11.转基因植物技术与制药

– 在已报道的研究中,外源基因所表达的重组抗原 蛋白,大约只占植物中可溶性蛋白的0.01%～ 0.37%;
• 转基因沉默
– 由于外源基因ＤＮＡ的甲基化及基因共抑制等 而使外源基因的表达不稳定.
提高表达水平的一些方法
• 1 优化密码子的使用； • 2 启动子的选择； • 3 对目的基因进行改造与优化（使用植物偏爱密 码子）； • 4 特定调控序列的使用（增强子、内含子使用）； • 5 消除位臵效应（应用核基质结合区以及定点整 合技术）； • 6 外源蛋白的靶向表达（蛋白体、种子中的质体、 叶绿体等）。
3 转基因植物疫苗种类及应用
• 1990年,在转基因烟草中用农杆菌介导转化法表达 出约占烟草蛋白0.02%的变异链球菌表面蛋白 (spaA); • Mason(1992)提出了利用转基因植物生产可食用 疫苗的概念; • 在短短10年左右的时间里,已经有十几种病毒或细 菌的抗原基因在转基因植物中获得表达,且基本保 留了其天然免疫原性。
发展史
• 1989，Hiat首次在Nature发表了转基因植 物疫苗的研究； • 1990年,Curtiss等人在烟草种子中表达了具 抗原性的变异链球菌表面蛋白获得成功。 • 1992年,Ｍason等人在烟草中又表达了乙肝 表面抗原(ＨBsAg); • 至今，有70多篇研究论文发表，有的进入 临床阶段。
报道的植物疫苗主要种类
• (1)细菌疫苗:
– 主要有大肠杆菌热不稳定毒素B亚单位疫苗和 霍乱毒素B亚单位疫苗。
• (2)病毒疫苗:
– 目前研制出的病毒疫苗有乙型肝炎疫苗、免出 血症病毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗、传染性胃肠 炎冠状病毒疫苗、狂犬病病毒疫苗、诺沃克病 毒疫苗、传染性胃肠炎病毒疫苗、呼吸道合胞 病毒疫苗等。
2.1利用植 物生产疫 苗的程序
2.1利用植物生产疫苗的程序
• • • • • • • 疫苗目的基因的克隆; 高效植物表达载体系统的构建; 植物细胞的遗传转化; 受体细胞的组织培养及植株再生; 抗性植株的筛选和分子鉴定; 转化植株栽培及种植; 目标产品的提取、分离和纯化及免疫学实 验等。
2.2 主要表达系统
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end!
世 界 第 一 种 口 服 植 物 疫 苗
2植物疫苗基本原理及方法
• 原理：转基因植物疫苗或植物疫苗是把 植物基因工程技术与机体免疫机理相结合, 生产出能使机体获得特异性抗病能力的疫 苗。
– 动物试验已证实,转基因植物表达的抗原蛋白经 纯化后仍保留了免疫学活性,注入动物体内则能 产生特异性抗体。
• 选择植物偏爱的密码子； • 外源基因的ＡＴ含量和分布与宿主染色体 尽量一致或接近, 防止宿主识别系统对外源 基因的甲基化。
6 展望
• 尽管利用转基因植物生产口服疫苗存在许多问题,其 前景仍是十分美好的; • 对于世界上偏僻落后贫穷的国家和地区的人们、对 动荡不安的发展中国家的人们以及发达国家的穷人 们而言可以通过服用廉价的植物疫苗获得抵抗疾病 的免疫力; • 可以肯定,利用转基因植物生产的食用疫苗将成为人 类防治疾病的又一有力工具。
转基因植物疫苗
主要内容
• 1 转基因植物疫苗的概念及其发展历史 • 2 利用转基因植物生产疫苗的原理及基本 方法 • 3 转基因植物疫苗种类及应用 • 4 转基因植物疫苗的优点 • 5 转基因研究中的问题及解决办法 • 6 展望
1 转基因植物疫苗的概念及其发
展历史
• 转基因植物疫苗：利用基因工程技术，将 病原微生物的抗原编码基因进行克隆重组, 导入植物细胞生成转基因植物,进而表达 产物，它能激发粘膜免疫,使机体产生特 异性抗病能力 。
传统疫苗的成份
5 转基因研究中的问题及解决办法
• • • • • １重组蛋白的表达问题 （主要）； ２重组蛋白的转译后修饰及糖基化问题； ３用于口服时易被消化及其作用机理问题； ４表达产物的提取加工费用问题； ５口服抗原疫苗免疫耐受方面的问题。
重组蛋白的表达问题
• 重组蛋白的表达量低,表达效率不稳定
选择合适启动子
• 双子叶植物：35Ｓ启动子； • 单子叶植物：Actin、Ｕbi启动子； • 特异性启动子
– 种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉 细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱 导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光 诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。
• 复疫苗的优点
• • • • 成本低廉； 疫苗易于口服，安全方便； 口服疫苗比传统疫苗更有效； 它能对真核蛋白质进行准确的翻译后加工 修饰,使三维空间结构更趋于自然状态 ； • 易于存储和分发,无需冷藏设备,可长期随时 供给。
传统疫苗
• 经典疫苗制备的基本过程包括：选择适宜 的培养基或细胞进行茵、毒株大量繁殖， 收集培养物，提纯，半成品捡定，稀释， 分装，成品检定； • 疫苗的基本成分包抗原、佐剂、防腐剂、 稳定剂、灭活剂及其他活性成分。
• (1)稳定的整合表达系统 ：一般以根癌农杆菌环状Ti质粒 上的DNA片断为载体,把编码结构性抗原决定簇参与诱导 保护性免疫应答的病原体DNA序列导入植物细胞内,并整 合到染色体上,整合了外源基因的植物细胞在一定的条件 下长成新植株,这些植株在生长过程中可表达出疫苗,并把 这些性状遗传给子代,形成表达疫苗的植物品系。 • (2)瞬时表达系统 ：主要是利用基因工程植物病毒(如烟草 花叶病毒、豇豆花叶病毒)为载体,将编码疫苗抗原决定簇 基因序列插入植物病毒基因组中,再用此重组病毒感染植 物,抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表 达。
• (3)寄生虫疫苗:
– 李霞等将疟原虫多表位抗原(AWTE)基因与CT-B基因 融合构建植物表达载体转化烟草,经PCR检验证实成功, 经Westernblotting等分析表明特异表达的融合蛋白是 CT-B和AWTE基因的结合,具有二者的抗原活性。
• (4)避孕疫苗:
– 哺乳动物受精过程中精卵结合是具有种属特异性的, 这种特异性是由精子表面的特异蛋白与卵细胞透明带 ZP3糖蛋白通过受体配体模式进行的。Fitchen等将小 鼠ZP3蛋白的一个抗原决定簇融合表达在TMV的衣壳 蛋白中,在感染的植物中产生高水平的融合蛋白,用该 蛋白免疫小鼠,小鼠体内产生了抗ZP3的特异性血清抗 体,能识别ZP3的合成肽。