第三章细胞破碎讲课讲稿
主要内容
3.1 细胞壁的组成与结构 3.2 细胞破碎技术的分类 3.3 常用破碎技术 3.4 破碎技术的发展方向 3.5 破碎率的测定
3.1 细胞壁的组成与结构
微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞
免受机械损伤的功能； 细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控
制胞内外一些物质的交换渗透作用。 细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。
细菌的细胞壁
几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固骨架肽聚糖组 成。
G+细胞壁结构与G-有很大不同。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，
其网结构的致密程度和强度取决于肽聚糖上所存 在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度 大，则网结构就致密。
3.3 常用破碎技术
珠磨法(bead mill)——实验常用 高压匀浆法(High-pressure homogenization)---
大规模细胞破碎的常用方法 超声破碎（Ultrasonication）---主要用于实验室 x-press法 酶溶法——研究较广的一种方法
化学渗透法 其它方法
影响超声波破碎效率的参数:
(1)、振幅 振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的Байду номын сангаас速度
k。 (2)、细胞悬浮液的粘度 粘度影响能耗并会抑制空穴现象。
(3)、表面张力 添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质
(如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。 因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性
此法称为X—Press法或Hughes press法，主要 用于实验室中。
影响因素： 高浓度的细胞、低温、高的平均压力能促进破碎。
优缺点： 适用范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低、 活性保留率高，但是，该法对冷冻—融解敏感的 生化物质不适用。
和空穴清除，特别是应用高的功率时。 (4)、被处理悬浮液的体积 大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。
(5)、珠粒的体积和直径 添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴
的形成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，从 而提高破碎效率。 在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，k 存在最大值。
浓度及菌种类型等因素有关。
超声破碎的适用性：
细胞种类：杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细 胞比革兰氏阳性细胞较易破碎，对酵母菌的效果 较差。
超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常在 冷却条件下进行。小规模实验常采用间歇操作， 大规模生产受限制。
超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性 物质失活，因而有一定的局限性。
（inclusion body）。
大、中、小型高压匀浆器
超声破碎
（Ultrasonication）---主要用于实验室 破碎机理：可能与空化现象（Cavitation
phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。 通常采用的超声破碎机在15～25KHz的频率下操
作。 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞
西德生产的容量20L的LM-20型珠磨机
胶体磨
德国进口珠磨机
除磨室以夹套冷却外，搅拌轴和圆盘也可以冷却， 圆盘交错地装在轴上，一种处于径向，另一种和 轴倾斜，径向圆盘使磨料沿径向运动，而倾斜圆 盘使产生铀内运动。这种交错的运动，提高了破 碎效率。
细胞破碎率可用一级反应动力学表示： 间歇操作： ln[1/(1-R)]=Kt 连续操作： ln[1/(1-R)]=Kτ 其中τ=V/F
酵母菌的细胞壁
主要成分：葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比 革兰氏阳性菌稍厚，面包酵母的细胞壁厚度约为 70 nm，而且其厚度随菌龄增加而增加。有可能 仅有一部分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重 要作用。
结构：最里层是由葡聚糖的 细纤维组成，它构成了细胞 壁的刚性骨架，使细胞具有 一定的形状，中间是一层糖 蛋白，再外面是网状结构的 甘露聚糖。
珠磨法
bead mill——实验常用 工作原理：细胞悬浮液与极细的珠子(玻璃、石英砂、
氧化铝等研磨剂，直径＜1mm)一起快速搅拌或研磨， 研磨剂珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破 碎，释放出内含物。
实验室规模：Mickle高速组织捣碎机、Braun匀 浆器；
中试规模：胶质磨； 工业规模：高速珠磨机(High-speed bead mill)
高压匀浆 法
超声破碎
法
固体剪切作用
液体剪切作用 液体剪切作用
可达较高破碎率，可较大规模操作， 大分子目的产物易失活，浆液分离困
难 可达较高破碎率，可大规模操作，不
适合丝状菌和革兰氏阳性菌 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧
烈，不适合大规模操作
X-press 法
酶溶法
固体剪切作用 酶分解作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏 感目的产物不适合
破碎的动力学方程：
式中： KT—与温度等有关的破碎常数 N—悬浮液通过匀浆器的次数 P—操作压力 a—微生物种类常数
破碎压力的选择：
增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，但 当压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损较大， 此外当压力超过一定值后，破碎率的增加很慢。
在工业生产中，通常采用的压力为55～70 MPa。
活
几种细胞破碎方式的比较
机械破碎 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。 珠磨法、挤压法、匀浆法、超声法。 物理破碎 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层
结构破坏，而使细胞破碎。 温度差破碎法、压力差破碎法。
化学破碎 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破
碎。 有机溶剂、表面活性剂、酸碱。 酶促破碎 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，
(7)、细胞悬浮液的流速 在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停
留时间，并影响破碎的总收率。
超声波破碎在实验室广泛应用，但在工业范围中 还未采用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中 通入足够的能量是很困难的。
X-press法
将浓缩的菌体悬浮液冷却至－25℃至－30℃形成 冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细 胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体 的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。
它可能对某些需要的分子带来破坏性影响，但对 破碎细胞毫无影响。 可通过添加游离基清除剂如胱氨酸或谷胱甘肽， 或者用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。
连续超声波破碎的实验室装置
由一个带夹套的烧杯组成，其形状和尺寸会影响 悬浮液的流体动力学。对于刚性细胞可以添加细 小的珠粒，产生辅助的研磨效应。超声波反应器 内，有四根内环管，由于声波振荡能量会泵送悬 浮液循环，用插入进出口管到内部烧杯去的方法， 就可以实现连续操作。
细胞壁的组成与结构
细胞壁的结构和细胞破碎
破碎时必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。 细胞的大小和形状以及聚合物的交联程度都是影
响破碎难易程度的重要因素。 壁结构不仅取决于遗传信息也取决于生长环境，
真菌的壁结构还随发酵罐中混合的机械作用而变 化。
虽然通过改变遗传密码或环境因素能够改变细胞 壁的结构，但还没有实验证明，该法能提高对机 械破碎的敏感性，也不能够预测各种微生物对机 械破碎的相对阻力。
阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米， 高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改 变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化， 从而造成细胞破碎。
出口
进口
阀座
阀杆 撞击环 阀杆
压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构简图
具有高度专一性，条件温和，浆液易 分离，溶酶价格高，通用性差
非 机 械
化学渗透 法
渗透压法
法 冻结融化
法
干燥法
改变细胞膜的渗 透性
渗透压剧烈改变 反复冻结-融化
改变细胞膜渗透 性
具一定选择性，浆液易分离，但释放 率较低，通用性差
破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的
产物 条件变化剧烈，易引起大分子物质失
使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。 外加酶制剂法、自溶法
影响破碎难易程度的重要因素
机械法—细胞的大小和形状、细胞壁厚度、聚合 物交联程度。显然，细胞个体小、球形、壁厚、 聚合物交联程度高是最难破碎的。（破碎细胞）
非机械法—细胞壁、膜的组成和结构。了解细胞 壁的组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化学 试剂，以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确 定其使用的顺序。 （溶解壁膜上的某些组成—打洞）
工业规模：高速珠 磨机。 圆盘高速旋转，使 细胞悬液和玻璃珠 相互搅动，细胞破 碎是由剪切力层之 间的碰撞和磨料的 滚动而引起。
典型的珠磨机的构造
瑞士：Dyno Mill。 磨室具夹套，可冷
却。在料液的出口 处有一旋转的圆盘 和出口平板（出口 位于平板的中部） 很靠近，可防止珠 体随料液带出。
破碎一般规律： （1）酵母较细菌难破碎； （2）处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的
细胞难破碎； （3）在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培
养基上培养的细胞较难破碎。
不宜采用高压匀浆法破碎的有： （1）易造成堵塞的团状或丝状真菌， （2）较小的革兰氏阳性菌， （3）某些质地坚硬的亚细胞如包含体
破碎阻力主要决定于壁结构 交联的紧密度和壁厚度
其他真菌的细胞壁
大多数真菌的细胞壁主要由多糖组成，其次还含 有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁 的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁 是由几丁质和葡聚糖构成。
真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不 仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构， 所以强度有所提高。
(6)、探头的形状和材料
对于一个能级恒定的功率，探头的振幅与其面积 成反比，然而对于小直径的探头，声能限制在较 小的区域并且效率低。特别是当悬浮液的体积小 的时候，能量在探头嘴附近被悬浮液吸收，强烈 的涡流会变小。对于大的探头，声能消耗在大范 围上，结果则使振幅更小。
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细胞破碎PPT课件
原理： 细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷 出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的 撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列 高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化， 从而造成细胞破碎。
高压匀浆器
高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:
压力 (工业生产中常用55～70MPa的压力) 循环操作次数(多次循环的操作方法)
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物
条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
细胞破碎的方法（按细胞所受作用）
分类
作用机理
适应性
高压匀浆法 液体剪切作用
可达较高破碎率，可大规模操作，不适 合丝状菌和革兰氏阳性菌
珠磨法
固体剪切作用
可达较高破碎率，可较大规模操作，大 分子目的产物易失活，浆液分离困难
物 超声破碎法 理 破 渗透压法 碎
革兰氏阴 性细菌的 外膜
壁膜间隙
革兰氏阴性细菌的细胞壁
O-特异多糖 (O-polysaccharide)
核心多糖(corepolysaccharide)
蛋白质
孔蛋白 类脂A (Lipid A)
(脂多糖)
脂蛋白
磷脂分子
细胞壁的结构和特点
微生物 壁厚/nm
革兰氏阳 革兰氏阴 性细菌 性细菌
20-80
反复冻融法
液体剪切作用
渗透压剧烈改变 反复冻结-融化
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
破碎率较低，常与其他方法结合使用
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物
干燥法
改变细胞膜的渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
X-press法 固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合
高压匀浆器
高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:
压力 (工业生产中常用55～70MPa的压力) 循环操作次数(多次循环的操作方法)
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物
条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
细胞破碎的方法（按细胞所受作用）
分类
作用机理
适应性
高压匀浆法 液体剪切作用
可达较高破碎率，可大规模操作，不适 合丝状菌和革兰氏阳性菌
珠磨法
固体剪切作用
可达较高破碎率，可较大规模操作，大 分子目的产物易失活，浆液分离困难
物 超声破碎法 理 破 渗透压法 碎
革兰氏阴 性细菌的 外膜
壁膜间隙
革兰氏阴性细菌的细胞壁
O-特异多糖 (O-polysaccharide)
核心多糖(corepolysaccharide)
蛋白质
孔蛋白 类脂A (Lipid A)
(脂多糖)
脂蛋白
磷脂分子
细胞壁的结构和特点
微生物 壁厚/nm
革兰氏阳 革兰氏阴 性细菌 性细菌
20-80
反复冻融法
液体剪切作用
渗透压剧烈改变 反复冻结-融化
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
破碎率较低，常与其他方法结合使用
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物
干燥法
改变细胞膜的渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
X-press法 固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合
第三章 细胞破碎 应国清老师课件
2)
工作原理：空穴现象
特点：
3)
适用对象一般
仅实验室中应用 细胞完全破碎
Biblioteka 需冷却，噪音3、非机械破碎法
3.1 化学（脂溶）法
1)
定 义——采用某些化学试剂改变细胞壁和膜的通透性，
使内含物有选择性地释放出来的过程
2)
原 理：
酸碱 有机溶剂 表面活性剂 螯合剂
3.2 酶解法
1)
定义—利用酶促反应分解细胞壁上的键而达到 细胞破碎的过程
第三章 细胞破碎方法
一、细胞壁的组成和结构
1.
细菌类
组成—肽聚糖（多糖、氨基酸）、脂类
肽聚糖是细菌细胞壁的主要成份，它是由N-乙酰胞壁酸(NAM)、N-乙酰 葡萄糖胺(NAG)和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过β1.4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上， 肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽 “尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构
适用对象广 工业化、实验室中应用 细胞完全破碎
2.2 高速珠磨法
1)
定义—利用由高速转动的珠子所产生的剪切力 而达到细胞破碎的过程
2)
工作原理：固－固剪切力、液－固剪切力等 特点：
3)
适用对象较广
工业化、实验室中应用
细胞完全破碎 需冷却
2.3 超声波法
1)
定义—利用超频率声波（15-25kHz）在液体 介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎 的过程
2)
原理
外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶（β-1,4、 β –1,6）、 葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、
细胞破碎课件PPT
酶解法是一种利用酶来分解细胞壁的方法，通常使用溶菌酶、蜗牛酶等酶类物质。
酶解法的优点在于对细胞壁的破坏作用较小，能够保持细胞内物质的完整性，适用 于提取细胞内活性物质。
酶解法的缺点在于酶的种类和浓度对破碎效果影响较大，且酶解过程较慢，需要较 长时间才能达到理想的破碎效果。
溶菌酶破碎
溶菌酶是一种专门作用于细菌 细胞壁的酶，能够破坏细菌细 胞壁，使细胞壁水解而破碎。
高压破碎
原理
常用设备
利用高压作用使细胞膜破裂，释放细胞内 的物质。
高压均质机、高压破碎机等。
应用范围
注意事项
适用于各种类型的细胞，尤其是对细胞壁 有破坏作用的高压破碎。
高压破碎需要严格控制压力和作用时间， 以避免对细胞内物质造成过度破坏。同时 ，需要确保设备的安全性和稳定性。
04
生物法破碎细胞
酶解法
溶菌酶破碎适用于革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌的破碎，尤 其对革兰氏阳性菌的破碎效果 较好。
溶菌酶破碎的优点在于破碎效 率较高，且对细胞内物质的破 坏作用较小。
蜗牛酶破碎
蜗牛酶是一种天然的酶，能够分解细 胞壁和细胞膜，使细胞内的物质释放 出来。
蜗牛酶破碎的优点在于能够有效地释 放细胞内的物质，且对细胞内物质的 破坏作用较小。
免疫学研究
细胞破碎后提取的细胞成分可以用于免疫学研究，如抗原-抗体反应、 细胞因子检测等，有助于深入了解免疫系统的功能和调控机制。
在药物制备中的应用
1 2
天然药物提取
许多天然药物来源于动植物细胞，通过破碎细胞 可以提取有效成分，如中药材的有效成分。
合成药物的合成与改造
在药物合成中，细胞破碎可用于释放细胞内的酶 或其他生物催化剂，以促进药物的合成或改造。
《细胞的破碎》幻灯片PPT
第二节 细胞壁的破碎
〔2〕细胞的浓度 在细胞破碎过程中，产生的热量随浓 度的增大而提高，增加了冷却的费用。因此最正确的细胞浓 度由实验来确定。用NetzshLM20研磨和破碎酵母或细菌时， 细胞浓度控制在40%左右。
〔3〕球粒大小和装填量 磨球越小，细胞破碎速度越快。 但磨球太小而漂浮，难以停留在磨腔中。因此实验室规模的 研磨机中，球径为0.2mm较好；而工业化规模操作中，球径 >0.4mm。且不同的细胞，应选择不同的球径。球粒的体积占 研磨机腔体自由体积的百分比同样影响破碎效果，一般控制 在80%～90%之间，并随球粒直径大小而变化。
第二节 细胞壁的破碎
二、高压匀浆法
高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。
它的主要设备是高压匀浆机，它有一个高压位移
泵和一个可调节进料速度的针形阀〔见图2-7〕。
当菌体悬浮液经过高压泵加压后，通过阀芯与阀
座之间的通道时，悬浮液突然改变方向，向球撞
击。在通过阀门时产生高剪应力，向环撞击时产
生碎率巨服大从的一冲l级n击R反力mR响m ，定R将律细。k胞NP破d碎，
第一节 细胞壁的构造与组成
二、真菌和酵母 真菌的细胞壁含有几丁质〔N-乙酰葡萄糖胺的 一种聚合物〕纤维素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚 糖等。此外还有蛋白质、类脂、无机盐等。而酵母 的细胞壁〔见图2-4〕由特殊的纤丝状物质构成， 主要成份是甘露聚糖〔31%〕，葡聚糖〔29%〕， 蛋白质〔13%〕和类脂质〔8.5%〕。酵母中的葡聚 糖的为 β-1，6-葡聚糖通过β-1，3键与D-葡萄糖中 第一侧链交连而不溶于水。 所有的真菌细胞壁是由不同的多糖链相互缠绕 成一股又粗又壮的链，嵌入在蛋白质及类脂和一些
第二节 细胞壁的破碎
六、其它方法 除上述各种方法外，常用的方法还有以下几种。
第三章 细胞破碎
不能单纯追求高破碎率， 不能单纯追求高破碎率，随意增加操作 压力。 压力。
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 阀座形式： 阀座形式： 在相同的操作压力下，刃缘阀座比平 在相同的操作压力下， 边阀座破碎率高，但更易磨损。 边阀座破碎率高，但更易磨损。
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 浓度： 浓度： 一般认为，酵母破碎率与细胞浓度无关 一般认为， Doulach等人通过理论分析，认为破碎 Doulach等人通过理论分析， 等人通过理论分析 率与细胞浓度存在下列关系： 率与细胞浓度存在下列关系：
R = 1 − exp − p − p
{ [(
3.3 细胞壁的破碎
表3.2 细胞对破碎的敏感度
细胞 动物细胞 革兰式阴性芽孢杆菌和球菌 革兰式阳性芽孢杆菌 酵母 革兰式阳性球菌 孢子 菌丝 声波 7 6 5 3.5 3.5 2 1 搅拌 7 5 （4） ） 3 （2） ） （1） ） 6 减压 7 6 5 4 3 2 （1） ） 冷冻压力 7 6 4 2.5 25 1 5
3.3.2 破碎方法
动力学方程： 动力学方程：遵循一级动力学方程
㈠ 珠 磨 法
dR = k ( Rm − R ) dt
... 3.1
R：t时间内释放的蛋白质数量（mg/g） ： 时间内释放的蛋白质数量（ ） Rm：能释放的蛋白质最大数量，即100％破碎 能释放的蛋白质最大数量， ％ k：破碎的比速率 ：
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法
HC23图3.3 HC23-高压细胞 破碎机
图3.4 DY89-1 型电动 玻璃匀浆机
㈡ 高 压 匀 浆 法
作用机理： 作用机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀 之间的环隙高速(可达到450m s)喷出后撞击 450m／ 之间的环隙高速(可达到450m／s)喷出后撞击 到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后， 到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急 剧释放到低压环境， 剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等 综合作用下破碎。 综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常 为50～70MPa。 50～70MPa。
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 阀座形式： 阀座形式： 在相同的操作压力下，刃缘阀座比平 在相同的操作压力下， 边阀座破碎率高，但更易磨损。 边阀座破碎率高，但更易磨损。
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 浓度： 浓度： 一般认为，酵母破碎率与细胞浓度无关 一般认为， Doulach等人通过理论分析，认为破碎 Doulach等人通过理论分析， 等人通过理论分析 率与细胞浓度存在下列关系： 率与细胞浓度存在下列关系：
R = 1 − exp − p − p
{ [(
3.3 细胞壁的破碎
表3.2 细胞对破碎的敏感度
细胞 动物细胞 革兰式阴性芽孢杆菌和球菌 革兰式阳性芽孢杆菌 酵母 革兰式阳性球菌 孢子 菌丝 声波 7 6 5 3.5 3.5 2 1 搅拌 7 5 （4） ） 3 （2） ） （1） ） 6 减压 7 6 5 4 3 2 （1） ） 冷冻压力 7 6 4 2.5 25 1 5
3.3.2 破碎方法
动力学方程： 动力学方程：遵循一级动力学方程
㈠ 珠 磨 法
dR = k ( Rm − R ) dt
... 3.1
R：t时间内释放的蛋白质数量（mg/g） ： 时间内释放的蛋白质数量（ ） Rm：能释放的蛋白质最大数量，即100％破碎 能释放的蛋白质最大数量， ％ k：破碎的比速率 ：
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法
HC23图3.3 HC23-高压细胞 破碎机
图3.4 DY89-1 型电动 玻璃匀浆机
㈡ 高 压 匀 浆 法
作用机理： 作用机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀 之间的环隙高速(可达到450m s)喷出后撞击 450m／ 之间的环隙高速(可达到450m／s)喷出后撞击 到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后， 到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急 剧释放到低压环境， 剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等 综合作用下破碎。 综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常 为50～70MPa。 50～70MPa。
第三章 细胞的破碎与分离
而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的 机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围； 使细胞具有一定的形状和强 度。
第三章 细胞的破碎与分离
本章的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
概述
• 不同类型的细胞分泌目标产物的类型：
• 动物细胞多分泌到细胞外培养液 • 植物细胞多为胞内产物 • 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外， 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破 碎。
概述 • 大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些 多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵 液中。 • 有些目标产物存在于生物体中。
在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水 解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲 液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其 它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞 悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
超声波破碎的适用范围
超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物 的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对 酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物 质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实 验室小规模细胞破碎中常用。
化学破碎
酶促破碎
一 机械法
机械破碎法又可分为： 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding）
细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围； 使细胞具有一定的形状和强 度。
第三章 细胞的破碎与分离
本章的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
概述
• 不同类型的细胞分泌目标产物的类型：
• 动物细胞多分泌到细胞外培养液 • 植物细胞多为胞内产物 • 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外， 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破 碎。
概述 • 大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些 多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵 液中。 • 有些目标产物存在于生物体中。
在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水 解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲 液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其 它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞 悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
超声波破碎的适用范围
超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物 的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对 酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物 质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实 验室小规模细胞破碎中常用。
化学破碎
酶促破碎
一 机械法
机械破碎法又可分为： 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding）
细胞破碎ppt课件
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15.2 细胞破碎技术
机械法和非机械法 15.2.1机械法
机械法主要是利用高压、研磨或超声波等 手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目 的. 包括高压匀浆法,珠磨法和超声破碎法
高压匀浆器
影响匀浆破碎的主要 因素是压力、温度和 通过匀浆器阀的次数。
高压匀浆法的适用范 围较广，在微生物细 胞和植物细胞的大规 模处理中常采用.
15.3 破碎率的测定
破碎率R:细胞破碎的程度.
常用的方法是测定目的产物的释放量: 释放的蛋白 的量或酶的量.
15.4 基因工程包涵体的纯化方法
包涵体的洗涤和目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性
思考题
1.细胞破碎的目的 2.举出几种细胞破碎常用的方法 3.
15.2.3 选择破碎方法的依据 (1)细胞的处理量 (2)细胞壁的强度和结构 (3)目标产物对破碎条件的敏感性 (4) 破碎程度
适宜的操作条件应从高的产物释放率， 低的能耗和便于后步提取这二方面进行 权衡
15.2.4 破碎技术研究的方向
(1)多种破碎法的结合 (2)与上游技术结合 (3)与下游操作技术结合
15 细胞破碎
定义:
细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程 度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产 物最大程度地释放到液相中，破碎后的细 胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采 用不同的分离手段进一步纯化.
15.1细胞壁的组成和结构
微生物细胞壁的化学组成和结构 细菌，肽聚糖的网状结构 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌：细胞壁更厚 植物细胞壁的化学组成和结构 初生壁，次生壁 具有很高的机械强度
高速珠磨机(high spced bead mill) 研 磨是常用的一种方法， 它将细胞悬浮液与玻 璃小珠、石英砂或氧 化铝等研磨剂一起快 速搅拌，使细胞获得 破碎。
15.2 细胞破碎技术
机械法和非机械法 15.2.1机械法
机械法主要是利用高压、研磨或超声波等 手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目 的. 包括高压匀浆法,珠磨法和超声破碎法
高压匀浆器
影响匀浆破碎的主要 因素是压力、温度和 通过匀浆器阀的次数。
高压匀浆法的适用范 围较广，在微生物细 胞和植物细胞的大规 模处理中常采用.
15.3 破碎率的测定
破碎率R:细胞破碎的程度.
常用的方法是测定目的产物的释放量: 释放的蛋白 的量或酶的量.
15.4 基因工程包涵体的纯化方法
包涵体的洗涤和目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性
思考题
1.细胞破碎的目的 2.举出几种细胞破碎常用的方法 3.
15.2.3 选择破碎方法的依据 (1)细胞的处理量 (2)细胞壁的强度和结构 (3)目标产物对破碎条件的敏感性 (4) 破碎程度
适宜的操作条件应从高的产物释放率， 低的能耗和便于后步提取这二方面进行 权衡
15.2.4 破碎技术研究的方向
(1)多种破碎法的结合 (2)与上游技术结合 (3)与下游操作技术结合
15 细胞破碎
定义:
细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程 度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产 物最大程度地释放到液相中，破碎后的细 胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采 用不同的分离手段进一步纯化.
15.1细胞壁的组成和结构
微生物细胞壁的化学组成和结构 细菌，肽聚糖的网状结构 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌：细胞壁更厚 植物细胞壁的化学组成和结构 初生壁，次生壁 具有很高的机械强度
高速珠磨机(high spced bead mill) 研 磨是常用的一种方法， 它将细胞悬浮液与玻 璃小珠、石英砂或氧 化铝等研磨剂一起快 速搅拌，使细胞获得 破碎。
3.细胞的破碎--3
主要由肽聚糖、 氨基酸、 糖、脂质等化学成分组成。 破碎细菌的主要阻力 来自于肽聚糖的网状结构， 其中肽键的数量和交联程 度是主要影响因子．
2 酵母菌细胞壁化学组成
是由特殊的酵母纤维素 构成,其主要成分是:葡聚 糖、甘露聚糖和蛋白质
破碎酵母菌细胞的
阻力主要决定于细胞壁结
构交联的紧密程度和它的
常见各种机械法比较
方法 机械法 技术 匀浆法（片型） 撞击法（孔型） 原理 效果 成本 适中 适中 举例 动物组织及动 物细胞 细胞悬浮液大 规模处理 研磨法 细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理 细胞悬浮液小 规模处理
细胞被搅拌器劈碎 适中 须使细胞通过的小 剧烈 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 细胞被研磨物磨碎 适中 细胞被玻璃珠或铁 剧烈 珠捣碎
本章内容结束
b 蛋白质 次生壁: (部分植物细胞有 次生生长而产生)
破碎植物细胞的阻力 主要决定于细胞壁的初生 壁的厚度，以及次生壁的 有无，及其厚度。
第二节 细胞破碎技术
目前有多种细胞破碎的方法，以适应不同类型的 细胞壁的破碎，可归纳为两大类：机械法和非机 械法。
原理：
压挤
撞击 剪切 化学渗透 物理渗透
（1）细胞的处理量（不同方法）
（2）细胞壁的强度和结构（不同方法试剂）。
（3）目标产物对破碎条件的敏感性。
（4）破碎程度。
第三节
破碎方法的选择
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核 酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质 量的减少，因此需要： 加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；
图4.5 高压匀浆机
DY89-I型 电动 玻璃匀浆机
高压匀浆机结构剖析图
2 酵母菌细胞壁化学组成
是由特殊的酵母纤维素 构成,其主要成分是:葡聚 糖、甘露聚糖和蛋白质
破碎酵母菌细胞的
阻力主要决定于细胞壁结
构交联的紧密程度和它的
常见各种机械法比较
方法 机械法 技术 匀浆法（片型） 撞击法（孔型） 原理 效果 成本 适中 适中 举例 动物组织及动 物细胞 细胞悬浮液大 规模处理 研磨法 细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理 细胞悬浮液小 规模处理
细胞被搅拌器劈碎 适中 须使细胞通过的小 剧烈 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 细胞被研磨物磨碎 适中 细胞被玻璃珠或铁 剧烈 珠捣碎
本章内容结束
b 蛋白质 次生壁: (部分植物细胞有 次生生长而产生)
破碎植物细胞的阻力 主要决定于细胞壁的初生 壁的厚度，以及次生壁的 有无，及其厚度。
第二节 细胞破碎技术
目前有多种细胞破碎的方法，以适应不同类型的 细胞壁的破碎，可归纳为两大类：机械法和非机 械法。
原理：
压挤
撞击 剪切 化学渗透 物理渗透
（1）细胞的处理量（不同方法）
（2）细胞壁的强度和结构（不同方法试剂）。
（3）目标产物对破碎条件的敏感性。
（4）破碎程度。
第三节
破碎方法的选择
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核 酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质 量的减少，因此需要： 加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；
图4.5 高压匀浆机
DY89-I型 电动 玻璃匀浆机
高压匀浆机结构剖析图
最新微生物细胞的破碎PPT课件
自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳 定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培 养液过滤速度也会降低。
C. 抑制细胞壁合成
采用抑制细胞壁合成的方法能导致类似于酶解的结果。
某些抗生素如青霉素或环丝氨酸，能阻止新细胞壁物质 的合成。
抑制剂应在发酵过程细胞生长期的后期加入。只有当抑 制剂加入后，生物合成和再生还在继续进行，溶胞的条件才 是有利的。这样在细胞分裂阶段存在的细胞壁有缺陷，故能 达到溶胞作用。
穴清除，特别是应用高的功率时。 (4)、被处理悬浮液的体积 大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。
(5)、珠粒的体积和直径 添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的
形成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，从而提 高破碎效率。 在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，k存 在最大值。
虽然通过改变遗传密码或环境因素能够改变细胞壁的 结构，但目前没有足够资料表明该法能提高对机械破碎的 敏感性，也没有足够的资料能用来顶测各种微生物对机械 破碎的相对阻力。
在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和 组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的 依据。
二、微生物细胞的破碎技术
优点: 产品释放的选择性高; 抽提的速率和收率高; 产品的破坏最少; 对pH值和温度等外界条件要求低; 不残留细胞碎片。 缺点： 广泛应用受酶的费用限制。若在超滤反应器中使用可
溶性固定化酶可望解决酶的费用问题。
单一酶不易降解细胞壁，需要选择适宜的酶及酶反 应系统，确定特定的反应条件，并结合其他的处理方法， 如辐照、加入高浓度盐及EDTA，或利用生物因素促使 生物对酶解作用敏感等
(6)、探头的形状和材料
对于一个能级恒定的功率，探头的振幅与其面积成反比， 然而对于小直径的探头，声能限制在较小的区域并且效 率低。特别是当悬浮液的体积小的时候，能量在探头嘴 附近被悬浮液吸收，强烈的涡流会变小。对于大的探头， 声能消耗在大范围上，结果则使振幅更小。