内源激素测定
竹子内源激素HPLC测定方法改良
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第３
研
究
汇
刊
Ｖ０． ０．Ｎｏ ４ １３ ．
Ｎｏ ．，２ ０ １ ｖ １
２０１１年 １１月
Ｊ ＲＮＡ ＡＭＢ Ｓ ＡＲＣ ＯＵ Ｌ ＯＦ Ｂ ＯＯ ＲＥ Ｅ Ｈ
竹子内源激 素 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ测定方法改 良
方 楷 杨光耀 杨 清培 施建 敏 于 芬 刘腾 飞
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月季切花内源激素含量ELISA测定方法的建立
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较高， 设备要求也较高的高效液相色谱 法 （ Ｐ Ｃ） ＨＬ 和色谱 一 质谱联用法 （ Ｃ ＭＳ） 、利用某种分 Ｇ — … 子相同的标记激素（ 抗原） 非标记的抗原与专一性 和 的抗体 （ ｂ 进行 竞 争性 抑 制反 应 的放 射 免疫 法 Ａ） （ Ｉ 喁 用酶代替放射性同位素做标 记物的酶联 ＲＡ）０ 及 免 疫 测 定 法 ‘ 其 中 酶 联 免 疫 吸 附 法 。 （ｎｙ ｅ ｌ ｋ ｄ ｍ ｎ ｓｒｅ ｔ ｓａｓ 简 称 Ｅ ｚｍ —ｉ ｅ Ｉ ｍｕ ｏ ｏｂ ｎ Ａ ｓｙ ， ｎ Ｅ ＩＡ法） ＬＳ 应用于植物激素的测定具有前处理简便 、 测定快捷 、 灵敏度好 、 特异性高的特点， 适用于大批 样 品的测定， 目前广泛应用 于植物激素的研究测定 （ Ｅｈ ） 除 ｔ 外 和临床医学等其它方面的检测 ［。 １ ０ １ 月季切 花 （ ｏａＣＳ ） Ｒ ｓ Ｖ， 为世界 著 名 的四大切 花 之一 ， 在月季切花瓶插后代谢机理及保鲜剂处理后
ｂ ｓ ｄ ｏ Ｉ Ａ ｓ ｔｏ ｕ ｅ ， ｅ ｗａ ｆｄ ｔ ｒ ｎ ｎ ｏ ｅ ｏ ｓｈ ｒ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｓ ｄ ｕ ｏ ｅ ｂ ｅ ｎ ａ ｅ ｎ ＥＬ Ｓ Ｗａ ｉ ｒ ｄ ｃ ｄ ｔ ｙ ｏ ｅ ｅ ｍｉ ｅ ｅ ｄ ｇ ｎ ｕ ｏ ｎ ｈ ｍ ｎ ｏ ｔ ｎｔ ｉ ｅ ｃ ｔｒ ｓ ａ ｄ ｏ ｎ ｉ ｓ ＥＬ Ｓ Ｗａ ｕ ｔ ｐ ． ＩＡ ｓ ｂ ｉ ｕ ｌ
超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性内源激素的含量
超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性内源激素的含量摘要:利用超高效液相色谱法同时测定柑橘(Citrus reticulate Bance)果肉中的玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸的含量｡以C8色谱柱,甲醇-0.1%冰乙酸为流动相梯度洗脱,检测波长为262 nm,流速0.22 mL/min｡结果表明, 玉米素含量在0.14~0.38 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 5,平均回收率为98.7%,RSD为0.99%;赤霉素含量在0.67~1.79 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 3,平均回收率为98.6% ,RSD 为0.70%;吲哚乙酸含量在0.25~0.67 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 6,平均回收率为99.0% ,RSD为0.68%;脱落酸含量在0.036~0.096 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 9,平均回收率为99.1% ,RSD为0.61%｡该方法简便､快速､精密度高､准确性好,可用于植物样品中激素含量的测定｡关键词:柑橘(Citrus reticulate Bance);植物激素;超高效液相色谱法Determination of Four Endogenous Hormones in Orange Pulp by UPLC Abstract: Determination of four endogenous hormones such as zeatin (ZT), gibberellin (GA), indole acetic acid (IAA) and abscisic acid (ABA) was proceeded by UPLC. The method used a C8 column, and adopted the gradient elution method with methanol-0.1% acetic acid as mobile phase and the UV detection wavelength was 262 nm, and flow rate was 0.22 mL/min. The calibration curve of ZT was linear between 0.14 μg/mL and 0.38 μg/mL, R2 was 0.999 5, the average recovery was 98.7%, and RSD was 0.99%.The calibration curve of GA was linear between 0.67 μg/mL and 1.79 μg/mL, R2 was 0.999 3, the average recovery was 98.6%, and RSD was 0.70%.The calibration curve of IAA was linear between 0.25 μg/mL and 0.67 μg/mL, R2 was 0.999 6, the average recovery was 99.0%, and RSD was 0.68%. The calibration curve of ABA was linear between 0.036 μg/mL~0.096 μg/mL, R2 was 0.999 9, the average recovery was 99.1%, and RSD was 0.61%. This method was proved to be simple, precise, accurate and could be used for the quality control of hormone content in the plant samples.Key words: Orange pulp(Citrus reticulate Bance); plant hormone; UPLC植物性内源激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的微量有机物,其生理效应复杂多样,对植物生长发育有重要的调节控制作用[1,2]｡吲哚乙酸､赤霉素､脱落酸､玉米素是植物体广泛存在的植物激素,本研究运用超高效液相色谱(UPLC)法同时测定柑橘中这4种内源激素,利用UPLC超高分离度､快速､超高灵敏度的优点,解决传统HPLC在植物激素分析中存在的分离度差,分析时间较长的缺点｡本研究建立了植物内源激素高效､稳定､准确的分离和测定方法,为植物内源激素调节其营养生理与生长的研究提供支撑｡吲哚乙酸(IAA)是一种植物体内普遍存在的含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素,属吲哚类化合物,又名生长素,其基本作用在于调节植物生长;赤霉素(GA)是一类属于双萜类化合物的植物激素,典型生理作用是能促进枝条的生长,尤其是能促进无伤害植物的整体生长;脱落酸(ABA)是一种具有倍半萜结构的抑制生长的植物激素,因能促使叶子脱落而得名,具有加速植物器官脱落,抑制整株植物或离体器官的生长,并对细胞的分裂与生长起抑制等作用;玉米素(Zeatin)是一种天然的细胞分裂素,化学名称为6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤,它是从甜玉米灌浆期的子粒中提取并结晶出的第一个天然细胞分裂素,能刺激植物细胞分裂,促进叶绿素形成,加速植物新陈代谢和蛋白质的合成,从而达到有机体迅速增长,促使作物早熟丰产,提高植物抗病抗衰抗寒能力｡1 材料与方法1.1 仪器和试剂ACQUITY Uitra Performance LC超高效液相色谱系统,Empower色谱工作站,检测器:PDA eλ Detector紫外检测器(Waters公司);台式系列数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)｡玉米素标准品(Sigma公司,纯度87.0%);赤霉素标准品(SUPELCO公司,纯度96.5%);吲哚乙酸(Riedel-de Haen公司,纯度99.0%);脱落酸(Sigma公司,纯度99.0%);甲醇(色谱纯);冰乙酸(分析纯);超纯水;C18柱(500 mg/6 mL,美国赛分科技公司)｡1.2 实验方法1.2.1 样品采集实验所用的柑橘样品均采自广西全州｡在不同时间共采集6组样品｡摘取生长中的柑橘果实,迅速放入冰盒中带回实验室,-20℃保存备用｡1.2.2 色谱条件色谱柱:ACQUITYUPLCRBEH130 C8,1.7 μm(2.1×50 mm);流动相:甲醇-0.1%冰乙酸梯度洗脱;流速0.22 mL/min;检测波长为262 nm;柱温为25 ℃｡1.2.3 标准溶液的制备分别精密称取玉米素､赤霉素､吲哚乙酸､脱落酸标准对照品0.12､0.28､0.21､0.15 mg置于50 mL容量瓶中,50%甲醇溶解定容,配制浓度分别为2.4､5.6､4.2､3.0 μg/mL的标准储备溶液｡1.2.4 样品溶液的制备称取已匀浆的柑橘果肉5.000 0 g置于25 mL容量瓶中,用80%甲醇溶解,冰水浴超声45 min,取出恢复常温后,80%甲醇定容,过滤,取过滤液10 mL于10 mL分度比色管,氮吹去除甲醇,残留液于C18柱中脱色,用6.0 mL 流动相分3次洗脱,用10 mL分度比色管收集所有从C18柱的流出液,流动相定容至8.0 mL,用0.22 μm有机滤膜过滤,滤液即为待测液｡1.2.5 四种植物激素混合标准曲线的制备分别吸取玉米素､赤霉素､吲哚乙酸及脱落酸标准储备溶液0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6 mL于6个10 mL容量瓶中,流动相定容至刻度,依次进样,进样体积为5.0 μL｡2 结果与分析2.1 提取方法的确定据文献报道,玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸4种激素可采用67%的丙酮水溶液[1]､0.5 moL/L NaOH溶液[3]､80%甲醇水溶液[4]等溶剂提取,石油醚､乙酸乙酯､PVP和C18柱等方式净化,根据4种激素对时间和热不稳定[4],易发生降解反应,所以在实验操作过程中应注意控制时间及温度,本试验通过对不同的提取溶剂,提取方式(超声提取､过夜浸提)､提取时间､提取次数分别做单因素考察实验,最终确定以80%甲醇为提取剂,冰水浴超声提取45 min,C18柱净化为最佳实验条件｡2.2 色谱条件的选择2.2.1 色谱柱的选择植物样品中含杂质量较多,分离难度较大｡UPLC选用粒径低于2 μm的小颗粒作为填料,比普通HPLC有更高的分离度､灵敏度和分析速度,因此对分离测定植物样品中的4种激素具有较大的优势｡本实验选用ACQUIY UPLC BEH130 C18 1.7 μm(2.1×100 mm)､ACQUIY UPLC BEH C8 1.7 μm(2.1×50 mm)和ACQUIY UPLC BEH C18 1.7 μm(2.1×50 mm)分别对样品进行分离测定,结果显示用ACQUIY UPLC BEH C8 1.7 μm(2.1×50 mm)能够对样品进行很好的分离｡2.2.2 波长的选择将4种激素的混合标准溶液于ACQUITY超高效液相色谱系统上进行测定,PDA紫外检测器对其进行光谱扫描,最大吸收光谱的波长分别为:玉米素(ZT)在204 nm和271 nm有吸收峰,赤霉素(GA)在192 nm和252 nm有吸收峰,吲哚乙酸(IAA)在218 nm和279 nm有吸收峰,脱落酸(ABA)在194 nm和261 nm有吸收峰｡将4种激素的混合标准液分别在以上多个波长下进行测定,发现在波长为262 nm下标准混合液出峰基线毛刺少且峰形较好,玉米素､吲哚乙酸和脱落酸的峰面积为最高,赤霉素峰面积也变化较少,所以本实验采用262 nm为4种激素的检测波长｡4种激素的吸收光谱图见图1｡2.2.3 流动相的选择根据4种激素的特性及植物样品所含的杂质量,通过对各种流动相如甲醇-水､乙腈-水､甲醇-乙酸-水､乙腈-乙酸-水等不同溶液系统的尝试,最终选用甲醇和0.1%冰乙酸-水溶液为流动相｡经反复试验后,发现甲醇和0.1%冰乙酸-水溶液在梯度洗脱的条件下,各组分分离较好,且各峰峰型较好,分析时间也较短｡4种激素保留时间合适,色谱图见图2;流动相比例见表1｡2.3 线性关系以对照品进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,将所得数据绘成标准曲线,玉米素线性方程为:Y=593.810X-43.469,R2=0.999 5,线性范围0.14~0.38 μg/mL;赤霉素线性方程为:Y=48.948X-19.105,R2=0.999 3,线性范围0.67 ~1.79 μg/mL;吲哚乙酸线性方程为:Y=315.500X-43.471,R2=0.999 6,线性范围0.25~0.67 μg/mL;脱落酸线性方程为:Y=6 481.000X-136.610,R2=0.999 9,线性范围0.036~0.096 μg/mL｡结果见图3-图6｡2.4 精密度试验精密吸取玉米素､赤霉素､脱落酸和吲哚乙酸混合标准溶液各5.0 μL,重复进样5次,测定峰面积,玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸标准溶液峰面积的RSD分别为0.39%､0.47%､0.29%､0.25%｡表明方法精密度良好｡2.5 重复性试验同一批柑橘样品取样5份,按1.2.4操作,依法测定,计算玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸的含量,RSD分别为3.64%､2.48%､2.78%､3.15%｡表明方法重复性良好｡2.6 回收率试验称取已知含量的样品9份,加入玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸标准溶液5.0､7.5､10.0 mL各3份,按1.2.4进行操作测定,计算回收率,结果(表2-表5)表明,回收率在98.6%~99.1%,RSD在0.61%~0.99%,表明方法回收率较好｡3 小结与讨论以80%甲醇为提取剂,冰水浴超声提取45 min,C18柱净化为最佳实验条件,甲醇和0.1%冰乙酸为流动相,流速0.22 mL/min梯度洗脱,UPLC系统对样品进行测定,样品中4种激素能在7 min之内达到较好的分离｡充分利用了超高效液相色谱的优点与有利条件,建立的方法简单可靠,进一步拓宽了液相色谱在植物激素测定方面的应用｡参考文献:[1] 刘贤明,梁锦添,秦绪雄.用高效液相色谱分析植物内源激素吲哚-3-乙酸､脱落酸和玉米素[J].色谱,1996,8(1):340-341.[2] 陈小鹏,王秀峰,孙小镭,等.高效液相色谱测定黄瓜瓜条中赤霉素和脱落酸含量[J].山东农业科学,2005(1):65-67.[3] 郑春霞,王强,阮晓.HPLC分离测定香梨三种植物激素[J].新疆农业大学学报,2000,23(1):54-56.[4] 陈波浪,郑春霞,盛建东,等. HPLC分离和测定棉花中3种植物激素[J].新疆农业大学学报,2006,29(1):28-30.。
液相色谱-串联质谱法测定尿液中的内源性类固醇激素
。因 此， 内源性类固醇激素的检
测及判定是近年来研究的热点。 , , 内源性类固醇是自身合成的激素， 包括睾酮、 表
收稿日期： !""( ,"# ,$) 第一作者： 王萌烨， 硕士研究生 * -,."/) ："$*#"’( + 0$1"#* 21$* 3#*
通讯联系人： 沈 , 敏， 研究员 * 42) ： （ "!$ ） *!)%$$’# ，-,."/) ：./#562#5071 + 6(8."/)* 3(.* 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （ +(* !""’(*")( ） *
尿样经葡萄糖醛酸甙酶酶解后进行液液提取以甲醇后尿液中内源性类固醇激素的变化情况结果表明该方法样品处理简便色谱分离完全结果准确可靠可替代气相色谱谱法用于体液中内源性类固醇激素兴奋剂的常规分析
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色
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睾 酮、脱 氢 表 雄 酮（ 126&1%(2N/"#1%(582%(#2 ， ?@-A ） 、 雄酮以及苯胆烷醇酮等。其中 ?@-A 是多 种类固醇激素的重 要 前 体， 它在体内可通过多种途 径代谢为雄酮、 苯胆 烷 醇 酮 以 及 睾 酮 等 不 同 的 内 源
)］ 性类固醇 激 素［4;* ］ 务［ "" ， 。
! ! 本文 对 尿 样 先 用 葡 萄 糖 醛 酸 甙 酶 酶 解 后 采 用 液 ! 液提 取 法 提 取， 以 甲 基 睾 酮 为 内 标， 建立了尿液 中 ’()* 、 睾酮、 雄 酮、 苯胆烷醇酮和表睾酮等 $ 种 内源性类固醇的 +#!%& $ %& 分析 方 法， 并应用该方 法 测 定 了 健 康 受 试 者 服 用 ’()* 片 剂 后 尿 液 中 ’()* 等 $ 种内源性类固醇激素的含量。
免疫法测定内源激素
内源激素测定方法1、内源激素测定种类：生长素（IAA），细胞分裂素（CTK）测定玉米素核苷（ZR）和二氢玉米素核苷（DHZR）两类，赤霉酸（GA3），脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）。
2、免疫法测定，试剂盒购自北京农业大学化控研究室。
3、试剂1）包被缓冲液：称取1.5g Na2CO3，2.93g NaHCO3，用量筒加1000ml蒸馏水，pH为9.6。
2）磷酸缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.96g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1000ml 蒸馏水，pH为7.5。
3）样品稀释液：100ml PBS 中加0.1ml Tween-20，0.1g 明胶（稍加热溶解）。
4）底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7·H2O（柠檬酸），18.43g Na2HPO4·12H2O，溶解定容至1000ml，再加1ml Tween-20，pH为5.0。
5）洗涤液：PBS加1ml Tween-20。
6）终止液：2mol/L H2SO4。
7）提取液：80%甲醇，内含1mmol/L BHT （二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，在配成80%的浓度）。
8）激素包被抗原、各激素抗体和标准物。
9）酶标二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体。
4、样品中激素的提取1）称取0.5—1g 新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20℃的低温冰箱中），分三次加入3ml 样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，摇匀后放置在4℃冰箱中。
2）4℃下提取4h，1000g 离心15min，取上清液。
沉淀中加1ml 提取液，搅匀，置4℃下再提取1h，离心，合并上清液，残渣弃去。
3）上清液过C-18固相萃取柱。
具体步骤是：80%甲醇（1ml）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循环。
不同休眠玉米种子内源激素的含量测定和分析
犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５１３６犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀吴元奇，冷亦峰，夏超，周树峰，兰海．不同休眠玉米种子内源激素的含量测定和分析．草业学报，２０１５，２４（１２）：２１３ ２１９．ＷＵＹｕａｎ Ｑｉ，ＬＥＮＧＹｉ Ｆｅｎｇ，ＸＩＡＣｈａｏ，ＺＨＯＵＳｈｕ Ｆｅｎｇ，ＬＡＮＨａｉ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅｓｉｎｍａｉｚｅｓｅｅｄｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｒｍａｎｃｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（１２）：２１３ ２１９．不同休眠玉米种子内源激素的含量测定和分析吴元奇１，冷亦峰２，夏超１，周树峰１，兰海１（１．四川农业大学玉米研究所，农业部西南玉米生物学与遗传育种重点实验室，四川成都６１１１３０；２．四川省农业科学院作物所，四川成都６１００６６）摘要：本研究利用高效液相色谱法，对７个不同休眠性的玉米自交系鲜种子内源激素ＺＴ、ＧＡ３、ＩＡＡ和ＡＢＡ的含量进行了测定和分析。
分析了各种激素及其相互作用对玉米种子休眠的影响，为阐明玉米种子休眠机理奠定了基础。
结果表明，ＺＴ含量在一定程度上与种子休眠性呈负相关性，具有对种子萌发抑制物的拮抗作用；ＧＡ３具有解除休眠和促进萌发的功能，在种子萌发过程中是必需的；ＩＡＡ与休眠不具有相关性；ＡＢＡ具有拮抗ＧＡ３的作用，诱导种子休眠，抑制萌发。
种子的休眠是几种激素综合作用的结果，种子休眠程度与种子内起促进作用和起抑制作用的激素之间的比例密切相关。
强休眠特性玉米自交系具有以下特征：ＺＴ和ＧＡ３含量低，ＡＢＡ含量高，ＺＴ／ＡＢＡ值与ＧＡ３／ＡＢＡ值较小，各激素相对平衡。
关键词：玉米；种子休眠；内源激素；高效液相色谱 犆狅犿狆犪狉犪狋犻狏犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犲狀犱狅犵犲狀狅狌狊犺狅狉犿狅狀犲狊犻狀犿犪犻狕犲狊犲犲犱狊狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱狅狉犿犪狀犮狔犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊ＷＵＹｕａｎ Ｑｉ１，ＬＥＮＧＹｉ Ｆｅｎｇ２，ＸＩＡＣｈａｏ１，ＺＨＯＵＳｈｕＦｅｎｇ１，ＬＡＮＨａｉ１１．犕犪犻狕犲犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犅犻狅犾狅犵狔犪狀犱犌犲狀犲狋犻犮犐犿狆狉狅狏犲犿犲狀狋狅犳犕犪犻狕犲犻狀犛狅狌狋犺狑犲狊狋犚犲犵犻狅狀，犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲，犛犻犮犺狌犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犆犺犲狀犵犱狌６１１１３０，犆犺犻狀犪；２．犆狉狅狆犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犛犻犮犺狌犪狀犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻 犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犆犺犲狀犵犱狌６１００６６，犆犺犻狀犪犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｓｔｕｄｙｈａｓｂｅｅｎｕｎｄｅｒｔａｋｅｎｔｏｃｌａｒｉｆｙｍａｉｚｅｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｆｏｕｒｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒ ｍｏｎｅｓ ｚｅａｔｉｎ（ＺＴ），ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ（ＧＡ３），ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ＩＡＡ）ａｎｄａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ（ＡＢＡ）ｉｎ７ｍａｉｚｅｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓｗｉｔｈｄｉｖｅｒｓｅｄｏｒｍａｎｃｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄａｎｄａｎａｌｙｓｅｄｂｙＨＰＬＣ．Ｗｅａｎａｌｙｓｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｆｏｕｒｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅｓｏｎｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ＲｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＺＴｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙ，ｗｉｔｈａｎａｎｔａｇｏｎｉｓｍｔｏｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＧＡ３ｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｃａｎｈｅｌｐｂｒｅａｋｄｏｒｍａｎｃｙ．ＩＡＡｈａｓｎｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙ．ＡＢＡｐｒｏｍｏｔｅｄｄｏｒｍａｎｃｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈａｎａｎｔａｇｏｎｉｓｍｔｏＧＡ３．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙｗａｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅ ｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｏｕｒｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｍａｉｚｅｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓｗｉｔｈｓｔｒｏｎｇｄｏｒｍａｎｃｙｈａｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｒａｉｔｓ：ｌｏｗｃｏｎｔｅｎｔｏｆＺＴａｎｄＧＡ３，ｈｉｇｈｃｏｎｔｅｎｔｏｆＡＢＡ，ｌｏｗｖａｌｕｅｓｏｆＺＴ／ＡＢＡａｎｄＧＡ３／ＡＢＡ，ａｎｄｂａｌａｎｃｅｄｈｏｒ ｍｏｎｅｃｏｎｔｅｎｔ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｍａｉｚｅ（犣犲犪犿犪狔狊）；ｄｏｒｍａｎｃｙ；ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅｓ；ＨＰＬＣ第２４卷 第１２期Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１２草 业 学 报ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ２０１５年１２月Ｄｅｃ，２０１５收稿日期：２０１５ ０３ １１；改回日期：２０１５ ０６ ２９基金项目：国家“８６３”计划（２０１１ＡＡ１０Ａ１０３）和四川省科技厅应用基础项目（２０１４ｊｙ００４８）资助。
HPLC测定内源激素
样品处理：各类试材均是在生长季的某一个或两个时期摘取1—5个新梢的中部叶片4-6个，做好标记后存放于冰瓶中迅速带回实验室。
在室内洗净灰尘杂物并吸干水分后，放入冷冻离心机冷冻干燥，研碎放入小塑料袋中置于-30℃冰箱中备用。
（1）激素的提取：称取0.1g由不少于4片叶子或其部分构成。
将称好的样品放入离心管中，用含有30ug/ml的二乙基二硫代氨基甲酸钠（抗氧化剂）的100%冷已氰为浸提液，浸提3次，第一次加入5ml浸提液晃匀后将离心管密封置于0℃冰箱中静置浸提12小时左右，离心，上清液倒入小玻璃瓶，第二次加入4ml，在振荡器上以230转/分钟速度振荡提取2小时（最好3小时）后离心，第三次加入2ml提取液清洗残渣，离心，8000rpm，10min，都倒入小玻璃瓶中。
（多提一次，第4次再加2ml）（2）第一次减压浓缩及溶解：将合并后的提取液倒入蒸馏瓶中，在37-40℃条件下减压浓缩至干，而后加入pH为8.0的0.4M磷酸缓冲液2ml和2ml三氯甲烷洗涤，倒入小玻璃瓶中。
用3ml0.4M磷酸缓冲液洗涤两次，再加入2ml三氯甲烷刷洗蒸馏瓶，倒入小玻璃瓶中。
（3）去除色素：首先将盛有溶解液的玻璃瓶封口在4℃振荡器上振荡20min，而后用移液器抽取下层三氯甲烷，弃去，然后加入2ml三氯甲烷进行第二次去除色素。
如果水相中仍有色素可重复上一步进行第三次色素去除。
（一定要去干净色素）（4）去除酚类杂质：对三氯甲烷萃取的水相溶液（体积计数），倒入离心管，加入150mg不溶性的聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），上下振荡，离心8000rpm，10min。
（5）植物激素的萃取：移液器取上清液3ml（10ml），滴加纯甲酸直pH试纸为3.0，（经验值130ul左右）往此水相中加入乙酸乙酯振荡（3ml），移液器提取脂相（上部），其水相用乙酸乙酯萃取两次（2ml，2ml），合并所得脂相。
（6）第二次浓缩及进一步纯化：所得到酯相倒入蒸馏瓶中，在37-40℃下减压蒸干。
高效液相色谱法快速分析植物内源性激素
高效液相色谱法快速分析植物内源性激素植物内源性激素在植物生长和发育过程中起着重要的调节作用。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）作为一种先进的分析技术，被广泛地用于植物内源性激素的定量分析和研究。
通过快速、准确地分析植物内源性激素，我们可以深入了解植物的生长和发育调控机制，为农业生产和植物育种提供重要的理论指导和实践应用。
一、植物内源性激素的概述植物内源性激素是一类在植物体内合成和调节生长发育的化合物，包括生长素、赤霉素、脱落酸、激素酮、保护素和亚硫酸氨基酸等。
它们在调节植物生长和发育过程中发挥着不可或缺的作用，如控制细胞分裂和伸长、调节根系和茎的形态发育、调控开花和果实发育等。
了解植物内源性激素的合成、分布和调控机制对于揭示植物的生长发育规律具有重要意义。
二、高效液相色谱法在植物内源性激素分析中的优势高效液相色谱法是一种在液相中进行分离和测定的分析技术，具有分离能力强、选择性好、分析速度快以及样品处理简单等优点，因此被广泛应用于植物内源性激素的定量分析中。
与传统的色谱方法相比，高效液相色谱法具有以下几个优势：1.分离能力强：高效液相色谱法能够有效地将混合样品中的激素物质分离出来，得到高纯度的化合物。
这一点对于复杂的植物组织和生理液体样品分析尤为重要。
2.选择性好：高效液相色谱法能够通过调整色谱柱、流动相和检测器等条件，实现对不同内源性激素的选择性分离和测定，从而提高了分析的准确性和可靠性。
3.分析速度快：高效液相色谱法具有快速分析的特点，一般可以在几分钟到几十分钟内完成一次分析，提高了实验效率。
4.样品处理简单：高效液相色谱法在样品处理时通常只需简单的提取和净化步骤，可以大大简化实验过程，提高了实验效率。
三、高效液相色谱法快速分析植物内源性激素的方法高效液相色谱法快速分析植物内源性激素的方法主要包括激素提取、净化和检测。
根据不同植物内源性激素的特性和含量，可以选择不同的样品处理方法和色谱条件。
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HPLC 测定内源激素
样品处理：各类试材均是在生长季的某一个或两个时期摘取1-5个新梢的中部叶片4-6片，做好标记存放于冰瓶中迅速带回实验室，在室内洗净灰尘杂物并吸干水分后，放入冷冻离心机冷冻干燥，研碎放入小塑料袋中置于-30℃冰箱中备用。
（1）激素的提取：
秤取0.1g由不少于4片叶子或其他部分构成，将称好的样品放入离心管中，用含有30ug/ml的二乙基二硫代氨基甲酸钠（抗氧化剂）的100%冷乙腈为浸提液，浸提三次，第一次加入10ml浸提液晃匀后将离心管密封置于0℃冰箱中静止浸提12小时左右，离心，上清液倒入小玻璃瓶，第二次加入5ml，在振荡器上以230转/分速度震荡提取2小时后离心，第三次加入3ml提取液清洗残渣，离心，都倒入小玻璃瓶中。
（2）第一次减压浓缩及溶解
将合并后的提取液倒入蒸馏瓶中，在37-40℃条件下减压浓缩至干，而后加入PH为8.0的0.4M的磷酸缓冲液2ml和2ml的三氯甲烷洗涤，倒入小玻璃瓶中。
用3ml 0.4M的磷酸缓冲液洗涤两次，再加入2ml三氯甲烷刷洗蒸馏瓶，倒入小玻璃瓶中。
（3）去除色素
首先将盛有溶解液的玻璃瓶封口在振荡器上振荡20min,而后用移液器抽取下层三氯甲烷，弃去，然后加入2ml三氯甲烷进行第二次去除色素。
如果水相中仍有色素则可重复上一步进行第二次色素去除。
(4)去除酚类杂质
对三氯甲烷萃取的水相溶液，倒入离心管，加入150mg不溶性的聚乙烯吡咯烷酮（pvpp）,上下震荡，离心8000rpm,10min.
(5) 植物激素的萃取
移液器取上清液3ml, 滴加纯甲酸直至PH试纸为3.0，（经验值100ul左右），往此水相中加入乙酸乙酯振荡（3ml），移液器提取酯相（上层），其水相再用乙酸乙酯萃取两次（2ml, 2ml），合并所得酯相。
（6）第二次浓缩及进一步纯化
所得酯相倒入蒸馏瓶中，在37-40℃下减压蒸干，蒸干物用1ml色谱流动相溶解。
（7）溶解及过滤办法
由于最后溶解液1ml流动相即是HPLC上机样品，所以一定要在蒸馏瓶完全蒸干前提下一次性用移液管准确加入1ml,并充分溶解瓶内蒸干物质，尽量是瓶内溶液浓度均一，而后直接倒入干燥无水的滤膜过滤器的针筒中进行加压并使溶液通过直径为0.45um的水相微孔滤膜，压滤液存放于1.5ml离心管中用于上机测
定。
流动相配制：
甲醇：0.5%乙酸（55：45）
流速： 1ml/min
仪器准备：小玻璃瓶，10ml塑料离心管， 1.5ml离心管， 5ml玻璃注射器，过滤头，0.45um或0.22um的滤膜，1ml移液枪，枪头
磷酸盐缓冲液（0.4M phosphate buffer）
试剂：NaH2PO4.2H2O Na2HPQ4.12H2O
配制方法：
先配制0.4M的NaH2PO4和Na2HPQ4，两者按一定比例混合
（1）0.4M 的NaH2PO4：秤取NaH2PO4.2H2O 62.4g 或NaH2PO4.H2O 55.2g）加重蒸水至1000ml溶解
（2）0.4M 的Na2HPQ4：秤取Na2HPQ4.12 H2O 143.264g或Na2HPQ4.7 H2O 107.2g 或Na2HPQ4.2 H2O 71.2g, 加双蒸水至1000ml溶解
PH 0.4 M 的NaH2PO4(ml) 0.4M 的Na2HPQ4(ml)
7.0 39.0 61.0
7.1 33.0 67.0
7.2 28.0 72.0
7.3 23.0 77.0
7.4 19.0 81.0
7.5 16.0 84.0
7.6 13.0 87.0
7.7 10.5 89.5
7.8 8.5 91.5
7.9 7.0 93.0
8.0 5.3 94.7。