免疫学综合实验_2014

鱼类免疫学综合实验

一、实验目的

通过测定人的ABO血型，鱼的血清沉降抗体效价、白细胞的分离与鉴定、溶菌酶活性等实验的基本实践操作，加深对课堂知识的理解和体会，进一步掌握鱼类免疫学的基本理论，熟悉常规免疫学实验基本操作。

二、实验材料

（1）实验材料：鲫

（2）实验工具：微量移液器、稀释棒（25μl）、载玻片、培养皿、离心管、注射器（2ml、5ml）、手术剪、酒精灯、显微镜、打孔器、大头针、恒温箱、冰箱、生理盐水、金黄色葡萄球菌、甲醇、吉姆萨染液、肝素钠、琼脂等。

三、实验准备

1、取两支离心管，一支加入少量肝素，使肝素钠浸润管壁，另一支不加。

2、在鲫两鳃之间剪断腹主动脉，头腹部向下，使血液滴入上述两试管，混匀，置于离心管板静置1小时备用。

四、实验项目

（一）ABO血型鉴定（玻片法）

原理：血型就是红细胞膜上特异抗原的类型。在ABO血型系统中，红细胞膜上抗原分A和B两种抗原，而血清抗体分抗A和抗B两种抗体。A抗原加抗A抗体或B抗原加抗B抗体，则产生凝集现象。血型鉴定是将受试者的红细胞加入标准A型血清（含有抗B抗体）与标准B型血清（含有抗A抗体）中，观察有无凝集现象，从而测知受试者红细胞膜上有无A或/和B抗原。在ABO血型系统，根据红细胞膜上是否含A、B抗原而分为A、B、AB、O四型。

1.取双凹玻片一块，用干净纱布轻拭使之洁净，在玻片两端用腊笔标明A及B，并分别各滴入A及B标准血清一滴。

2.细胞悬液制备从指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml生理盐水的小试管内，混匀，即得约5％红细胞悬液。采血时应注意先用75％酒精消毒指尖或耳垂。

3.用滴管吸取红细胞悬液，分别各滴一滴于玻片两端的血清上，注意勿使滴管与血清相接触。

4.竹签两头分别混合，搅匀。

5.10～30min后观察结果。如有凝集反应可见到呈红色点状或小片状凝集块浮起。先用肉眼看有无凝集现象，肉眼不易分辨时，则在低倍显微镜下观察，如有凝集反应，可见红细胞聚集成团。

6.判断血型根据被试者红细胞是否被A，B型标准血清所凝集，判断其血型。

（二）鱼类血清中沉降抗体效价的测定

1、实验原理

利用双向琼脂扩散试验，是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中，使两者互相扩散，当扩散到它们的浓度比合适的部位相遇时，就会形成抗原抗体复合物的沉淀。该沉淀在琼脂中可呈现一条乳白色沉淀线。如果抗原和抗体不相对应，则无沉淀线出现。由于沉淀线形成的位置与抗原抗体浓度相关，抗原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远；同样，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距抗体孔越远。据此，固定抗原浓度，稀释抗体，可测定抗体的效价。

2、实验步骤

①称取1.5g琼脂粉，溶解于100mlPBS缓冲液中，加热溶解，配制1.5%的琼脂

②将盛有琼脂的锥形瓶置于水浴中，保持溶解状态

③吸取溶化好的琼脂3ml倾注于载玻片上（载玻片应放水平）

④待琼脂凝固，按模板打孔，用大头针挑出孔内的琼脂，中心孔为抗原孔，四周孔为抗体孔。打孔后将玻片于酒精灯上烘烤背面（温度不宜过高，以不烫手为宜），使琼脂与玻片紧贴。

⑤将抗血清和生理盐水间隔加入图1的6孔，中心孔加抗原（脂多糖LPS悬液，以

孔内溶液不溢出为宜）。

（三）鱼类常见免疫细胞的分离和鉴定

1、实验原理

鱼体中的免疫细胞是参与机体天然免疫的重要免疫细胞，当病菌入侵机体后，它能迅速地穿过血管壁，游至病菌入侵部位并发挥其免疫功能。头肾中含有大量的免疫细胞，如单核巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T/B淋巴细胞、嗜酸/碱性细胞等。

2、实验步骤

方法一：试验鱼先用浓度为150mg/L MS-222深度麻醉，放入解剖盘内，喷75%的酒精消毒，放入无菌操作台中，采用尾椎放血，解剖鱼体，找到头肾，将头肾分离后，放入培养皿中，用生理盐水或PBS缓冲液将血液冲洗掉，将头肾放在另一个干净的培养皿中的100目钢网上，用注射器的橡胶塞小心研磨，将头肾打散成单细胞，一边研磨一边加入PBS，每条鱼大概加入6-7ml，细胞的浓度大概为109个。

方法二：将加有抗凝剂的血液1500转离心10min后，用微量移液器吸取抗凝血中的白细胞层，加入小试管，然后加入50μl金黄色葡萄菌液混匀，放于25℃孵育45min。

将上述任一悬液用微量移液器吸取，滴加一滴于载玻片一端，以另一载玻片小心推成血膜，晾干，甲醇固定5min，自然风干，然后用吉姆萨染液染色30min-1h。观察并鉴别鱼类主要的免疫细胞类型（如单核巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T\B淋巴细胞、嗜酸/碱性细胞等）

（四）鱼类血清中溶解酶物质活性的测定

1、实验原理

溶菌酶属于乙酰氨基多糖酶，能裂解革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖分子的β-1，4糖苷键，而革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖外有一层脂蛋白和脂多糖，所以不直接受溶菌酶影响。溶菌酶来源于吞噬细胞的溶酶体，广泛存在于泪液、唾液、和血清等处。溶菌酶活性可通过检查其对指定敏感菌株裂解作用来进行测定。测定方法有光学测定法和平板打孔测定法等。平板打孔测定法是在混有菌液的琼脂凝胶上打孔，检品放在孔内，一定时间后测量溶菌环的直径，根据溶菌环的大小来推知溶菌酶的含量。

2、实验步骤

①将加热溶化的琼脂倾注于培养皿内，厚度为2-3mm；

②待琼脂凝固后，加金黄色葡萄球菌液50-100μl并涂布均匀。按模板打孔，用大头针挑出孔内的琼脂，在孔内加入血清，1，2号孔在酒精灯上灭活。将培养皿放于湿盒上，25℃培育15-18h。

③培育后取出培养皿，观察溶菌环的大小。