原生质体的培养与融合
第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合
4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融
合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合 亲株。 6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
融合过程中细胞膜变化
类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合
都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型 或抗药性等
2、原生质体融合的方法
物理法、化学法及生物法 。
原理 增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法
在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子， 彼此靠近，定向排列成串球状。
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。 膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
原理与过程
灭活后的病毒颗粒结合到原 生质体表面。两受体细胞开 始凝聚。 两细胞的膜紧密结合。病毒 被膜与受体细胞的浆膜融合 。病毒颗粒周围的膜脱离整 个膜，产生破口，在两细胞 间形成细胞质通道（37℃下 1-2min），通道继续扩大， 病毒颗粒流入细胞质内，细 胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。
特点
研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法
包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为 H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后 引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发 生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻
修改第八章原生质体培养和融合
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使用的酶主要有： 纤维素酶(Cellulase)、 果胶酶(Pectolyase)、 离析酶(Macerozyme )、 半纤维素酶(Hemicellulase) 崩溃酶(Driselase)， 其中纤维素酶和果胶酶是最必要的。
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酶液中的渗透压是原生体分离的另一个因素，植物细 胞去壁后，必须由合适的渗透压替代细胞壁维持的机械压力， 酶液中的渗透压过低会使细胞吸涨而破裂；渗透压过高，细 胞除受到渗透压力而破裂外，还会损害细胞生长代谢 。
培养基，将适当密度的原生质体悬浮液加在含琼脂的培养基上。 液层较浅，有利于通气，而且固体培养基中的养分可以释放到 液层中去，以补充培养物对养分的消耗。另外培养物中的代谢 产物对原生质体的生长不利，可以为固体层所吸收，降低或消 除毒害。
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13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
原生质体纯化(以柑桔原生质体为例，界面法)
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果胶酶和 纤维素酶
过滤、离心
原生质体制备流程（以叶片为例）图
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第二节 原生质体的培养
一、原生质体培养的方法 1. 液体培养
培养基中不加凝固剂，仅仅用液体培养基按所需植板密度重悬 原生质体后，直接植板在培养皿中即可。 液体浅层培养法是目前 原生质体培养中广泛应用的方法之一。 优点：操作简便，对原生质体伤害小，有利于通气。 缺点：容易使原生质体互相粘连、聚集，导致原生质体损坏；并且 难于定点观察监测单个原生质体的发育过程。
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***沉降法：利用密度不同沉降速率不同的原理，低速离心使 原生质体沉于离心管底。此法方便，但不易除尽一些完整的 细胞或破碎的原生质体。 ***界面法利用原生质体和破碎细胞比重不同，低速离心条件 下完整的原生质体漂浮于密度不同的两相分界处，碎片留在 低层相中，可从两相界面收集到高纯度原生质体。
植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合
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第 七 章 植物原生质体培养及细胞融合
陈传红 制作 2007 / 5
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本章内容提要： 原生质体培养的发展与意义 原生质体的分离 原生质体的培养 植物细胞的融合 体细胞杂种鉴定方法
1975年柑桔原生质体培养成功；
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现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木本植物中柑桔最为成功。
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陈传红 制作 2007 / 5
番茄+马铃薯？
陈传红 制作 2007 / 5
3、融合方法
01
02
1、机械分离（Machanical isolation）
Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell.
高度液泡化的细胞
陈传红 制作 2007 / 5
2、 酶解分离（Enzymatic isolation）
双子叶外植体/培养细胞
单子叶植物胚性细胞
2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。
单击添加副标题
清新立春时节
什么是原生质体（Protoplast）？
1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
原生质体融合技术
原生质体融合技术的局限性植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。
这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。
植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。
它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。
通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。
原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。
在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。
因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。
但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。
为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。
1.技术局限性植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。
由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。
因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。
其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
草地早熟禾原生质体培养与融合_赵小强
体， 进行了原生质体培养 ； 利用 PEG 融合法对 Midnight Ⅱ 和 Nuglade 的原生质体进行了 融 合 ， 获得了体 酶解时间 、 愈伤组织继代时间和渗透压对草地早熟禾原生质 细胞杂种愈伤组织 。 研究了不同酶液组成 、 体游离及生长的影响 ； 预处理对亲本原生质体活力的影响和适宜的融合条件 。 结果表明 ： 采用继代培养 8 ～ 10d 的胚性愈伤组织 ， 在 1. 0% 纤维素酶 + 1. 0% 离 析 酶 + 0. 5% 果 胶 酶 + 0. 3% 崩 溃 酶 条 件 下 ， 酶解 14 ～ 17h 可得到产量和活力较高的原生质体 ； 原生质体在 KM 8 P 培养基中培养 3d 后出现第 1 次细胞分 2 ～ 3 周后形成小细胞团 ， 此时添换低渗培养基 2 ～ 3 次 ， 有利于小细胞团持续分裂并形成愈伤组织 ； 裂， 试验获得了草地早熟禾品种 Rugby Ⅱ 原生质体来源的愈伤组织 ； 5mmol / ml 碘乙酰胺处理 Nuglade 原生 能有效地使 Nuglade 和 Midnight Ⅱ 原 生 质体 10min 及 40 μ g / ml 罗丹明处理 Midnight Ⅱ 原生质体 5min ， 质体失活 ； 两品种融合 PEG （ 6000 ） 适宜浓度 35% ， 融合率为 9. 8% 。
Abstract ： The friable calli induced from mature seeds of Rugby Ⅱ （ Poa pratensis L. ） were used for protoplast preparation ，and the protoplasts were isolated through enzyme digestion and were cultured. Midnight Ⅱ protoplasts and Nuglade prtoplasts of Poa pratensis L. by ployethylene glycol （ PEG ） method was fused ，and callus had been induced. The effects of different composition of enzyme ，time of enzyme digestion ，calli age and osmoticum on protoplast isolation and the effects of pretreatment and the optimal fusion condition on the activity of protoplasts were studied. The results showed that highter yields and activities of protoplasts were obtained from embryogenic calli 8 to 10d with 1. 0% cellulase Onozuka R10 ，1. 0% macerozymeR10 ，0. 3% driselase ，0. 5% pectolase Y23 and 14 ～ 17h of enzyme digestion. The first divisions occurred in 3 d and small cell clusters could be seen after 2 to 3 weeks in the culture. At this moment ，the addition of the protoplast culture medium with 0. 1 ～ 0. 2mol / L mannitol 2 or 3 times was needed for
原生质体融合育种
（二）原生质体融合的影响因素 １、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合 钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线
热 药物
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种 三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒
第一节 微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等
第二节 微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并产生重组子的过程。
细菌原生质体融合步骤
细菌原生质体融合实验步骤一、实验目的了解原生质体融合技术的原理。
学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。
二、实验原理原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。
1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。
由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。
(一)、原生质体融合的优点(1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。
由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。
(2)、基因重组频率高，重组类型多。
原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。
原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。
(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。
(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。
(二)、原生质体融合步骤(1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。
(2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。
(3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。
聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。
在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。
(4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。
(5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。
(6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。
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4-2、细胞学观察
染色体形态和数目的比较
APD带型 （随机扩增的多态性DNA）
PEG法示意图
-- + + 桥梁
-+ +-
PEG被洗掉
+- +-
膜接触
+- +-
电荷重排
（四）PEG结合高钙-高pH诱导法
最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体---滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH 溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤 数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生 杂合细胞
(五)电融合技术
Senda 首先用此方法实现原生质体融合
细胞融合仪
电融合法原理
交流电场使原生质体表面电荷偶极
化，沿着电极排列，形成串珠。
负极
-
--
++
-+ -
++ +
++
-
+
- 正极
施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质 膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。
+ -
+ -+
-
+ -
+
+
-
+ -
+
-
原生质体的融合过程：
三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定
1．互补选择法 2、机械分离杂种细胞法 3. 双荧光标记选择法
3. 双荧光标记选择法
异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色 异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色
四、体细胞杂种植株的鉴定
形态学鉴定 细胞学观察 DNA多态性分析 同工酶分析
4-1、形态学鉴定
镜下有荧光的即为有活性的原生质体。
第二节 原生质体培养
一、培养基
pH 渗透压
碳源 培养基
钙源
氮源 生长物质
二、培养方法
培养方法 液体浅层培养 平板培养法 双层培养法 饲养层培养法
植株再生途径
肉眼可见细胞团
植株
愈伤组织
器官发生途径 胚胎发生途径
第三节 原生质体融合
定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交， 使分离出来的不同亲本的原生质体，在人 工控制条件下，相互融合成一体，形成杂 种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。
步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500-1000r/min，离心5-
6min）。 第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心
沉淀。如此2-3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质
体。
2、漂浮法
➢ 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂 浮在液体的表面。
Polyethylene Glycol（聚乙二醇）
PEG法特点：
融合频率高 可重复性强 诱发融合无特异性 毒性较低
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原 生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体 凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表 面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的 重排导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生 质体的正性电荷部位相连而导致融合。
步骤： 第一步：400目网筛过滤。 第二步：滤液和高渗溶液混合，离心。 第三步：小心吸取上层原生质体，洗涤液重复洗2-3
次。 第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。
3 、 界面法
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其 中一种溶液密度大于原生质体的密度， 另一种溶液小于原生质体的密度。
原生质体融合
一、原生质体融合意义
—克服杂交不亲合 —克服生殖器官败育 —克服多胚现象
番茄+马铃薯
二、融合方法
无机盐诱导融合 高pH-高Ca离子 聚乙二醇(PEG)法 PEG结合高钙-高pH诱导法 电融合技术
(一)无机盐诱导融合: NaNO3法
1972年： Carlson诱导原生质体融合获 得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体 细胞杂种。
（3）分离原生质体
方法有二：
两步分离法
一步分离法
叶肉原生质体分离提纯
图示原生质体分离过程（以叶片为例）
过滤、离心
加果胶酶 和纤维素酶
叶片
愈伤组织
二、 原生质体纯化与活力测定
（一）原生质体纯化
方法三种 离心沉淀法 漂浮法
界面法
1、 离心沉淀法
原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后 原生质体沉于底部。
本章主要内容
原生质体的分离与纯化 原生质体培养 原生质体融合
原生质体（Protoplast）
含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、
具有生活力的裸露细胞。
植物细胞模式图
高尔基体 微丝
叶绿体 线粒体
质膜
液泡
细胞核 内质网 微管 细胞壁
第一节 原生质体分离及纯化
一、原生质体分离
双子叶外植体
胚性细胞
（一）材料来源
NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高。
（二）高pH-高Ca离子法
1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶 液在37℃时，诱发烟草叶肉原 生质体融合。
优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。
（三）PEG法
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
（二） 原生质体活力测定
1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的 细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。
2、染色识别 1）0.1%酚番红染色：有活力的不被染色，死亡
的被染上色。 2）0.025%Evans蓝染色：有活力但受损伤的细
胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微
多数植物分离原生质体的经典材料----叶肉细胞。
禾本科植物： 愈伤组织或悬浮细胞。
（二） 分离方法
机械分离法 酶法分离法
1、机械分离法（Machanical isolation）
优点： （1）能排除酶的有害影响； 缺点： （1）原生质体的产量低； （2）方法繁琐费力； （3）局限性大
2、酶法分离（Enzymatic isolation）
（1）酶的种类
l纤维素酶类（Cellulase） l果胶酶类（Pectolyase） l半纤维素酶类（Hemicellulase） l崩溃酶 l蜗牛酶
（2）酶液的配制
酶的配比及浓 度
果胶酶：浓度不宜超过2%, 纤维素酶(1-2%) 渗透压稳定剂:（500－600mmol/L甘露醇)
渗透压稳定剂 及pH