周血 CD4+树突状细胞的纯化及鉴定。 解剖科学进展，2003
分离柱冲洗分离柱冲洗冲出即为冲出即为cd4cd4标记的树突状细胞标记的树突状细胞用fitc标记hladr与表达hladr细胞结合通过与对照组相比去除假阳性率m1m2为所测样本阳性细胞百pbmc中hladr细胞占13左右而在纯化的cd4dc细胞中hladr的表达率达到80以上discussion斯坦曼获得诺贝尔医学奖说明了现在科学界对通过免疫治疗各种疾病是十分有信心免疫磁珠方法选择性很强但选择性强的话干扰就变大了我们可以在这一方面入免疫磁珠技术在分离人外周血树突状细胞中的应用
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CD4+T细胞分离、纯化及鉴定技术.doc
CD4+T细胞分离、纯化及鉴定
1. 主要实验材料：MRL/lpr狼疮小鼠；免疫磁珠；CD3-CY5抗体；CD4-FITC 抗体
2. 实验设置：
（一） CD4+T细胞分离
取MRL/lpr狼疮小鼠（18周龄），颈椎脱臼处死，小心剪开小鼠的腹部外皮，再打开腹腔，无菌条件下取出脾脏，在培养皿中加人EZ-SepTM Mouse 1X淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在皿上，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中，把悬有脾脏细胞的分离液转移到离心管中，800×g离心30min ，离心结束后，淋巴细胞漂浮，吸出淋巴细胞层，250g离心10min，弃上清，0.5mlPBS重悬细胞，加入CD4+标记磁珠，每1×107个细胞加入10ul，4℃避光孵育15min后，300×g离心10min，弃上清，加入0.5ml缓冲液重悬细胞，置LS分离柱于Midi MACS分选器中，1ml缓冲液冲洗LS 分离柱，将细胞悬液加入分离柱中，滴干净后洗柱3次，每次3ml缓冲液，将LS分离柱移出磁场，将滞留在LS分离柱中的CD4+T细胞缓慢冲出，加入PBS洗涤，300×g离心10min，弃上清，细胞沉淀冻存于液氮备用。
（二）分离前后CD4+T细胞纯度鉴定
取上述经MACS分离前后的细胞1×105，离心，弃上清，加入80ul PBS、10ul抗CD3 mAb-CY5和10ul抗CD4 mAb-FITC，混匀，室温避光放置30min 后上流式细胞仪检测分析。