HPLC测定内源激素
羊柴种子去荚、低温层积处理后萌发特性及HPLC法测定内源激素ABA、IA
倍， 达到饱和期 所用时 间约为带荚种子 的 １ ／ ２ ； 羊 柴 种 子 去 荚 处理 后 发 芽 率 、 发 芽指数最 高 ， 分 别 为
８ １ ． ６ ７ ％、 ３ ３ ． ２ ７ ， 为对照组的 ８ ． １ ６ ７ 、 ３ ８ ． ３ ９ 倍， 带 荚种 子低 温层 积 处理 ６ ０ 天 后 发 芽率 、 发 芽指 数 次 之 ， 为 ４ ６ ． ６ ７ ％、 ４ ． １ ９ ； Ｃ Ｋ组 抑 制物 Ａ Ｂ Ａ含 量 最 高 ， 达７ ９ ２ １ ． １ ２ ｎ ｇ ／ ｍＬ， 经过 ８ Ｏ 天低 温层 积 处理 后 ＡＢ Ａ含 量 降至
低 温层 积 处理 。
关 键词 ： 羊柴 ； 荚； 去荚 ； 发 芽率 ； 低 温层 积 ； ＡＢ Ａ 中图分 类号 ： Ｏ９ ４ 文献 标志 码 ： Ａ 论 文编 号 ： ２ ０ １ ４ ． ２ ５ ４ ５
Ｇｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｃｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ａ ｎ ｄ Ｅｎ ｄ ｏ ｇ ｅ ｎ ｏ ｕ ｓ ＡＢＡ． Ｉ ＡＡ Ｃｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ Ｃｈ ａ ｎ ｇ ｅ ｗｉ ｔ ｈ ＨＰ ＬＣ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｓ ｅ ｅ ｄ ｏ ｆ Ｈｅ ｄ ｙ ｓ ａ ｒ ｕ ｌ ｌ ｌ ｌ ａ ｅ ｖ ｅ Ｍａ ｘ ｉ ｍ Ｄｕ ｒ ｉ ｎ ｇ Ｓ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｆ ｙ ｉ ｎｇ ， Ｓ ｈｅ ｌ ｌ ｉ ｎ ｇ
Ｎ ｉ ｕ Ｙ ａ ｊ ｉ ｅ ， Ｙ ｕ ａ ｎ Ｊ ｉ ｎ ｆ ｅ ｎ ｇ ， Ｃ ｈ ｅ ｎ Ｈｏ ｎ ｇ ｘ ｉ ａ ｎ ， Ｄ ｏ ｎ ｇ Ｑ ｉ ａ ｎ ｑ ｉ ａ ｎ ， Ｆ ａ ｎ Ｙ ａ ｌ ｉ ， Ｗａ ｎ ｇ Ｘ ｉ ａ ｏ ｆ ｅ ｎ ｇ ， Ｌ ｉ ｕ Ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ ｈ ｕ ａ
高效液相色谱法分离和测定小麦中的5种内源激素
高效液相色谱法分离和测定小麦中的5种内源激素张玉琼;仲延龙;高翠云;董召荣;陈娜;王梅方【摘要】A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed to determine the five endogenous hormones including indole-3-acetic acid (IAA),abscisic acid (ABA),gibberellic acid (GA3),zeatin (ZT) and salicylic acid (SA) in wheat.The separation conditions were optimized,and methanol was chosen as the extraction solvent.Then the extract was extracted by petroleum ether and ethyl acetate,and purified with the Sep-Pak C18 column.The chromatographic conditions were as follows:Eclipse XDB-C18 reversed phase column (250 mm ×4.6 mm,5 μm),the flow rate of 1 mL/min,the injection volume of 10 μL,and the detection wavelength of 240 nm were used for the separation of SA from 14.5 min to 18 min,while the detection at 254 nm used for the separation of the others.Methanol (A) and acetic acid aqueous solution (pH 3.6) (B) were used as the mobile phases with the linear gradient set as follows:0-7 min 20％ A,7-10 min 20％A-28％ A,10-17 min 28％ A,17-19min 28％ A-40％ A,19-35 min 40％ A.The results showed that:the hormones were separated well with the recoveries of 96.9％-98％,and the RSDs were in the range of 1.54％ to 2.29％.It is a reliable method for rapid,accurate separation and determination of the endogenous hormones in wheat.%建立了高效液相色谱法(HPLC)用于分离和测定小麦中的吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、玉米素(ZT)和水杨酸(SA)5种植物内源激素.经过条件优化,选用甲醇作为样品提取溶剂.然后,经石油醚和乙酸乙酯萃取,经Sep-Pak C18小柱纯化.液相色谱的分离采用Eclipse XDB-C18(250 mm ×4.6 mm,5μm)反相色谱柱；流速为1 mL/min；进样量10μL.检测器波长设置为254 nm; 14.5 min时切换到240 nm; SA洗脱后即18min时切换回254 nm.流动相A为甲醇,B为乙酸溶液(pH 3.6).梯度条件为0～7 min,20％A；7～10 min,20％A～ 28％A；10～17 min,28％A；17 ～ 19 min,28％ A～40％ A; 19 ～35 min,40％A.结果表明,小麦中各激素的分离效果理想,加标回收率达96.9％～ 98％,相对标准偏差在1.54％～ 2.29％之间.因此,该方法的建立为快速、准确地分离和测定小麦内源激素提供了可靠的方法.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2013(031)008【总页数】4页(P800-803)【关键词】高效液相色谱法;内源激素;小麦【作者】张玉琼;仲延龙;高翠云;董召荣;陈娜;王梅方【作者单位】安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽农业大学农学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036【正文语种】中文【中图分类】O658植物激素对植物的种子萌发、生长、开花、成熟、衰老、休眠等生命活动起直接或间接的调节、控制作用［1，2］。
竹子内源激素HPLC测定方法改良
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第３
研
究
汇
刊
Ｖ０． ０．Ｎｏ ４ １３ ．
Ｎｏ ．，２ ０ １ ｖ １
２０１１年 １１月
Ｊ ＲＮＡ ＡＭＢ Ｓ ＡＲＣ ＯＵ Ｌ ＯＦ Ｂ ＯＯ ＲＥ Ｅ Ｈ
竹子内源激 素 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ测定方法改 良
方 楷 杨光耀 杨 清培 施建 敏 于 芬 刘腾 飞
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GPC-HPLC-MS·MS测定植物组织中IAA与 ABA的方法
Advances in Analytical Chemistry 分析化学进展, 2017, 7(2), 131-138Published Online May 2017 in Hans. /journal/aachttps:///10.12677/aac.2017.72018Determination of IAA and ABA in PlantTissue by the GPC-HPLC/MS/MSLiu Yang1, Shuai Liu1, Zongyi Wang2, Qingqin Cao3, Jianli Wang1, Yu Xing1, Ling Qin1*1Beijing Key Laboratory of New Technology in Agricultural Application, College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing2Beijing Key Laboratory of Safety Detection and Control on Harmful Microbes and Pesticide Residues inAgricultural Products, Beijing University of Agriculture, Beijing3College of Biological Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing CollaborativeInnovation Center for Eco-Environmental Improvement with Forestry and Fruit Trees, Beijing University ofAgriculture, BeijingReceived: May 8th, 2017; accepted: May 24th, 2017; published: May 27th, 2017AbstractThe effectiveness and efficiency of the plant hormone detection is a prerequisite for plant re-search. The sample was purified with the GPC system, and the method employed HPLC-MS/MS for multiple reaction monitoring of concentrations of IAA, ABA, and deuterated IAA and ABA analogs. The condition of extraction and purification of hormones were optimized by orthogonal design. The results show that the composite of 0.5 g samples, 80% methanol extraction solvent, concentration temperature 35˚C and C18 cartridge column for solid-phase extraction (SPE), were optimal extraction procedure for each type of plant tissue. The contents of IAA and ABA as high as 20.34 ng/g and 789.3 ng/g were achieved by this method, respectively; the detectable limits were 2.36 ng/g and 31.95 ng/g; the recoveries were 70.43% and 80.17%; the RSD were1.87% and2.26%.KeywordsLiquid Chromatography-Mass Spectrometry, Purifying-Quantitative-Concentrated More OnlineSystem, Internal Standard Method, Indole-3-Acetic, Abscisic AcidGPC-HPLC-MS/MS测定植物组织中IAA与ABA的方法杨柳1，刘帅1，王宗义2，曹庆芹3，王建立1，邢宇1，秦岭1**通讯作者。
_高效液相色谱测定多种植物内源激素方法研究
四川农业大学学报 1997年 15 (3):297—299J .Sichuan Agric.Univ. 1997-01-24收稿。
高效液相色谱测定多种植物内源激素方法研究 谢 君 (四川农业大学分析测试中心/雅安市625014)摘 要 研究高效液相色谱法测定赤霉素(GA 3)、3-吲哚乙酸(IAA )、脱落酸(ABA )、玉米素(ZT )和激动素(KT )等五种植物激素的条件;采用Spherso rbC 18柱,乙腈-甲醇-0.6%乙酸流动相,检测波长254nm;建立了一种从植物中提取五种激素的样品处理方法,实际分析了植物样。
关 键 词 植物激素[45N D,49LD] 高效液相色谱中图分类号 O657.72;Q946.885引 言 植物内源激素的研究是植物生理学领域中的重要内容之一,植物的内源激素与植物生长发育的基本规律和代谢过程的调节控制都密切相关。
因此植物内源激素的准确测定,对植物生命活动和作物遗传育种栽培领域的研究具有重要的意义。
高效液相色谱(HPLC)是较理想的植物内源激素分析方法,由于在联合测定植物组织抽提液中的多种内源激素时,经常见到分离差、峰型不良及严重拖尾现象,因此选择合适的内源激素提取方法和色谱条件较为重要。
本研究采用反相HPLC 法探讨了GA 3、IAA 、ZT 和K T 等五种植物内源激素联合测定的色谱分析条件,并获得满意的分离结果。
有关HPLC 分析植物内源激素,多见于GA 3、IAA 、ABA 的联合测定[1-4],而五种激素的联合分析尚未见报道。
1实验部分1.1仪器与试剂 日本岛津LC -6A HPLC 系统,包括LC-6A 高压溶剂输送泵;SPD-6AV 紫外可见检测器;LC-6A 系统控制器;C-R3A 色谱处理器;C TO-6A 柱温箱;旋转蒸发器;0.3μm 超微滤膜;萃取装置;直型层析柱等。
GA 3、IAA 、ABA 标准品均由FLUK A 公司提供;ZT 、K T 由中国科学院上海生物化学研究所提供;石油醚(30-60℃)、Ca-CO 3为优级纯;其它试剂均为分析纯;乙腈为色谱纯,甲醇为AR 重蒸;实验用水均为二次蒸馏水。
超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性内源激素的含量
超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性内源激素的含量摘要:利用超高效液相色谱法同时测定柑橘(Citrus reticulate Bance)果肉中的玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸的含量｡以C8色谱柱,甲醇-0.1%冰乙酸为流动相梯度洗脱,检测波长为262 nm,流速0.22 mL/min｡结果表明, 玉米素含量在0.14~0.38 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 5,平均回收率为98.7%,RSD为0.99%;赤霉素含量在0.67~1.79 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 3,平均回收率为98.6% ,RSD 为0.70%;吲哚乙酸含量在0.25~0.67 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 6,平均回收率为99.0% ,RSD为0.68%;脱落酸含量在0.036~0.096 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 9,平均回收率为99.1% ,RSD为0.61%｡该方法简便､快速､精密度高､准确性好,可用于植物样品中激素含量的测定｡关键词:柑橘(Citrus reticulate Bance);植物激素;超高效液相色谱法Determination of Four Endogenous Hormones in Orange Pulp by UPLC Abstract: Determination of four endogenous hormones such as zeatin (ZT), gibberellin (GA), indole acetic acid (IAA) and abscisic acid (ABA) was proceeded by UPLC. The method used a C8 column, and adopted the gradient elution method with methanol-0.1% acetic acid as mobile phase and the UV detection wavelength was 262 nm, and flow rate was 0.22 mL/min. The calibration curve of ZT was linear between 0.14 μg/mL and 0.38 μg/mL, R2 was 0.999 5, the average recovery was 98.7%, and RSD was 0.99%.The calibration curve of GA was linear between 0.67 μg/mL and 1.79 μg/mL, R2 was 0.999 3, the average recovery was 98.6%, and RSD was 0.70%.The calibration curve of IAA was linear between 0.25 μg/mL and 0.67 μg/mL, R2 was 0.999 6, the average recovery was 99.0%, and RSD was 0.68%. The calibration curve of ABA was linear between 0.036 μg/mL~0.096 μg/mL, R2 was 0.999 9, the average recovery was 99.1%, and RSD was 0.61%. This method was proved to be simple, precise, accurate and could be used for the quality control of hormone content in the plant samples.Key words: Orange pulp(Citrus reticulate Bance); plant hormone; UPLC植物性内源激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的微量有机物,其生理效应复杂多样,对植物生长发育有重要的调节控制作用[1,2]｡吲哚乙酸､赤霉素､脱落酸､玉米素是植物体广泛存在的植物激素,本研究运用超高效液相色谱(UPLC)法同时测定柑橘中这4种内源激素,利用UPLC超高分离度､快速､超高灵敏度的优点,解决传统HPLC在植物激素分析中存在的分离度差,分析时间较长的缺点｡本研究建立了植物内源激素高效､稳定､准确的分离和测定方法,为植物内源激素调节其营养生理与生长的研究提供支撑｡吲哚乙酸(IAA)是一种植物体内普遍存在的含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素,属吲哚类化合物,又名生长素,其基本作用在于调节植物生长;赤霉素(GA)是一类属于双萜类化合物的植物激素,典型生理作用是能促进枝条的生长,尤其是能促进无伤害植物的整体生长;脱落酸(ABA)是一种具有倍半萜结构的抑制生长的植物激素,因能促使叶子脱落而得名,具有加速植物器官脱落,抑制整株植物或离体器官的生长,并对细胞的分裂与生长起抑制等作用;玉米素(Zeatin)是一种天然的细胞分裂素,化学名称为6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤,它是从甜玉米灌浆期的子粒中提取并结晶出的第一个天然细胞分裂素,能刺激植物细胞分裂,促进叶绿素形成,加速植物新陈代谢和蛋白质的合成,从而达到有机体迅速增长,促使作物早熟丰产,提高植物抗病抗衰抗寒能力｡1 材料与方法1.1 仪器和试剂ACQUITY Uitra Performance LC超高效液相色谱系统,Empower色谱工作站,检测器:PDA eλ Detector紫外检测器(Waters公司);台式系列数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)｡玉米素标准品(Sigma公司,纯度87.0%);赤霉素标准品(SUPELCO公司,纯度96.5%);吲哚乙酸(Riedel-de Haen公司,纯度99.0%);脱落酸(Sigma公司,纯度99.0%);甲醇(色谱纯);冰乙酸(分析纯);超纯水;C18柱(500 mg/6 mL,美国赛分科技公司)｡1.2 实验方法1.2.1 样品采集实验所用的柑橘样品均采自广西全州｡在不同时间共采集6组样品｡摘取生长中的柑橘果实,迅速放入冰盒中带回实验室,-20℃保存备用｡1.2.2 色谱条件色谱柱:ACQUITYUPLCRBEH130 C8,1.7 μm(2.1×50 mm);流动相:甲醇-0.1%冰乙酸梯度洗脱;流速0.22 mL/min;检测波长为262 nm;柱温为25 ℃｡1.2.3 标准溶液的制备分别精密称取玉米素､赤霉素､吲哚乙酸､脱落酸标准对照品0.12､0.28､0.21､0.15 mg置于50 mL容量瓶中,50%甲醇溶解定容,配制浓度分别为2.4､5.6､4.2､3.0 μg/mL的标准储备溶液｡1.2.4 样品溶液的制备称取已匀浆的柑橘果肉5.000 0 g置于25 mL容量瓶中,用80%甲醇溶解,冰水浴超声45 min,取出恢复常温后,80%甲醇定容,过滤,取过滤液10 mL于10 mL分度比色管,氮吹去除甲醇,残留液于C18柱中脱色,用6.0 mL 流动相分3次洗脱,用10 mL分度比色管收集所有从C18柱的流出液,流动相定容至8.0 mL,用0.22 μm有机滤膜过滤,滤液即为待测液｡1.2.5 四种植物激素混合标准曲线的制备分别吸取玉米素､赤霉素､吲哚乙酸及脱落酸标准储备溶液0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6 mL于6个10 mL容量瓶中,流动相定容至刻度,依次进样,进样体积为5.0 μL｡2 结果与分析2.1 提取方法的确定据文献报道,玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸4种激素可采用67%的丙酮水溶液[1]､0.5 moL/L NaOH溶液[3]､80%甲醇水溶液[4]等溶剂提取,石油醚､乙酸乙酯､PVP和C18柱等方式净化,根据4种激素对时间和热不稳定[4],易发生降解反应,所以在实验操作过程中应注意控制时间及温度,本试验通过对不同的提取溶剂,提取方式(超声提取､过夜浸提)､提取时间､提取次数分别做单因素考察实验,最终确定以80%甲醇为提取剂,冰水浴超声提取45 min,C18柱净化为最佳实验条件｡2.2 色谱条件的选择2.2.1 色谱柱的选择植物样品中含杂质量较多,分离难度较大｡UPLC选用粒径低于2 μm的小颗粒作为填料,比普通HPLC有更高的分离度､灵敏度和分析速度,因此对分离测定植物样品中的4种激素具有较大的优势｡本实验选用ACQUIY UPLC BEH130 C18 1.7 μm(2.1×100 mm)､ACQUIY UPLC BEH C8 1.7 μm(2.1×50 mm)和ACQUIY UPLC BEH C18 1.7 μm(2.1×50 mm)分别对样品进行分离测定,结果显示用ACQUIY UPLC BEH C8 1.7 μm(2.1×50 mm)能够对样品进行很好的分离｡2.2.2 波长的选择将4种激素的混合标准溶液于ACQUITY超高效液相色谱系统上进行测定,PDA紫外检测器对其进行光谱扫描,最大吸收光谱的波长分别为:玉米素(ZT)在204 nm和271 nm有吸收峰,赤霉素(GA)在192 nm和252 nm有吸收峰,吲哚乙酸(IAA)在218 nm和279 nm有吸收峰,脱落酸(ABA)在194 nm和261 nm有吸收峰｡将4种激素的混合标准液分别在以上多个波长下进行测定,发现在波长为262 nm下标准混合液出峰基线毛刺少且峰形较好,玉米素､吲哚乙酸和脱落酸的峰面积为最高,赤霉素峰面积也变化较少,所以本实验采用262 nm为4种激素的检测波长｡4种激素的吸收光谱图见图1｡2.2.3 流动相的选择根据4种激素的特性及植物样品所含的杂质量,通过对各种流动相如甲醇-水､乙腈-水､甲醇-乙酸-水､乙腈-乙酸-水等不同溶液系统的尝试,最终选用甲醇和0.1%冰乙酸-水溶液为流动相｡经反复试验后,发现甲醇和0.1%冰乙酸-水溶液在梯度洗脱的条件下,各组分分离较好,且各峰峰型较好,分析时间也较短｡4种激素保留时间合适,色谱图见图2;流动相比例见表1｡2.3 线性关系以对照品进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,将所得数据绘成标准曲线,玉米素线性方程为:Y=593.810X-43.469,R2=0.999 5,线性范围0.14~0.38 μg/mL;赤霉素线性方程为:Y=48.948X-19.105,R2=0.999 3,线性范围0.67 ~1.79 μg/mL;吲哚乙酸线性方程为:Y=315.500X-43.471,R2=0.999 6,线性范围0.25~0.67 μg/mL;脱落酸线性方程为:Y=6 481.000X-136.610,R2=0.999 9,线性范围0.036~0.096 μg/mL｡结果见图3-图6｡2.4 精密度试验精密吸取玉米素､赤霉素､脱落酸和吲哚乙酸混合标准溶液各5.0 μL,重复进样5次,测定峰面积,玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸标准溶液峰面积的RSD分别为0.39%､0.47%､0.29%､0.25%｡表明方法精密度良好｡2.5 重复性试验同一批柑橘样品取样5份,按1.2.4操作,依法测定,计算玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸的含量,RSD分别为3.64%､2.48%､2.78%､3.15%｡表明方法重复性良好｡2.6 回收率试验称取已知含量的样品9份,加入玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸标准溶液5.0､7.5､10.0 mL各3份,按1.2.4进行操作测定,计算回收率,结果(表2-表5)表明,回收率在98.6%~99.1%,RSD在0.61%~0.99%,表明方法回收率较好｡3 小结与讨论以80%甲醇为提取剂,冰水浴超声提取45 min,C18柱净化为最佳实验条件,甲醇和0.1%冰乙酸为流动相,流速0.22 mL/min梯度洗脱,UPLC系统对样品进行测定,样品中4种激素能在7 min之内达到较好的分离｡充分利用了超高效液相色谱的优点与有利条件,建立的方法简单可靠,进一步拓宽了液相色谱在植物激素测定方面的应用｡参考文献:[1] 刘贤明,梁锦添,秦绪雄.用高效液相色谱分析植物内源激素吲哚-3-乙酸､脱落酸和玉米素[J].色谱,1996,8(1):340-341.[2] 陈小鹏,王秀峰,孙小镭,等.高效液相色谱测定黄瓜瓜条中赤霉素和脱落酸含量[J].山东农业科学,2005(1):65-67.[3] 郑春霞,王强,阮晓.HPLC分离测定香梨三种植物激素[J].新疆农业大学学报,2000,23(1):54-56.[4] 陈波浪,郑春霞,盛建东,等. HPLC分离和测定棉花中3种植物激素[J].新疆农业大学学报,2006,29(1):28-30.。
液相色谱-串联质谱法测定尿液中的内源性类固醇激素
。因 此， 内源性类固醇激素的检
测及判定是近年来研究的热点。 , , 内源性类固醇是自身合成的激素， 包括睾酮、 表
收稿日期： !""( ,"# ,$) 第一作者： 王萌烨， 硕士研究生 * -,."/) ："$*#"’( + 0$1"#* 21$* 3#*
通讯联系人： 沈 , 敏， 研究员 * 42) ： （ "!$ ） *!)%$$’# ，-,."/) ：./#562#5071 + 6(8."/)* 3(.* 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （ +(* !""’(*")( ） *
尿样经葡萄糖醛酸甙酶酶解后进行液液提取以甲醇后尿液中内源性类固醇激素的变化情况结果表明该方法样品处理简便色谱分离完全结果准确可靠可替代气相色谱谱法用于体液中内源性类固醇激素兴奋剂的常规分析
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睾 酮、脱 氢 表 雄 酮（ 126&1%(2N/"#1%(582%(#2 ， ?@-A ） 、 雄酮以及苯胆烷醇酮等。其中 ?@-A 是多 种类固醇激素的重 要 前 体， 它在体内可通过多种途 径代谢为雄酮、 苯胆 烷 醇 酮 以 及 睾 酮 等 不 同 的 内 源
)］ 性类固醇 激 素［4;* ］ 务［ "" ， 。
! ! 本文 对 尿 样 先 用 葡 萄 糖 醛 酸 甙 酶 酶 解 后 采 用 液 ! 液提 取 法 提 取， 以 甲 基 睾 酮 为 内 标， 建立了尿液 中 ’()* 、 睾酮、 雄 酮、 苯胆烷醇酮和表睾酮等 $ 种 内源性类固醇的 +#!%& $ %& 分析 方 法， 并应用该方 法 测 定 了 健 康 受 试 者 服 用 ’()* 片 剂 后 尿 液 中 ’()* 等 $ 种内源性类固醇激素的含量。
不同休眠玉米种子内源激素的含量测定和分析
犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５１３６犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀吴元奇，冷亦峰，夏超，周树峰，兰海．不同休眠玉米种子内源激素的含量测定和分析．草业学报，２０１５，２４（１２）：２１３ ２１９．ＷＵＹｕａｎ Ｑｉ，ＬＥＮＧＹｉ Ｆｅｎｇ，ＸＩＡＣｈａｏ，ＺＨＯＵＳｈｕ Ｆｅｎｇ，ＬＡＮＨａｉ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅｓｉｎｍａｉｚｅｓｅｅｄｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｒｍａｎｃｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（１２）：２１３ ２１９．不同休眠玉米种子内源激素的含量测定和分析吴元奇１，冷亦峰２，夏超１，周树峰１，兰海１（１．四川农业大学玉米研究所，农业部西南玉米生物学与遗传育种重点实验室，四川成都６１１１３０；２．四川省农业科学院作物所，四川成都６１００６６）摘要：本研究利用高效液相色谱法，对７个不同休眠性的玉米自交系鲜种子内源激素ＺＴ、ＧＡ３、ＩＡＡ和ＡＢＡ的含量进行了测定和分析。
分析了各种激素及其相互作用对玉米种子休眠的影响，为阐明玉米种子休眠机理奠定了基础。
结果表明，ＺＴ含量在一定程度上与种子休眠性呈负相关性，具有对种子萌发抑制物的拮抗作用；ＧＡ３具有解除休眠和促进萌发的功能，在种子萌发过程中是必需的；ＩＡＡ与休眠不具有相关性；ＡＢＡ具有拮抗ＧＡ３的作用，诱导种子休眠，抑制萌发。
种子的休眠是几种激素综合作用的结果，种子休眠程度与种子内起促进作用和起抑制作用的激素之间的比例密切相关。
强休眠特性玉米自交系具有以下特征：ＺＴ和ＧＡ３含量低，ＡＢＡ含量高，ＺＴ／ＡＢＡ值与ＧＡ３／ＡＢＡ值较小，各激素相对平衡。
关键词：玉米；种子休眠；内源激素；高效液相色谱 犆狅犿狆犪狉犪狋犻狏犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犲狀犱狅犵犲狀狅狌狊犺狅狉犿狅狀犲狊犻狀犿犪犻狕犲狊犲犲犱狊狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱狅狉犿犪狀犮狔犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊ＷＵＹｕａｎ Ｑｉ１，ＬＥＮＧＹｉ Ｆｅｎｇ２，ＸＩＡＣｈａｏ１，ＺＨＯＵＳｈｕＦｅｎｇ１，ＬＡＮＨａｉ１１．犕犪犻狕犲犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犅犻狅犾狅犵狔犪狀犱犌犲狀犲狋犻犮犐犿狆狉狅狏犲犿犲狀狋狅犳犕犪犻狕犲犻狀犛狅狌狋犺狑犲狊狋犚犲犵犻狅狀，犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲，犛犻犮犺狌犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犆犺犲狀犵犱狌６１１１３０，犆犺犻狀犪；２．犆狉狅狆犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犛犻犮犺狌犪狀犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻 犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犆犺犲狀犵犱狌６１００６６，犆犺犻狀犪犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｓｔｕｄｙｈａｓｂｅｅｎｕｎｄｅｒｔａｋｅｎｔｏｃｌａｒｉｆｙｍａｉｚｅｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｆｏｕｒｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒ ｍｏｎｅｓ ｚｅａｔｉｎ（ＺＴ），ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ（ＧＡ３），ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ＩＡＡ）ａｎｄａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ（ＡＢＡ）ｉｎ７ｍａｉｚｅｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓｗｉｔｈｄｉｖｅｒｓｅｄｏｒｍａｎｃｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄａｎｄａｎａｌｙｓｅｄｂｙＨＰＬＣ．Ｗｅａｎａｌｙｓｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｆｏｕｒｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅｓｏｎｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ＲｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＺＴｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙ，ｗｉｔｈａｎａｎｔａｇｏｎｉｓｍｔｏｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＧＡ３ｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｃａｎｈｅｌｐｂｒｅａｋｄｏｒｍａｎｃｙ．ＩＡＡｈａｓｎｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙ．ＡＢＡｐｒｏｍｏｔｅｄｄｏｒｍａｎｃｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈａｎａｎｔａｇｏｎｉｓｍｔｏＧＡ３．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙｗａｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅ ｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｏｕｒｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｍａｉｚｅｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓｗｉｔｈｓｔｒｏｎｇｄｏｒｍａｎｃｙｈａｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｒａｉｔｓ：ｌｏｗｃｏｎｔｅｎｔｏｆＺＴａｎｄＧＡ３，ｈｉｇｈｃｏｎｔｅｎｔｏｆＡＢＡ，ｌｏｗｖａｌｕｅｓｏｆＺＴ／ＡＢＡａｎｄＧＡ３／ＡＢＡ，ａｎｄｂａｌａｎｃｅｄｈｏｒ ｍｏｎｅｃｏｎｔｅｎｔ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｍａｉｚｅ（犣犲犪犿犪狔狊）；ｄｏｒｍａｎｃｙ；ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅｓ；ＨＰＬＣ第２４卷 第１２期Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１２草 业 学 报ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ２０１５年１２月Ｄｅｃ，２０１５收稿日期：２０１５ ０３ １１；改回日期：２０１５ ０６ ２９基金项目：国家“８６３”计划（２０１１ＡＡ１０Ａ１０３）和四川省科技厅应用基础项目（２０１４ｊｙ００４８）资助。
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样品处理：各类试材均是在生长季的某一个或两个时期摘取1—5个新梢的中部叶片4-6个，做好标记后存放于冰瓶中迅速带回实验室。
在室内洗净灰尘杂物并吸干水分后，放入冷冻离心机冷冻干燥，研
碎放入小塑料袋中置于-30℃冰箱中备用。
（1）激素的提取：称取0.1g由不少于4片叶子或其部分构成。
将称好的样品放入离心管中，用含有30ug/ml的二乙基二硫代氨
基甲酸钠（抗氧化剂）的100%冷已氰为浸提液，浸提3次，
第一次加入5ml浸提液晃匀后将离心管密封置于0℃冰箱中静
置浸提12小时左右，离心，上清液倒入小玻璃瓶，第二次加
入4ml，在振荡器上以230转/分钟速度振荡提取2小时（最
好3小时）后离心，第三次加入2ml提取液清洗残渣，离心，
8000rpm，10min，都倒入小玻璃瓶中。
（多提一次，第4次再
加2ml）
（2）第一次减压浓缩及溶解：将合并后的提取液倒入蒸馏瓶中，在37-40℃条件下减压浓缩至干，而后加入pH为8.0的0.4M磷
酸缓冲液2ml和2ml三氯甲烷洗涤，倒入小玻璃瓶中。
用
3ml0.4M磷酸缓冲液洗涤两次，再加入2ml三氯甲烷刷洗蒸馏
瓶，倒入小玻璃瓶中。
（3）去除色素：首先将盛有溶解液的玻璃瓶封口在4℃振荡器上振荡20min，而后用移液器抽取下层三氯甲烷，弃去，然后加入
2ml三氯甲烷进行第二次去除色素。
如果水相中仍有色素可重
复上一步进行第三次色素去除。
（一定要去干净色素）
（4）去除酚类杂质：对三氯甲烷萃取的水相溶液（体积计数），倒入离心管，加入150mg不溶性的聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），上
下振荡，离心8000rpm，10min。
（5）植物激素的萃取：移液器取上清液3ml（10ml），滴加纯甲酸直pH试纸为3.0，（经验值130ul左右）往此水相中加入乙酸
乙酯振荡（3ml），移液器提取脂相（上部），其水相用乙酸乙
酯萃取两次（2ml，2ml），合并所得脂相。
（6）第二次浓缩及进一步纯化：所得到酯相倒入蒸馏瓶中，在37-40℃下减压蒸干。
蒸干物用1.0ml色谱流动相（甲醇）溶解。
（7）溶解及过滤方法：由于最终溶解液1.0ml流动相即是HPLC上机样品，所以一定要在蒸馏瓶完全蒸干前提下一次性用移液管
准确加入 1.0ml，并充分溶解瓶内蒸干物质，尽量使瓶内溶液
浓度均一，而后直接倒入干燥无水的滤膜过滤器的针筒中进行
加压并使溶液通过直径为0.45um的水相微孔滤膜，压滤液存
放于1.5ml离心管中用于上机测定。
仪器准备：小玻璃瓶，7ml塑料离心管，1.5ml离心管，5ml玻璃注射器，过滤头，0.45um或0.22uml滤膜，可调试移液抢枪头。