细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定
医学细胞生物学设计型实验——细胞核的分离与鉴定
细胞核的分离和鉴定
注意事项：
（1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整 个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
（2）将匀浆液过滤于离心管中后应及时离心，以 防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离 心分层效果。
（3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太 厚。
细胞核的分离和鉴定
（4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避 免将染色洗去，观察不到细胞核。 （5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避 免血细胞对实验的影响。
第一大组
医学细胞生物学设计型实 验设计报告——细胞核
的分离与鉴定
成员：彭英、向欢欢、令狐琪琦、杨秀麟、敬 昱宸、李明先
细胞核的分离和鉴定
实验原理
一、分离细胞质与细胞核
１.破碎细胞自溶法 酶处理 表面活性剂处理法
细胞破碎的方法
物理法
细胞核的分离和鉴定
差速沉降离心法 离 心 方 法 速率区带离心法
密度梯度区 带离心法
等密度区带离心法
细胞核的分离和鉴定
差速离心differential centrifugation
低速
加速
高速
差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相 差较大（一般为10倍）的颗粒。
细胞核的分离和鉴定
实验步骤：
1、 颈椎脱臼法处死小白鼠。迅速开腹取肝，在盛有 生理盐水的小烧杯中反复洗涤。
另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色 性物质遇到甲苯胺蓝可呈易染性紫红色，因此可用 于肥大细胞的检测，例如色素性荨麻疹。
细胞核的分离和鉴定
预期结果：
低倍镜下找到标本，再换到高倍镜， 可见肝细胞的细胞核已经游离出来，圆形， 被染成蓝紫色，核仁有2到4个。
细胞核的分离和鉴定
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定【实验目的】1.掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。
2.了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。
3.进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。
【实验原理】1.DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。
2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各组分分级分离出来。
肝组织破碎后，柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质的正常结构和活性。
如将此种细胞核保存在等渗（0.25M）蔗糖溶液中（内含微量钙离子，防止核聚集和脆性），可以比较好地保存其完整的正常结构。
在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。
适当调整离心力，可得到纯化的细胞核沉淀。
3.脱氧核糖核酸的鉴定：【操作步骤】1、0.5g肝组织＋5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨2、肝匀浆，倾入离心管，离心：3000r/min；15′3、离心结束后，上清液移入另外一个试管中备用（此为细胞质液）4、沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液，玻棒搅匀后，为核悬液。
5、另外取离心管一只，加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。
用滴管吸取核悬液。
沿管壁缓慢铺于液面上。
6、离心：2000r/min；10′.上层液，弃去；沉淀为初步纯化的细胞核。
7、核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，10 ′白色沉淀为纯化的细胞核。
8、加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核，即为待测的核液。
9、脱氧核糖核酸的鉴定（1）水解：取离心管二支，编号，按下表操作混合各管沸水浴(10’)离心3000r/min;5′上清液(2)鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:混合各管沸水浴(15’)冷却比较各管颜色(595nm) 编号 1 2细胞质（ml） 2.0 -核液（ml）- 2.01M过氯酸(ml） 2.0 2.0[结果分析]标准曲线法：分别计算细胞质和细胞核中的含量。
细胞核的分离和鉴定
细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定是生物学实验中的一项重要技术，用于研究细胞核的结构和功能。
以下是细胞核的分离和鉴定的实验步骤和注意事项。
一、实验步骤1.准备实验材料：动物细胞、低速离心机、离心管、磷酸缓冲液（PBS）、生理盐水、DAPI染色液、荧光显微镜、紫外分光光度计等。
2.制备细胞核悬液：将动物细胞在低速离心机中进行离心，去除细胞质和细胞器，得到细胞核悬液。
3.分离细胞核：将细胞核悬液在离心管中进一步离心，去除细胞质和细胞器，得到纯净的细胞核。
4.鉴定细胞核：将分离到的细胞核进行染色，使用DAPI染色液将DNA染色，在荧光显微镜下观察细胞核的形态和染色体的分布。
同时，也可以使用紫外分光光度计检测细胞核中的DNA含量。
二、注意事项1.实验前需要熟悉实验步骤和操作流程，确保实验的准确性和安全性。
2.在制备细胞核悬液时，需要控制离心速度和时间，避免对细胞核造成损伤。
3.在分离细胞核时，需要保证细胞的纯净度，避免其他细胞器和细胞的污染。
4.在鉴定细胞核时，需要选择合适的染色方法和观察条件，确保实验结果的准确性和可靠性。
5.实验结束后需要妥善处理实验材料，保证实验室的安全和卫生。
三、结论细胞核的分离和鉴定是研究细胞核结构和功能的重要技术之一。
通过该技术，我们可以获得高纯度的细胞核样本，进一步研究细胞核内染色体的分布、DNA的含量和基因表达等生物过程。
同时，该技术也可以应用于临床诊断和治疗中，如检测肿瘤细胞的恶性程度和治疗效果等。
因此，掌握细胞核的分离和鉴定技术对于生物医学领域的研究和应用具有重要意义。
四、建议与展望在未来的研究中，可以进一步探索细胞核的分离和鉴定技术的新方法和新技术。
例如，使用新型的分离介质和设备提高细胞核的纯度和提取效率；开发新的染色方法和荧光探针，提高细胞核鉴定的准确性和灵敏度；利用人工智能和机器学习等技术对细胞核图像进行分析和处理，提高实验数据的可重复性和准确性等。
此外，还需要加强对于细胞核结构和功能的深入研究，为临床诊断和治疗提供更多有用的信息和技术支持。
实验六 细胞核的分离与核酸的鉴定
2、核酸的水解 、
磷酸 核酸 核苷酸 碱基 戊糖 • 定糖法（戊糖的差异） 定糖法（戊糖的差异）
（1）核糖核酸的鉴定
RNA
CHO
H C OH H C OH H C OH CH2OH
ＯＨ¯ ＯＨ 水解
β－ D－核糖 －
浓HCl
HC HC O
CH C CHO
＋ 3H2O
β－ D－核糖 －
CH3
糠醛
CH3 HC CH C C O O OH CH3
沸水浴(10′) 沸水浴
冷却
加入5%三氯 加入 三氯 醋酸 (8ml) 2000r/min； 2000r/min；5′
搅匀后离心 上清液
2．鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: ．鉴定：取试管三支，编号，按下表操作 1 2 3 编 号 细胞质水解液（滴） 细胞质水解液（ 核液水解液（ 核液水解液（滴） 5％三氯醋酸（滴） ％三氯醋酸（ 3,5一二羟基甲苯液（滴） 一二羟基甲苯液（ 一二羟基甲苯液 20 10 30 20 10 30 30 30
一、分离细胞质与细胞核
１.破碎细胞
机械法 细胞破碎的方法 物理法 高速组织捣碎机 玻璃匀浆器 研钵 超声匀浆器 冻融法 自溶法 酶处理 表面活性剂处理法
化学法
２.离心技术 离心技术
利用各细胞器在一定介质中的沉降速度的差 利用各细胞器在一定介质中的沉降速度的差 可采取离心的方法，将细胞器分离出来。 异，可采取离心的方法，将细胞器分离出来。
实验6 实验6
细胞核的分离与核酸的鉴定
（Separation of cell nuclei and identification of nucleic acids） ）
遵义医学院生物化学教研室 曹桂群
细胞的分离与鉴定
可以利用分离细胞核所需要的离心力将 细胞核分离出来， 细胞核分离出来，再运用细胞化学法 进行鉴定。 进行鉴定。分离细胞核最常用的方法 是将组织制成匀浆， 是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介 质中用特定的离心力进行离心、分离， 质中用特定的离心力进行离心、分离， 然后进一步分析鉴定。其基本过程包 然后进一步分析鉴定。 括组织匀浆、分级分离和分析3个步骤。 括组织匀浆、分级分离和分析3个步骤。
三、实验步骤
断 头
开腹 取肝
生理盐水 10ml
洗涤 2-3次
称取约 1g肝 1g肝 离心
预冷蔗糖预冷蔗糖-CaCl2 8ml
剪碎 低温匀浆
过滤 配平 涂片① 涂片① 涂片② 涂片②
2500rpm 15min 甲苯胺蓝 5-7min
上清液 沉淀制成悬液
染色
冲洗、晾干、 冲洗、晾干、镜检
四、结果观察
高倍镜下可见肝细胞核已游离 出来，被染成蓝紫色，圆形， 出来，被染成蓝紫色，圆形，中央 有2-4个甚至更多个深蓝色的核仁。 个甚至更多个深蓝色的核仁。
五、注意事项
1 匀浆的规范操作 2 离心机的正确使用 3 涂片技巧 保持实验台的卫生（ 4 保持实验台的卫生（纱布清洗 干净等） 干净等）
细胞生物学实验
细胞核的分离与鉴定
一、实验目的
1 2 3 掌握分离细胞核的原理 熟悉细胞核的鉴定方法 了解细胞核的分离过程
二、实验原理
细胞核的比重和大小与细胞内其他组 分不同， 分不同，在同一离心场内其沉降速度也 不同，所以，常用不同介质和不同的离 不同，所以， 心力离心（即差速离心）， ），将细胞内各 心力离心（即差速离心），将细胞内各 细胞器 和组分分级分离 出来。 出来。
实验仪器
细胞核的分离和鉴定 (2)
• •
镜检
四、注意事项
• 1.用三氯醋酸处理时，时间不能过长或过短，过长 会使核膜裂解，过短会使抽取的核酸不足。 • 2.在染色时时间一定要足够，否则染色不完全得不 到理想的结果。 • 3.去掉胞质的核体贴附能力弱，应注意在固定、三 氯醋酸处理、染色时尽量避免胞核的脱落。
五、预期结果
• 在低、高倍镜下 ，可观察到经 1﹪碱性固绿染 色的肝细胞涂片 b的细胞核体被 染成绿色。说明 这是碱性蛋白， 即细胞核已游离 出来。
三、操作流程
• 颈椎脱臼法处死小白鼠 剪碎置于盛有0.9﹪NaCl烧杯中，反复洗涤，用 滤纸吸去表面的液体 • 取鼠肝1g • 去污 • • • 量取8ml预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液 先加入少量，加入肝组织后全部加入 匀浆过滤 研磨3~5次，用3层纱布过滤，制作涂片a，自然干燥 •
三、操作流程
•
离心
2500r/min离心15min ，离去上清液
•
•
悬浮
• • • • • •
• 涂片放入1﹪碱性固绿中染色10min，冲洗，晾干
6ml0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液悬浮沉淀物， 再以2500r/min离心15min ，离去上清液 ，制成悬液制作涂片b，自然干燥 固定 涂片a、b放入70﹪乙醇溶液固定5min，晾干 处理 固定好的涂片浸入90℃ 5﹪三氯醋酸溶液2min，冲洗，滤纸吸干多余水分 染色
二、实验用品
• ⑴材料：小白鼠肝脏 • ⑵试剂：0.9﹪NaCl溶液、0.25mol/L蔗糖0.003mol/L氯化钙溶液、70﹪乙醇溶液、 5﹪三氯醋酸溶液、1﹪碱性固绿。 • ⑶仪器设备：显微镜、普通离心机、天平 、离心管、滴管、玻璃漏斗、量筒、25毫 升烧杯、解剖剪、镊子、冲洗瓶、纱布、 玻璃匀浆器、载玻片、盖玻片、染色盘架 、气管。
细胞核的分离与鉴定
细胞核的分离与鉴定
细胞核是细胞中的重要组成部分，它包含了细胞所有的遗传信息。
因此，分离和鉴定细胞核对于研究细胞生物学极为重要。
本文将介绍细胞核的分离和鉴定的方法。
1. 利用离心法分离细胞核
离心法是将混合物沉淀分离出不同密度组分的方法。
分离细胞核的常见离心法有两种：
(1) 不同速度离心分离法：此方法中，首先将细胞用生理盐水洗涤后，用一定浓度的卵白酶消化除了细胞表面的蛋白质。
接下来，用卵白酶抑制剂中和卵白酶的作用，以避免对细胞核的影响。
然后，将细胞用离心管离心，分离出胞浆和细胞核，离心速度根据细胞类型和实验目的来定。
(2) 密度梯度离心分离法：此方法中，首先制备密度梯度液，将细胞悬液添加到密度梯度液上层，离心分离，从而得到不同密度的细胞组分。
具体实验步骤可参考文献。
染色质是细胞核中的主要成分，其中包括染色体。
因此，利用染色体分离技术可以鉴定细胞核。
常见的染色体分离方法有两种：
(1) 干切片染色体分离法：此方法中，将细胞用生理盐水洗涤，再用一定比例的低渗盐溶液或isotonic KCl溶液处理，使其肿胀和膨胀，然后涂在玻璃片上，用过的废染液或乙醇固定。
接着，将涂有细胞的玻片在高温下加热，使其变薄，再进行染色和观察。
(2) 体外染色体分离法：此方法中，取同种细胞制备成细胞核悬液，再加入5倍体积的低渗盐溶液，使染色质膨胀，不同染色体在离心过程中分离。
然后，制备成干片，进行染色和观察。
细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)
细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)一、实验目的1.熟悉细胞分离和鉴定的基本操作方法。
2.掌握用离心技术从小鼠肝脏中提取细胞核的方法。
3.通过细胞核染色体形态的观察，了解细胞核在生物体中的作用。
二、实验原理细胞分离和鉴定是细胞学的基础实验，也是细胞学研究的重要手段之一。
细胞分离是将组织或细胞块中相关性高的细胞或不同类型的细胞分离开，以便进行对其性质和功能的分析和研究。
细胞鉴定是针对某种细胞类型，利用某种特异性分辨手段，对该细胞的特定结构或成分进行检测和区分，以便识别该细胞类型的性质和角色。
2.离心技术离心是利用离心机中高速旋转的离心头，通过离心力的作用，使样品中不同的物质沉淀到零件上，从而实现分离的技术手段。
离心用于分离固体及液体的混合物，也可用于分离生物学样品中的细胞、细胞器、酶和其他生物大分子，常用于提取细胞核或线粒体等细胞器。
三、实验步骤1.制备小鼠肝脏组织样品取2只小鼠，用无菌注射器注射适量无菌生理盐水溶液，待小鼠麻醉后，将小鼠放在消毒过的工作台上，采用外科手术的方法，将小鼠的腹部切开，取出小鼠肝脏，用无菌生理盐水清洗小鼠肝脏，用吸水纸吸干水分后，将小鼠肝脏组织分为小块状，存放于无菌离心管中备用。
2.分离细胞核将小鼠肝脏样品加入预冷的离心管中，用等体积的细胞破碎缓冲液A混合，使溶液刚好能淹没样品。
再次加入等体积的细胞破碎缓冲液B，使样品浓度适当。
将混和物在冰上慢慢摇晃，5分钟后，离心5分钟，去除上清液，洗涤后继续离心5分钟，去除上清液，洗涤后再次离心5分钟，去除上清液，离心操作后小鼠肝脏组织在管底沉淀下来。
3.制备细胞核标本将离心完成后的小鼠肝脏组织中的细胞核有效部分，制备成固定标本。
首先，将组织标本样品用福尔马林固定10-20分钟；然后，在干净玻璃片上滴上碘静（10-15μL），用酒精进行漂白，再用氢氧化钠溶液中和酒精，将玻璃片在空气中晾干，制备成细胞核标本。
4.细胞核染色滴一滴核染色剂（主要成份为酸性染料FOSCIN）在经过固定、漂白、中和后的细胞核标本中央，静置2-3分钟，漂洗干净后，在细胞核标本切片下滴上甘油凝胶，覆盖上玻片，并晾干即可。
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医学细胞生物学设计型实验设计报告
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实验项目：细胞核的分离与鉴定
实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。
所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。
差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。
2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条件下进行离心分离，然后分析鉴定。
3、匀浆是指在低温条件下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。
实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。
2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。
3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。
左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。
4、过滤：用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）
过滤匀浆液于离心管中。
5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心15min，取上清液于另一离心管中。
6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。
将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。
7 、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液，染色5到7分钟（即滴染）。
8、洗涤：冲去染液，晾干。
9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。
注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。
2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。
3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。
预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。
实验用品：材料：小白鼠肝脏。
试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖0.003mol/L氯化钙溶液、1%甲苯胺兰染液。
仪器设备：显微镜、普通离心机、天平、离心管、滴管、玻璃漏斗、量筒、25ml烧杯、解剖剪、镊子、冲洗瓶、纱布、伯乐匀浆器、载玻片、盖玻片、染色盘架。
设计组名单：
教师：日期： . .。