病毒分离前样品的实验室处理方法
病毒标本实验室管理制度
病毒标本实验室管理制度一、目的和范围为了做好病毒标本实验室管理，保障工作人员的安全和病毒标本的安全，提高实验室工作效率，特制定本管理制度。
本制度适用于所有从事病毒标本实验室工作的人员。
二、安全管理1. 实验室内部安全（1）实验室内部应按照规范进行分区，分别设置样本处理区、核酸提取区、实验操作区和贮存区。
（2）实验室内部应有防护设施和设备，包括生化安全柜、生物安全柜、紫外线消毒灯等。
（3）实验室内部应配备必要的个人防护用具，如防护服、口罩、手套等。
（4）实验室内部应定期进行消毒和清洁。
2. 实验室外部安全（1）实验室外部应设置警示标识，禁止未经许可的人员进入。
（2）实验室外部应设有安全监控设备，实时监测实验室内部情况。
（3）实验室外部应定期进行除草和除害虫工作，保持实验室周围环境清洁。
三、人员管理1. 人员培训（1）所有从事病毒标本实验室工作的人员必须接受相关的安全培训。
（2）新员工入职时应进行入职培训，包括实验室安全规定、应急处理办法等。
2. 人员健康管理（1）实验室工作人员应定期进行健康检查，保障自身健康状况。
（2）实验室工作人员应有规范的工作服着装要求，保持良好的个人卫生习惯。
3. 人员监管（1）实验室工作人员应按规定佩戴个人防护用具，配合进行工作。
（2）实验室内部应设置监控设备，对工作人员的工作行为进行监控。
四、标本管理1. 样本采集（1）样本采集应按照规范操作流程进行，避免样本交叉污染。
（2）样本采集完成后，应及时进行标本传输和贮存。
2. 样本存储（1）存储区域应按照样本种类和存储期限进行分类，保证存储环境干净整洁。
（2）存储区域应定期进行消毒和清洁工作，保障存储区域的清洁。
（3）存储区域应设置防火、防水设备，保障存储区域的安全。
3. 标本处置（1）标本处置应按照规范操作流程进行，做好标本处置记录。
（2）标本处置应遵守相关的废弃物处理规定，保护环境。
五、设备管理1. 设备维护（1）设备维护应按照规定进行，定期进行设备保养和检查。
样品的采集和处理
第一章样品的采集和处理1范围本章规定了用于人免疫缺陷病毒（HIV）检测的全血、血清、血浆、细胞、唾液、尿液以及滤纸干血斑（DBS）样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体检测、抗原检测、核酸检测、耐药检测,CD4+和CD8+T淋巴细胞测定和HIV分离培养。
2规范性引用文件《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》中华人民共和国卫生行业标准WS293-2008《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南（试行）》（中国疾病预防控制中心，2006年2月）《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南（试行）》（中国疾病预防控制中心，2008年2月）Guidelines for Using HIV Testing Technologies in Surveillance WHO/CDS/CSR/EDC/2008《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》，卫生部第45号令2006年2月1日3样品种类及相应的用途3.1全血、血清、血浆、唾液、尿液以及DBS样品可用于HIV抗体检测。
3.2抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定。
3.3血浆可用于HIV-1病毒载量、基因型及耐药检测。
DBS样品可用于HIV-1基因型及耐药检测。
3.4全血、血浆、淋巴细胞富集液、外周血淋巴细胞（PBMC）及DBS样品可用于HIV核酸的定性检测。
3.5PBMC、全血、淋巴细胞富集液等可用于HIV-1分离培养。
4操作步骤4.1采样前准备根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采血技术规范的要求操作，遵守生物安全要求（参见本规范第八章实验室生物安全）。
要检查所需物品是否已备齐，是否在有效期内，有无破损，是否足量，特别应检查受检者信息与样品容器表面的标记是否一致，并注明样品采集时间。
选择合适的室内（外）采血空间，受检者坐（卧）于合适的位置，准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废弃物容器等。
人禽流感标本采集、运送、处理及保存的操作规程
人禽流感标本的采集、运送、处理及保存操作规程一、目的规范人禽流感标本的采集、运送、处理及保存操作。
二、适用范围本操作规程适用于人禽流感标本的采集、运送、处理及保存。
三、简介人禽流感检测过程中，采集的标本包括鼻咽拭子、漱口液、血液等。
本实验室一般用鼻咽拭子或漱口液进行病毒分离与分子生物学检测，血清用于人禽流感抗体检测，采集血液部位一般位于前臂肘静脉。
四、器材1、用于血液收集的基本耗材包括：医用（5ml和10ml）一次性注射器、一次性乳胶手套、止血带、碘酒、无菌拭子、血清储藏管、标本标签、创可贴、可封口塑料袋、标本采集表格、带有冰袋的冰壶、棉拭子、污物桶、笔、试管架。
2、用于鼻咽拭子、漱口液等收集的基本耗材包括：一次性乳胶手套、防护服、十二层口罩（或N95口罩）、采样无菌棉签、采样液（螺口塑料管装）、可封口塑料袋、带有冰袋的冰壶、污物桶、样品登记表、笔、试管架。
附：血清保存管：2 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）；鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）；尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；记号笔：油性，防水。
五、人禽流感标本采集操作规程（一）标本采集要求1．采样人员须以无菌操作采集各类标本。
采集标本所使用的容器、采样液等均应无菌。
编制：福建省疾控中心病毒性疾病防治科审核：沈晓娜批准：严延生2. 每份标本必须标明标本编号、标本种类及采集日期。
采集单位应指定专人负责标本的登记、收集和管理，并认真填写“人禽流感标本采集登记表。
”3.所有标本的收集、运输和保藏都应装在有螺旋盖的塑料管中，以防止开、关标本管时产生气溶胶，并用两层清洁塑料袋包裹严实。
4.采集的标本应立即送当地疾病预防控制机构，同时附上标本送检单。
如不能立即送交，可置-20℃以下冰箱短暂保存（24小时之内）。
（二）标本采集种类与方法标本采集的时间、位置及质量对能否分离到病毒或提取到有活性的RNA至关重要，而标本保存与运输不当，也会影响病毒的分离。
流感病毒分离标准操作规程
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
样品的接收、登记和处理操作规范
样品的接收、登记和处理操作规范1、目的规范艾滋病病毒（HIV ）检测的血清、血浆和全血样品的采集和处理，确保HIV 抗原、抗体、核酸检测、CD 4+/CD 8+T 淋巴细胞测定和HIV 分离培养。
2、适用范围艾滋病病毒（HIV ）检测的血清、血浆和全血样品的采集和处理3、职责3.1 实验室工作人员：应熟知并遵守本SOP ，掌握艾滋病病毒（HIV ）检测样品的采集、运送、处理、接收与登记。
4 、操作步骤4.1样品的采集和处理艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。
唾液或尿液有时也可作为测试样品。
常用的血液样品的采集和处理方法如下：4.1.1血清样品采集和处理4.1.1.1用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量静脉血，室温下自然放置1~2h ，待血液凝固、血块收缩后再用3、000r/min 离心15min ，吸出血清备用。
4.1.1.2如用滤纸片采样，则手指或耳垂局部严格按常规进行消毒，在刺破皮肤后，迅速把滤纸片沾上，切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。
采血后要待血样干燥后再包装送检。
4.1.2抗凝血样品采集和处理4.1.2.1用加有抗凝剂的真空采血管（或一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。
4.1.2.2应根据实验要求选用适当的抗凝剂，如CD 4+/CD 8+T 淋巴细胞测定可选用K 3EDTA 或肝素或枸橼酸钠，HIV 病毒分离、核酸定性/定量检测可选用K 3EDTA 或枸橼酸钠。
4.1.2.3 用于核酸定性检测时，采集的抗凝全血应在4~8h 内分离PBMC 和血浆，否则应在24~48h 内分离血浆和血细胞。
病毒载量测定不同方法对样品的要求见第四章4.1中表2；CD 4+/CD 8+T 淋巴细胞测定样品采集要求见第五章4.1。
4.1.3采集样品注意事项4.1.3.1采集样品原则上应按临床采血技术规范操作（试剂盒说明书有特殊要求除外）。
4.1.3.1采集样品时应注意安全，建议采用真空采血管及蝶形针具，以避免直接接触血液；直接接触HIV感染者/艾滋病（AIDS）病人血液/体液的操作,应戴双层手套。
HIV实验室检测方法和步骤
HIV实验室检测方法和步骤HIV，也称为人类免疫缺陷病毒，是一种能导致艾滋病的病毒。
HIV实验室检测方法和步骤被广泛应用于检测感染HIV的个体。
以下是一般情况下使用的实验室检测方法和步骤的详细说明。
1.预处理和登记在进行HIV实验室检测之前，需要对样本进行预处理和登记。
预处理包括标识样本的相关信息，如样本编号和患者信息。
这些信息对于结果记录和跟踪是至关重要的。
此外，还需检查样本的适应性和完整性。
2.血液样本采集3.血清分离采集到的血液样本需要进行血清分离。
这可以通过离心来分离血液的不同成分，例如血红蛋白和血清。
离心速度和时间需要根据实验室设备和协议进行调整。
4.酶联免疫吸附测定法（ELISA）最常用的HIV实验室检测方法是酶联免疫吸附测定法（ELISA）。
这种方法使用特定的抗体来检测血液中特定的抗原。
根据ELISA方法的不同，可检测HIV抗原或抗体。
实验室技术人员将患者血清样本加入到已包含HIV相关抗原或抗体的试剂盘中，然后根据试剂盘的建议操作，包括孵育时间、温度和洗涤步骤。
任何与接触抗原或抗体反应的特异性颜色改变，都可作为阳性结果。
否则，结果被视为阴性。
5.确认试验在进行HIV检测的初步结果后，通常会进行一个或多个确认试验。
确认试验的目的是统一确定检测结果的可靠性。
常用的确认试验包括HIV免疫荧光试验（IFA）和西方印迹法（Western blot）。
这些试验通过检测血清中的HIV特异性抗体，以确保先前的结果的准确性。
6.分子检测有时，为了获得更加可靠和敏感的结果，实验室会使用分子检测方法，例如聚合酶链式反应（PCR）。
PCR可以检测和放大病毒的基因或核酸，以确定HIV感染的存在和病毒的数量。
7.结果解读和记录HIV实验室检测结束后，实验室技术人员需要解读并记录结果。
阳性结果意味着存在HIV感染，而阴性结果则表示未检测到HIV感染。
针对不同的检测方法和样本类型，结果的解释可能有所不同。
因此，在结果解读和记录时，实验室人员需要严密遵循实验室的标准操作规程（SOP）。
HIV病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程
HIV病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程1. 标本采集1.1 采集过程- 标本采集应由经过相应培训的医务人员进行。
- 采集前应充分向受检者解释采集过程，并获得其知情同意。
- 采集时应采取严格的无菌操作，以避免污染。
- 一般采集静脉全血样本，采集量不少于5ml。
1.2 标本处理- 采集后的标本应尽快送至实验室，避免暴露时间过长。
- 采用专用的血液收集管，确保标本完整无漏。
- 标本送至实验室前，应妥善保存并严禁摇晃。
2. 送检流程2.1 标签标识- 标本送检前，应在采集管上粘贴完整、清晰的条码标签，以确保标本追踪可靠性。
2.2 填写送检单- 标本送检时，应填写完整的送检单，包括受检者个人信息、采集时间、送检目的等相关信息。
2.3 送检方式- 送检可选择邮寄或快递方式，确保标本能够安全送达实验室。
- 快递包装需符合相关规定，避免标本在运输过程中受损。
3. 处理流程3.1 标本分离- 实验室接收标本后，应立即进行核酸分离，以保证分析的准确性。
3.2 核酸提取- 将分离的标本进行核酸提取，提取后的核酸可用于后续的检测操作。
3.3 核酸检测- 采用合适的核酸检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）等，对提取的核酸进行检测。
3.4 结果解读- 核酸检测结果应由经验丰富的专业人员进行解读，并做出相应的结果报告。
4. 结论本文档简要介绍了HIV病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程。
标本采集要求医务人员进行，并在采集前向受检者解释采集过程。
送检时需填写完整的送检单，并确保标本的追踪可靠性。
实验室应迅速进行标本分离、核酸提取和核酸检测，并由专业人员进行结果解读。
以上流程的规范实施可提高HIV病毒核酸检测的准确性和可靠性。
新冠病毒样本采集和检测技术指南
附件 10新冠病毒样本采集和检测技术指南为指导各级疾控部门和其他相关机构规范开展新冠肺炎病例标本采集与实验室检测工作，保证检测质量，提高检测效率，特制定本指南。
一、标本采集（一）采集对象。
新冠肺炎病例、可疑感染人员和其他需要进行检测的人员，以及可能被污染的环境或物品等。
（二）采样人员基本要求。
从事标本采集的技术人员应当经过生物安全、监测技术培训并合格，熟悉标本采集方法，熟练掌握标本采集操作流程。
应严格按照操作流程进行采样，按要求做好标本信息记录，确保标本质量符合要求、标本及相关信息可追溯。
（三）标本采集基本要求。
1.住院病例的标本由所在医院的医护人员采集，密切接触者标本由当地指定的疾控机构、医疗机构负责采集。
采集标本时，要根据不同采集对象设置不同的采样区域，发热患者前往发热门诊就诊、采样，未设置发热门诊的机构应设置发热患者专用采样区域，将发热患者与其他检测人群分区采样，避免交叉感染。
2.无症状感染者、入境人员、密切接触者在隔离观察期间应采集鼻咽拭子进行核酸检测，解除隔离时应同时采集 2 份鼻咽拭子样本，分别使用不同核酸检测试剂检测，2次检测原则上由不同检测机构开展。
3.根据临床及实验室检测工作的需要，可在住院、隔离期间多次采样，可同时采集呼吸道、血液、便等多种标本。
采样人员应严格遵循采样规范采集标本，保障所采集标本质量符合要求，同时应详细记录受检者信息，可利用条形码扫描等信息化手段采集相关信息。
4.人群筛查应根据核酸提取、检测所用试剂的要求确定采样管，可选择含病毒灭活剂（胍盐或表面活性剂等）的采样管。
用于病毒分离的标本应放置于不含有病毒灭活剂的采样管。
5.物品和环境监测应根据监测目的和防控需求，确定采样物品、位置与数量，采样时应严格遵循采样规范。
（四）采集标本种类。
每个病例必须采集急性期呼吸道标本（包括上呼吸道标本或下呼吸道标本），重症病例优先采集下呼吸道标本；根据临床需要可留取便标本、全血标本、血清标本和尿标本。
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病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。
病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。
病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。
(一) 组织器官样品的处理
1.用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂研磨或用组织捣碎机
制成匀浆，随后加1-2 ml Hank’s平衡盐溶液制成组织悬液，再加1-2 ml继续研磨，逐渐制成10%-20%的悬液；
2.加入复合抗生素；
3.以800×g离心15min；
4.取上清液用于病毒分离。
必要时可用有机溶剂去除杂蛋白和进行浓缩（见下文）。
(二) 粪便样品的处理
1.加4g的粪便于16ml Hank’s平衡盐容液中制成20%的悬液；
2.于密闭的容器中强烈振荡30min，如果可能则加入玻璃球；
3.以6000×g低温离心30min，取上清液再次重复离心；
4.用450nm的微孔滤膜过滤；
5.加二倍浓度的复合抗生素。
然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。
(三) 无菌的体液（腹水、脊髓液、脱纤血液、水泡液等）和鸡胚液样品可不做处理，直接用于病毒分离。
注：Hank’s平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制。
(四) 样品的特殊除菌处理样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。
1.乙醚除菌对有些病毒（如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、小RNA
病毒等对乙醚有抵抗力）可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4℃过液。
取用下层水相分离病毒。
2.染料普鲁黄（Proflavin）除菌由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响，
常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。
将样品用0.0001mol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min，随后用离子交换树脂除去染料，将样品暴露于白光下，即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。
3. 过滤除菌可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或者200nm孔径的混合纤维素
酯微孔滤膜等除菌，但对病毒有损失。
4. 离心除菌用低温高速离心机以1800r/min（1
5.24cm）离心20min，可沉淀除
去细菌，而病毒（小于100nm）保持在清液中。
必要时转移离心管重复离心一次。
(五) 待检样品中病毒的浓缩对病毒含量很少的病毒样品一般普通方法不易检测或分离出
病毒，必须经过浓缩。
常用浓缩方法如下：
1.聚乙二醇（PEG）浓缩法将分子量6 000的PEG逐步加入经一般处理的样品
溶液中，使终浓度为8%，置4℃过夜。
以3000×g离心15min，用少量含复合抗生素的Hank’s 平衡盐溶液重悬，心要时用450nm微孔滤器除去真菌孢子。
2.硫酸铵浓缩法将等量饱和硫酸铵溶液缓慢加入经过上述一般处理的样品溶液
中边加边搅拌，置4C过夜。
离心同上。
3.超滤器浓缩法是一种高效率的浓缩法，特别适合大体积的样品浓缩。
4.超速离心浓缩法以40 000r/min（1
5.24cm）离心60-120min ,绝大多数病毒将沉
于管底。
用少量Hank’s平衡盐溶液悬浮病毒。
这种方法回收效率很高，但仅适用于小体积的样品。
(六) 病毒分离样品脂类物质的去除有些病毒样品（如组织样品）脂类和非病毒蛋白含量很
高，必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂抽提。
常用的有机溶剂有正丁醇、三氯乙烯、氟里昂等。
方法是将预冷的等量有机溶剂对半加入样品中，强烈振荡后，1000×g离心5 min，脂类和大量非病毒蛋白将保留在有机相中，病毒保留在水相中。
应当注意的是，病毒必须对这些有机溶剂有抗性。