黄曲霉毒素检验方法
一、目的
规范实验室检验方法。
二、内容
（一）试验准备
1、标定荧光计。
（1）、将仪器后的电源开关打开。
（2）、按SELECTTEST键，直至显示出AflaTest，按ENTER。
（3）、荧光计显示：START CALBRATION…OPEN THE LID
INSERT RED VIAL
打开仪器盖，将红色的真菌毒素标定管放入。
一定要确认标定管是
否已放到了仪器的底部。
（4）、仪器显示：HIGHCAL 22PPB
如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值，请按ENTER键。
否则，从键盘上所规定的设定值，确认准确无误后，按ENTER键。
（5）、仪器显示：READING HIGH CAL…SA VING HIGH INENSTTY
OPEN THE LID
INSERT GREEN VIAL
打开仪器盖取出红色的标定管，插入绿色的真菌毒素标定管。
一定
要确认标定管是否已充分插入仪器的底部。
（6）、仪器显示：LOW CAL 1.0PPB
如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值,请按ENTER键.否则,
从
键盘上所规定的设定值,确认准确无误后,按ENTER键。
（7）、仪器显示：READING LIW CAL…SA VING HIGH INTENSITJY 接着显示：OPEN THE LID
INSERT GREEN VIAL
打开仪器盖取出绿色的标定管。
（8）、仪器显示：VICAM V1.3 READY
按SELECT TEST键,仪器显示: AFLATEST, 按ENTER键。
（9）、仪器显示：START RUN TEST OPEN THE LID （10）、插入黄色的真菌毒素标定管，其读数应该在分析方法的测定范围内。
（11）、荧光屏计标定工作完毕，可经进行样品分析了。
荧光计每
周需要标定一次。
如果需要重新标定，请按STOP键，再按OPIONS 键，直至仪器显示：CALIBRATE TEST
然后按ENTER键，仪器显示：AFLATEST
如果不是这样，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST，
按
ENTER键。
然后，按照上面所述操作步骤进行。
如果进行样品分析，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST键。
2、配制AflaTest显色液（一天配制一次）。
3、配制甲醇/水（60：40体积比）溶液（每周配制一次，或根据需要
配制）。
4、试剂空白试验（1ml甲醇+1ml显色液置于测试管中），荧光计读数
应为0。
5、纯水空白试验（2ml纯水置于测试管中），荧光计读数应为0。
（二）样品提取
1、称取25克磨细的样品，5克氯化钠，置于搅拌杯中。
2、加入125ml甲醇/水（60：40）溶液。
3、盖上搅拌杯的盖子，高速成搅拌1分钟。
4、取下盖子，将提取物到入折叠滤纸上，滤液收集于干净的容器中。
（三）提取物的稀释
1、移取20ml上步的滤液，置于干净的容器中。
、
2、用20ml纯水将滤液稀释，混匀。
3、将上步稀释液通过玻璃纤维滤纸过滤，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10ml。
（四）分离柱色谱操作
1、将上步10 ml滤液（10ml=1.0g的样品）,以1-2滴/秒的流速全部通过AflaTest-P亲和柱,直到空气进入到亲和柱中。
2、将10 ml纯水以2滴/秒的流速通过亲和柱中。
3、将7.2步再重新操作一次, 直到空气进入到亲和柱中。
4、用1ml色谱级甲醇以1-2滴/秒的流速淋洗亲和柱，将所有样品
淋洗液收ml玻璃试管中。
5、将1ml AflaTest显色液加到测试管的淋洗液中，混匀后，将测试管置于已标定好了的荧光计中。
60秒后，读数。
（五）、如果要结束试验，按STOP键。
黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素（AF）是一种由黄曲霉属真菌产生的有毒代谢产物。
它们被广泛分布在食品、饲料和环境中，可能对人类和动物健康造成危害。
因此，对黄曲霉毒素的快速、准确检测成为了保障公众健康的关键。
国家标准委员会制定了黄曲霉毒素国标检测方法，以保证各个检验机构的检测质量和结果一致性。
1. 检测样品的制备
样品制备过程是检测过程的关键步骤。
样品必须被精确称量和混合，以确保最终检测结果的准确性和可重复性。
样品预处理的方法通常包括研磨、切碎、混合和抽样等步骤，具体方法取决于样品的特性，如水分含量、粘度和粒度分布等。
2. 样品提取
样品提取过程中，黄曲霉毒素从样品中被提取到适当的溶剂中。
提取的选择取决于样品的特性和黄曲霉毒素的特性。
一些常见的提取方法包括回收萃取、固相萃取和羧甲基纤维素柱萃取等。
3. 分离和净化
为了获得最终准确的结果，必须分离并净化提取的样品。
对于黄曲霉毒素的分离和纯化方法主要有和阳离子交换树脂和固相萃取等方法。
检测黄曲霉毒素的方法主要包括色谱检测法、酶联免疫检测法、毛细管电泳等方法。
其中酶联免疫检测法已成为广泛使用的检测方法之一。
该方法以特异性抗体为基础，利用抗原抗体相互作用，快速、敏感地检测黄曲霉毒素。
总的来说，黄曲霉毒素国标检测方法是一系列高效准确的方法，可以帮助检验机构检测食品或饲料中的黄曲霉毒素，保证公众健康。
黄曲霉毒素实验设计
ELISA试验精密度评价
2.精密度评价的内容：批内、批间、日内、 日间和总不精密度（日内＋日间） 批内：在相同条件下对同一标本在尽可 能短的时间内进行多次重复测定 3.精密度评价实验 对稳定样品（低、中、高三个水平）重 复20次测定A，计算A的均值、s、S2和CV
ELISA试验临界值确定
1.临界值 实验结果处于（阴、阳性）分界点时的 样品中分析物浓度值 1.1当样品中分析物浓度处于临界值时，用 定性试验对样品进行多次重复检测，将产 生50%的阳性结果和50%的阴性结果
ELISA试验精密度评价
1.精密度
在相同条件下，对同一样品多次测量， 每次测量结果之间的接近程度 1.1不能用数字表示 1.2可数字表示的是其反义概念：不精密度 用标准差（s）或变异系数（CV）表示
ELISA试验精密度评价
1.精密度 1.3分析过程重复性的指标 1.4每个标本只做一次检验就发出结果 报告的重要误差（随机误差）来源 1.5临床上希望同一标本的多次检测结 果的精密度好，以减小随机误差
ELISA试验临界值确定
2.确立实验方法的临界值 2.1对已知浓度阳性样品进行系列稀释 2.2对各稀释度样品进行多次重复检测
2.3阴性和阳性结果各占50%的样品中 分析物浓度即为实验方法的临界值
实ห้องสมุดไป่ตู้设计的内容
1.实验原理 2.实验材料：仪器、试剂、耗材、标本等 3.实验方法：文条或表格（详细、具体） 4.实验结果判断 5.实验结果计算及统计学处理 6.室内质量控制 7.注意事项 8.影响因素
黄曲霉毒素检验方法
一、目的规范实验室检验方法。
二、内容（一）试验准备1、标定荧光计。
（1）、将仪器后的电源开关打开。
（2）、按SELECTTEST键，直至显示出AflaTest，按ENTER。
（3）、荧光计显示：START CALBRATION…OPEN THE LIDINSERT RED VIAL打开仪器盖，将红色的真菌毒素标定管放入。
一定要确认标定管是否已放到了仪器的底部。
（4）、仪器显示：HIGHCAL 22PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值，请按ENTER键。
否则，从键盘上所规定的设定值，确认准确无误后，按ENTER键。
（5）、仪器显示：READING HIGH CAL…SA VING HIGH INENSTTYOPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出红色的标定管，插入绿色的真菌毒素标定管。
一定要确认标定管是否已充分插入仪器的底部。
（6）、仪器显示：LOW CAL 1.0PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值,请按ENTER键.否则,从键盘上所规定的设定值,确认准确无误后,按ENTER键。
（7）、仪器显示：READING LIW CAL…SA VING HIGH INTENSITJY 接着显示：OPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出绿色的标定管。
（8）、仪器显示：VICAM V1.3 READY按SELECT TEST键,仪器显示: AFLATEST, 按ENTER键。
（9）、仪器显示：START RUN TEST OPEN THE LID （10）、插入黄色的真菌毒素标定管，其读数应该在分析方法的测定范围内。
（11）、荧光屏计标定工作完毕，可经进行样品分析了。
荧光计每周需要标定一次。
如果需要重新标定，请按STOP键，再按OPIONS 键，直至仪器显示：CALIBRATE TEST然后按ENTER键，仪器显示：AFLATEST如果不是这样，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST，按ENTER键。
乳与乳制品中黄曲霉毒素检测方法和限量标准研究
Aug. 2019 China Food Safety ·27·理论研究THEORY 乳与乳制品中黄曲霉毒素检测方法和限量标准研究摘要：随着我国经济的发展与人们生活水平的提高，具有丰富营养价值的乳及乳制品逐渐成为人们日常生活的必需消费品。
与此同时，人们对乳及乳制品的期待不再局限于量的提高，而是对其质量和安全提出了更高的要求。
关键词：黄曲霉毒素M1；乳及乳制品；现状近年来，各种牛奶安全问题，尤其是黄曲霉毒素M1(aflatoxinM1，AFM1)污染问题的不断出现，给消费者健康带来危害。
AFM1主要存在于牛乳中，这主要是由于奶牛摄取了被黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1，AFB1)污染的饲料而产生的。
AFM1性质稳定，常见的3种牛奶加工方式——巴氏杀菌(L TL T，63℃保持30min)、高温快速巴氏杀菌(HTST，72℃保持15s)和超高温灭菌(UHT，135℃保持1～2s)均无法破坏其结构，因此控制饲料及原奶中AFB1的含量显得尤其重要。
黄曲霉毒素检测方法的研究进展液AFM1检测技术。
目前，对牛奶中AFM1的检测方法分为两大类，一类是以色谱技术为基础的物理化学分析方法，包括薄层层析色谱(TLC)法、高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱(GC)法等;另一类是可快速检测的免疫化学方法，包括FL 法、ELISA 法、胶体金免疫层析(GICT)法。
酶联免疫吸附法。
酶联免疫吸附法（ELASA 法）是高样品量的筛查方法，目前黄曲霉毒素检测已经有成熟的商品化试剂盒。
主要原理是抗原、抗体反应与酶和底物反应进行显色，将显色的微孔板通过酶标仪进行定量分析。
ELASA 法主要有间接法、竞争法和生物酶标亲合素法。
目前竞争法是ELASA 常用的方法，原理是与黄曲霉毒素M1高亲和力的抗体预先包被于固定相的聚苯乙烯微孔中。
标准品和样品加入相应的微孔中，如果有黄曲霉毒素M1存在，会与包被的抗体结合。
糕点-黄曲霉毒素B1 的测定-薄层层析法
准确称取 1～1.2mg 黄曲霉毒素 B1 标准品，先加入 2mL 乙腈溶解，再用苯稀释定容至 100mL， 其浓度约为 10¦Ìg/mL，此标准溶液应通过紫外分光光度法测定其纯度，并以溶剂调整其浓度为 10¦Ìg/mL，避光，置于 4℃冰箱中保存。 3.9 黄曲霉毒素标准使用液，0.04¦Ìg/mL
3
将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端 3cm 的基线上用微量注射器或血色素吸 管滴加样液。一块板可滴加 4 个点，点距边缘和间距约为 1cm，点直径约为 3mm。在同一板上滴 加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：
第一点：10μL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液(0.04¦Ìg/mL).。 第二点：20μL 样液。 第三点：20μL 样液＋10μL 0.04¦Ìg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 第四点：20μL 样液＋10μL 0.2¦Ìg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 6.2.2 展开与观察 在展开槽内加 10mL 无水乙醚，预展 12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加 10mL 丙酮－ 三氯甲烷混合液（8＋92），展开 10～12cm，取出。在紫外光下观察结果，方法如下。 由于样液点上加滴黄曲霉毒素 B1 标准使用液，可使黄曲霉毒素 B1 标准点与样液中的黄曲霉 毒素 B1 荧光点重叠。如样液为阴性,薄层板上的第三点中黄曲霉毒素 B1 为 0.0004¦Ìg，可用作检查 在样液内黄曲霉毒素 B1 最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四 点中黄曲霉毒素 B1 为 0.002¦Ìg，主要起定位作用。
饲料中黄曲霉毒素B1的检测
中国果菜质量控制黄曲霉毒素B1（AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，是已知的化学物质中致癌性最强的一种。
AFB1污染的物质包括食品中的花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等农产品及其加工产品；且以南方高温、高湿地区受污染最为严重。
黄曲霉毒素无臭、无味、无色，在饲料中及其稳定，对家禽、家畜的健康威胁极大，作为饲料强制性卫生监控指标，目前有半定量薄层色谱法[1]、免疫亲和柱净化———高效液相色谱法[2]、免疫亲和荧光光度法[3]、酶联免疫吸附法[4]。
高效液相色谱法虽然灵敏度高，但是样品前处理繁琐，操作复杂；薄层色谱法虽然简便，但是灵敏度差，因此研究能够准确、快速检测饲料中AFB1的检测方法是十分必要且具有现实意义的。
1实验部分1.1材料与试剂甲酸，优级纯；乙腈，色谱纯；超纯水；饲料中黄曲霉毒素B1的检测刘超景赞（乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山614000）摘要:采用高效液相色谱串联质谱法对饲料中黄曲霉毒素B1进行检测。
建立了以Inertsil ODS-3为液相色谱柱，以0.1%甲酸水、乙腈（0.1%甲酸）为流动相，质谱使用电喷雾离子源，正离子扫描，以313.0/285.0为定量离子对的LC-MS/MS 检测方法。
结果表明：该方法所测得的黄曲霉毒素B1在0~100.0ng/mL 内具有良好线性，检出限为2.8μg/kg ，加标回收率在93.3%~98.3%。
该方法适合饲料中黄曲霉毒素B1的分析检测。
与传统的薄层色谱、高效液相色谱法相比较，该方法具有分析速度快、操作方便、重现性好、灵敏度高等特点。
关键词:饲料；黄曲霉毒素B1；液质联用中图分类号:TS207文献标志码:A文章编号:1008-1038(2015)12-0025-03Detection of AFB1in FeedLIU ChaoJING Zan(Leshan Food and Drug Inspection and Testing Center,LeShan 614000,China)Abstract:We tested aflatoxin B1in feed with LC -MS/MS method.A method was developed with novel HPLC columnInertsil ODS -3,Mobile phase was 0.1%methanoic acid water,0.1%methanoic acid acetonitrile,combined with MS,which used positive ion scanning,and quantification ion pair was 313.0/285.0.A good linear in 0~100.0ng/mL.detection limit was 2.8μg/kg.Adding standard recovery was 93.3%~98.3%.This method has advantages of being fast,easy,reproducible and relatively sensitive compared with TLC and HPLC.Key words:Feed;AFB1;LC-MS/MS收稿日期:2015-06-26作者简介:刘超（1984—），男，助理工程师，研究方向为食品安全25. All Rights Reserved.中国果菜质量控制AFB1标准品（2μg/mL，农业部环境保护科研所）。
高效液相色谱法检测农产品中黄曲霉毒素B1的含量
分析检测高效液相色谱法检测农产品中黄曲霉毒素B1的含量韩 宇（四川省甘孜藏族自治州食品药品检验所，四川康定 626000）摘 要：目的：建立高效液相色谱法联合免疫磁固相萃取法测定农产品食品中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）含量的分析方法。
方法：采用70%乙腈溶液提取花生、玉米、大豆、小麦、豌豆和绿豆样品中的AFB1，然后利用免疫磁珠净化、萃取和富集提取液中的AFB1，采用高效液相色谱法进行定量分析。
结果：方法的检出限为0.03～0.92 μg·kg-1，回收率为79.52%～97.53%。
利用该方法对市场上购买的20份花生、玉米、大豆、小麦、豌豆、绿豆样品中的AFB1进行检测，除了玉米和绿豆中未检测出AFB1外，其余实验样品中均检测出一定含量的AFB1。
结论：该方法简便、快速、准确，适用于复杂样品中黄曲霉毒素B1的测定。
关键词：高效液相色谱法；免疫磁固相萃取；黄曲霉毒素B1Determination of Aspergillus Flavus B1 in Agricultural Products by High-Performance Liquid ChromatographyHAN Yu(Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture Institute for Food and Drug Control, Kangding 626000, China)Abstract: Objective: To establish a method for the determination of Aflatoxin B1 (AFB1) in agricultural products by high performance liquid chromatography combined with immunomagnetic solid phase extraction. Method: AFB1 was extracted from samples of peanuts, corn, soybeans, wheat, peas, and mung beans using a 70% acetonitrile solution, and then AFB1 was purified, extracted and enriched by immunomagnetic beads, and quantitative analysis was performed by HPLC. Result: The limits of detection were 0.03～0.92 μg·kg-1, and the recoveries were 79.52%～97.53%. AFB1 in 20 samples of peanut, corn, soybean, wheat, pea and mung bean purchased from the market was detected by this method. AFB1 content was detected in all the other samples except corn and mung bean. Conclusion: The method is simple, rapid, accurate and suitable for the determination of aflatoxin B1 in complex samples.Keywords: high-performance liquid chromatography; immunomagnetic solid-phase extraction; aspergillus flavus B1黄曲霉毒素是一种由黄曲霉菌产生的有毒代谢产物，在自然界中分布广泛，在粮食和饲料等农产品中广泛存在。
2020版《中国药典》解读一：真菌毒素分析方法验证
2020版药典真菌毒素分析方法验证*方法依据：《中国药典》2020版 第四部 9101 药品质量标准分析方法验证指导原则一 检测限、定量限信噪比法 1. 检测限：取黄曲霉毒素标准品，不断将其稀释（逐级稀释法），按照供试品进样体积进液相色谱检测，直至信噪比为3或略大于3，此时的标准品浓度（单位为μg/mL ），乘以5除以3得到的就是检测限，单位为μg/kg 。
2. 定量限：取黄曲霉毒素标准品，不断将其稀释（逐级稀释法），按照供试品进样体积进液相色谱检测，直至信噪比为10或略大于10，此时的标准品浓度（单位为μg/mL ），乘以5除以得到的就是定量限，单位为μg/kg 。
上述计算方法获得的数据须用含量相近的样品进行验证。
应附测试图谱，说明测试过程和结果。
二 准确度回收率验证： （以黄曲霉毒素为例）称取未检出黄曲霉毒素的样品6份，每份15g ，分别加入75μL 浓度为2.6ppm 的黄曲霉毒素混合标准品，按照2020版药典《通则2351 黄曲霉毒素测定法》进行操作。
回收率计算如下：1．黄曲霉毒素B 1、G 1回收率计算公式：%1005)(-)()(111111⨯=含量样品含量加标样品回收率黄曲霉毒素G B G B G B2．黄曲霉毒素B 2、G 2回收率计算公式：%1005.1)(-)()(222222⨯=含量样品含量加标样品回收率黄曲霉毒素G B G B G B表1 样品中待测定成分含量和回收率限度三 精密度1. 重复性在规定范围内，取同一浓度的供试品，用至少6份的测定结果进行评价。
或设计至少3种不同浓度，每种浓度分别制备至少3份供试品溶液进行测定，用至少9份样品的测定结果进行评价。
2. 中间精密度考查随机变动因素，如不同日期、不同分析人员、不同仪器对精密度的影响，应进行中间精密度试验。
3. 重现性国家药品质量标准采用的分析方法，应进行重现性试验，如通过不同实验室协同检验获得重现性结果。
表2 样品中待测定成分的含量与精密度可接受范围关系。
黄曲霉毒素检测标准方法汇总
流动相的梯度变化表（GBT 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定）
标准方法检出限（GBT 23212-2008）
次氯酸钠溶液（消毒用）：
取100g漂白粉，加入500ml水，搅拌均匀。
另将80g工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于500ml温水中，再将两液混合、搅拌、澄清后过滤。
此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。
若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。
所得溶液的浓度约为50g/L。
污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）
AFT B1标准溶液配制
1 仪器校正，测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素f
2 标准溶液配制，配制AFT B1标准溶液，用紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值，计算AFT B1标准液浓度，后用苯-乙腈混合液调到标准液为10.0ug/ml，并用分光光度计核对浓度。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）。
食品中黄曲霉毒素B1的测定
Science &Technology Vision 科技视界操作次序加入量孔号123456789150微升50微升A 00.10.250.512……DCCC C C CCC混匀23孔号234567891.890 1.548 1.2410.9190.6700.509 1.586 1.5400引言黄曲霉毒素B 1是一种高毒性、高致癌性的物质,除可引发肝癌外,也可引起其他部位如肾、胃、支气管、腺体和皮下组织的癌肿,是食品卫生部门常规的检测项目之一。
之前的方法都不能更好的检测出粮食作物、饲料和发酵食品中黄曲霉毒素的含量,今用酶联免疫吸附法能更灵敏准确的检出。
该法是把抗原抗体免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种新型检测技术,其主要依据有三点:第一,抗原(抗体)能结合到固相载体的表面并仍保持其免疫活性;第二,抗体(抗原)与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性;第三,结合物与相应的抗原(抗体)反应后,结合的酶仍能催化底物生成有色物质,而颜色的深浅可定量抗体(抗原)的含量。
酶联免疫吸附分析法主要有三种测定方法:即间接法、抗体夹心法和竞争法。
前两种主要用于测定抗体和大分子抗原,适用于临床诊断上;而竞争法是测定小分子抗原的方法,因而尤其适用于食品卫生分析,该法主要有四步:1)将人工抗原吸附于固相载体,温育后清洗;2)加入含有抗原的待测液和抗体,温育后洗涤;3)加入酶标抗体,温育后清洗;4)加酶底物,温育后显色,并进行检测和结果判断。
图1黄曲霉毒素化学结构1实验部分1.1酶联免疫吸附法的原理利用固相酶联免疫吸附原理,将AFB 1特异性抗体包被与聚苯乙烯微量反应板的空穴中,再加入样品提取液(未加抗原)及酶标AFB 1抗原(已知抗原),使两者与抗体之间进行免疫竞争及应,然后加酶底物显色,颜色的深浅取决于抗体和酶标AFB 1抗原结合的量,即样品中AFB 1多,则被抗体结合酶标AFB 1抗原少,颜色浅,反之则深。