免疫实验设计

一、课题名称：细胞因子诱导的杀伤细胞对淋巴瘤荷瘤鼠的抗肿瘤作用的研究
二、立题依据：
恶性肿瘤是危害人类健康的严重的疾病之一，近年来恶性肿瘤的发病率呈逐渐上升趋势。

随着分子生物学研究的不断深入和综合治疗方法的不断完善，肿瘤的诊治水平得到了很大的提高。

目前，生物治疗已成为继手术、化疗及放疗之外的第四种治疗肿瘤的手段，是目前研究肿瘤治疗的热点之一。

迄今为止，CIK 细胞对淋巴瘤细胞株体外研究的报道较多，但对荷瘤鼠的体内研究及 CIK 细胞对肿瘤血管生成的影响研究较少。

三、实验目的：
细胞因子诱导的杀伤细胞是一种异质细胞群，从外周血、骨髓或脐带血中分离出的单个核细胞在多种刺激因子（IL-2、IL-1、IFN-γ、抗 CD3 单克隆抗体）作用下,经过一定时间的培养而获得的一种免疫活性细胞。

CIK 细胞同时具有 T 细胞的抗肿瘤活性和 NK 细胞的非 MHC 限制性杀瘤的特点。

因其在体外扩增速度快，杀伤活性高，杀瘤谱广，不良反应少，可提高患者的免疫功能，消除微小残留，被认为是抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

本实验通过应用 CIK 细胞治疗淋巴瘤荷瘤鼠，应用免疫组化法比较治疗组与对照组的淋巴瘤组织的VEGF、MVD 的差异，探索 CIK 细胞抗肿瘤的新机制，为 CIK 细胞在儿童淋巴瘤的临床应用提供依据。

四、实验对象：
淋巴瘤荷瘤鼠。

建立淋巴瘤荷瘤鼠并分组：在 Balb/c-nu/nu 裸鼠左上肢肩胛处皮下接种 T 细胞淋巴瘤 Jurkat 细胞 1.2×108/ml，0.2ml/只。

建立淋巴瘤荷瘤鼠模型。

待裸鼠成瘤后，随机分为两组，每组 5 只，治疗组予瘤旁注射体外培养 2 周的 CIK 细胞 3×107/ml，0.2ml/只，对照组予瘤旁注射 0.2ml 的生理盐水，隔日注射 1 次，连续注射 3 次。

五、实验材料:
1.试剂及仪器：RPMI-1640 培养基、胎牛血清、二甲基亚砜、注射用链霉素、基因重组人IL-2、鼠抗人CD3Mcab、基因重组人INF-γ、人淋巴细胞分离液、兔抗人VEGF多克隆抗体、兔抗人vWF因子相关抗原抗体、生物素标记抗兔IgG 抗体、DAB显色液检测试剂盒、SP检测试剂盒。

2.实验动物：实验动物为Balb/c-nu/nu裸小鼠，雄性，3-4周龄，体重14-16g，实验鼠饲养于无特定病原体动物（SPF）环境下，室内定期进行紫外线照射，
鼠笼，饮水，垫料，饲料均高压消毒。

六、实验方法及步骤:
1.肿瘤细胞的培养及传代
将Jurkat细胞常规培养于含10%的灭活胎牛血清（FBS），100U /ml的青霉素，100μg/ml的链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，每2~3天传代一次，调整细胞浓度约5×106/ml，取对数生长期细胞进行实验。

2.CIK细胞的制备及体外扩增
取健康人的外周血50ml，用肝素抗凝，加入等体积无血清培养基混匀后，小心加于 50 ml淋巴细胞分离液的液面上，保持液平分离液面2500r/min离心30 min，收集第二层细胞，用无血清培养基洗涤2次后即得外周血单个核细胞，细胞被重悬并保存于RPMI-1640，10%人血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100ug/ml 链霉素，50umol/L 2-巯基乙醇组成的培养液中，第l天加入INF-γ2000U/ml，置于 37 ℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养 24 h，然后加CD3Mcab 59/ml，rhlL-2 1000U/ml，继续培养，每3天半量换液，同时补加rhIL-2 1000 U/ml，调整细胞密度为1×106 ／ml，第l4天获取细胞。

3.建立淋巴瘤荷瘤鼠模型并分组
将Jurkat细胞离心、计数，用PRMI-1640培养基将细胞重悬，Balb/c-nu/nu 裸小鼠左上肢肩胛处皮下接种T细胞淋巴瘤 Jurkat 细胞1.2×108/ml，0.2ml/只。

建立淋巴瘤荷瘤鼠模型。

待裸鼠成瘤后，建立淋巴瘤裸鼠模型。

制模后第5天接种部位出现结节，其质地较硬，活动，认定成瘤。

第3周时将荷瘤鼠按随机数字表随机分为两组(各5只)，对照组与CIK细胞治疗组，两组荷瘤鼠分别于第1、3、5 天瘤旁注射生理盐水、 CIK细胞共三次。

4.杀鼠取瘤
治疗2周后将荷瘤鼠颈椎脱位法处死，完整的剥离肿瘤组织，用游标卡尺测量肿瘤的长短径，按公式(体积=长径×短径2/2)计算肿瘤体积大小。

计算肿瘤生长抑制率。

抑瘤率(％)=〔1-实验组肿瘤重量(或体积)/对照组肿瘤重量(或体
积)〕×100％。

5.肿瘤组织行免疫组化S-P法
取对照组、实验组的肿瘤组织标本，10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，进行常规病理切片，采用S-P法进行免疫组化染色。

七、预期结果及结论:
1.预期结果：
实验组淋巴瘤荷瘤鼠的肿瘤体积明显小于对照组；免疫组化结果显示，经过CIK细胞治疗后，淋巴瘤组织中的VEGF表达减少对照组相比，实验组淋巴瘤组织中的新生血管明显减少；与对照组相比，实验组淋巴瘤组织中的血管内皮生长因子与微血管密度的表达均降低， CIK细胞可以通过减少肿瘤细胞分泌VEGF，进而减少肿瘤组织新生血管的形成，从而影响肿瘤细胞的营养供应，阻止肿瘤的生长。

另外我们可以推断出，肿瘤组织新生血管的减少，进而也可减少肿瘤细胞的远处转移。

2.预期结论：
CIK细胞对淋巴瘤荷瘤鼠的移植瘤的生长具有抑制作用。

CIK细胞对淋巴瘤荷瘤鼠的移植瘤的抑制作用可能与减少肿瘤的血管内皮生长因子分泌及新生血管数量有关。

血管内皮生长因子与微血管密度呈正相关线性关系，血管内皮生长因子是血管新生的一个重要因素。

同时杨波等研究CIK细胞对人原发性胃恶性淋巴瘤的生长及肝转移的抑制作用，结果显示，在相同的剂量下，胃淋巴瘤患者来源的CIK细胞对移植瘤的生长抑制及肝转移的抑制作用最显著。

八、实验可行性分析:
本实验首先建立淋巴瘤荷瘤鼠模型，然后比较 CIK 细胞治疗组与空白对照组的瘤体大小的差异，并比较两组肿瘤细胞表达的血管内皮生长因子及肿瘤组织的微血管密度的差异，研究观察 CIK 细胞对淋巴瘤生长的抑制作用，为CIK 细胞在儿童淋巴瘤的临床应用提供依据。

但是因实验条件的限制，本实验中荷瘤鼠数量偏少，CIK细胞应用周期短，CIK细胞试验组没有进一步分不同剂量组进行实验分析，需进一步扩大研究数量并深入研究。

目前对于CIK细胞治疗淋巴瘤机制的研究还没有大规模的样本，本次试验结果还不能作为一种完全确定的结论，但可以作为日后有关工作的参考。

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