WesternBlotting方法
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
生物化学实验报告：Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白
生物化学实验报告：Western-blotting检测大肠杆菌重组蛋白实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白一、实验目的利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flav onol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。
二、实验原理黄酮醇合酶（FLS，EC .23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。
FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O 2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。
本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入KpnІ酶切位点，去掉终止密码并引入Bam H І酶切位点。
克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 ×His标签。
重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。
收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。
Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。
本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组Ft FLS蛋白的N-末端和C-末端6 ×His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。
western-blot-相关试剂及步骤
Western Blot蛋白测定步骤三蒸水制备后需要高压消毒一、组织的采集（一）器材和试剂准备：镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL离心管、液氮（二）步骤（以心脏为例）:1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗心脏约100mg），排除血液，放入离心管，投入液氮中3、组织于-80摄氏度冻存二、组织蛋白的提取：（一）器材和试剂准备：4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，详见下载的网页）（碧云天公司）、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978，Thermo Scientific）、70%乙醇、三蒸水（二）步骤1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水；取出RIPA和PMSF解冻2、按照1mLPIRA ：10uLPMSF ：100mg组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织，上下且圆周运动离心管。
每管研磨的转速和时间保持一致。
当出现大量泡沫时即可停止4、静置于冰盒30分钟5、12000rpm，4摄氏度，30分钟6、先取100uL上清于离心管，再取300uL上清于离心管。
前者用于测试，后者备用。
-80摄氏度冻存。
注意：购置的RIPA不宜反复冻融，需分装-80摄氏度保存；PMSF为晶体状，购置后按照说明书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存三、蛋白上样量定量采用BCA法测蛋白（BCA protein assay kit，Prod号23225，详见下载的网页，Thermo Scientific）：（一）器材和试剂准备：1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液（二）步骤1、详见BCA Protein Assay Kit.pdf 使用说明书，配制溶液，制作标准曲线，测定蛋白浓度。
Weastern Blot 操作方法 图文
方法
仪器
特点
湿转
湿式成功率高并特别适合用 于分子量大于 100KD的蛋白 两种方法的转 膜液不同！！
半干转
半干式转膜速度快，适 合与小分子量蛋白
4、封闭
为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进 行膜的封闭，常用的封闭液：脱脂奶粉（5％） 封闭条件： 室温封闭1 hour，再用 TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵 育。
Further Readings
• 生物秀Western Blotting专题 • /special/experiment/WesternBl otting.htm • Millipore的蛋白印迹手册 • /thread-45770-1-1.html • Bio-Rad的western Blotting操作手册 • /thread-30154-1-1.html • Western blot问题解答专帖 • /thread-40769-1-1.html
2.4 内参的选择
• 原因：校正蛋白质定量、上样 过程中存在的实验误差 • 种类：GAPDH、beta-actin、 beta-tubulin • 用法： – 二抗孵育时加入HRP标记内 参抗体 – 分子量大小相差比较明显
3、转膜
3.1 膜的选择
• 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如 NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹 法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完 全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置 不同。
• 回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次15min。最后用 TBS漂洗膜2次，每次10min。
7、底物显色
显色方法 酶促底物发光法 代表类型 DAB显色法 特点 稳定性好，灵敏 度较高 （250pg），背 景一般，成像性 较差，药品疑有 一定致癌性。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
Western blot方法中不同电流强度对较大分子蛋白质转膜效率的影响
Western blot方法中不同电流强度对较大分子蛋白质转膜效率的影响谢岚;艾华【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2012(033)001【摘要】目的研究Western blot方法中不同电流强度对较大分子蛋白质转膜效率的影响.方法利用(36~250)×103标志蛋白质,以8%SDS-PAGE凝胶分离,然后分别以100、200、300、400、500 mA恒流湿法电转2 h.结果 100、200 mA 恒流2 h不能使250×103较大分子蛋白质全部转膜,凝胶有残留.300 mA以上则可使大部分或全部转膜,胶上未见残留.结论电流强度对较大蛋白质转膜有影响.300~400 mA可作为250×103左右较大分子蛋白质从8%SDS-PAGE凝胶转膜的最佳恒流强度.【总页数】3页(P42-44)【作者】谢岚;艾华【作者单位】北京大学第三医院运动医学研究所营养生化研究室,100191;北京大学肥胖与代谢病研究中心营养运动与肥胖研究室,100191【正文语种】中文【相关文献】1.柑橘叶片蛋白质高效提取与溃疡病PthA蛋白质Western blot分析 [J], 李娜;覃磊;严佳文;陈佩;邓子牛2.重组外膜脂蛋白LipL32与致病性钩端螺旋体抗体的免疫反应性及与不同血清群交叉反应性的Western blotting评价 [J], 段鸿元;刘志国;邱少富;何斌;赵海;宋利华;朱虹;端青3.快慢转法及不同滤膜和显色检测法在Western blotting中的应用分析 [J], 孔令泉;蒲莹晖;马仕坤;涂刚;任国胜4.Western blotting中低丰度蛋白转膜方法改进 [J], 牟宏宇;罗波;何涛5.高内涵分析及Western blotting法在蛋白质核质分布研究中的应用及比较研究[J], 纪晓方;李丽英;常娜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗体纯度鉴定的常用方法
抗体纯度鉴定的常用方法抗体纯度鉴定是指确定抗体制备物中所含目标蛋白的纯度和含量，是抗体制备和应用的重要环节之一。
正确的抗体纯度鉴定方法能够确保所使用的抗体制备物质量可控，保障后续实验结果的准确性和可重复性。
以下是抗体纯度鉴定的常用方法：1.蛋白凝胶电泳蛋白凝胶电泳是一种常用的方法，可以通过电泳分离抗体制备物中不同的蛋白质组分，并确定目标蛋白的含量和纯度。
一般可以使用SDS-PAGE或者非变性凝胶电泳进行分析。
通过与分子量标准蛋白进行比较，可以确定蛋白质的分子量和含量，从而初步评估抗体制备物的纯度。
2. Western blottingWestern blotting是一种用于检测蛋白质的方法，常用于检测抗体制备物中目标蛋白的存在和纯度。
首先将抗体制备物进行电泳分离，然后将蛋白转移到膜上，利用特异性抗体探针结合目标蛋白，最后通过化学发光或者荧光信号检测目标蛋白的含量。
通过对比标准品的信号强度，可以估计抗体制备物中目标蛋白的含量和纯度。
3.免疫沉淀免疫沉淀是一种通过特异性抗体结合目标蛋白并沉淀下来的方法，可以用于分离和富集抗体制备物中的目标蛋白。
通过免疫沉淀后的沉淀物经过洗涤和离心，可以得到纯度较高的目标蛋白制备物。
然后可以通过Western blot或者质谱等方法对目标蛋白制备物进行进一步的纯度鉴定。
4.蛋白质定量方法常用的蛋白质定量方法包括BCA法、Lowry法、Bradford法、UV吸收法等。
这些方法可以用于测定抗体制备物中蛋白质的含量，通过与标准蛋白进行对比，可以估计抗体制备物的目标蛋白含量和纯度。
5.质谱分析质谱分析是一种高灵敏度的蛋白质鉴定和定量方法，可以用于确定抗体制备物中目标蛋白的含量和纯度。
常用的质谱方法包括MALDI-TOF、ESI-MS等，通过对目标蛋白进行鉴定和定量，可以得到比较准确的抗体制备物的纯度和含量信息。
6.免疫浊度分析免疫浊度分析是一种测定抗体制备物中目标蛋白含量的方法，利用目标蛋白与特异性抗体的结合产生的浊度变化来测定目标蛋白的含量。
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法单克隆抗体检测方法是一种常用的实验技术，用于检验抗体的特异性和亲和力。
以下是几种常用的单克隆抗体检测方法：1. 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）：免疫组化是一种常见的单克隆抗体检测方法，用于检测组织学样本或细胞涂片中特定分子的表达情况。
该方法利用免疫反应来检测抗原-抗体的结合。
首先，将样品固定在载玻片上，然后用单克隆抗体特异地结合目标抗原。
通过可视化标记物，如酶或荧光标记物，可以检测到抗原-抗体的结合，从而实现对特定分子的检测。
2. 免疫印迹（Western Blotting）：免疫印迹是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于分析蛋白质的存在和相对数量。
在这个方法中，蛋白质样本通过电泳分离，并转移到薄膜上。
然后，薄膜与特异的单克隆抗体结合，用于检测目标蛋白质的存在。
最后，通过可视化标记物实现目标蛋白质的检测。
免疫印迹可用于研究蛋白质的表达量、分子量和剪接变异等。
3. 流式细胞术（Flow Cytometry）：流式细胞术是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于检测细胞表面标记物的存在和表达水平。
在这个方法中，通过单克隆抗体标记标记物，然后通过激光照射悬浮在流式细胞仪中的细胞。
细胞经过激光激发后，通过检测散射和荧光信号，可以确定单个细胞的性质和数量。
流式细胞术广泛应用于细胞免疫学和细胞生物学中。
4. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）：免疫沉淀是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于富集靶蛋白及与其相互作用的蛋白质。
在这个方法中，样品中的蛋白质与特异的单克隆抗体结合形成免疫复合物。
然后，通过添加沉淀剂，如蛋白A/G琼脂糖，将免疫复合物富集并沉淀下来。
最后，通过洗涤和分离，可以得到蛋白质的纯化，并用其他方法进一步分析。
5. 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：酶联免疫吸附试验是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于测定抗原或抗体的存在和浓度。
ECL发光
应用及储存
• ELISA • Western & Far-Western Blot • Dot Blot • Southern Blot • Northern Blot
• A液和B液2-8℃避光分别保存，保质期一年。
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ECl操作的基本程序如下
1、进行常规电泳、转膜、HRP标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。 2、新鲜配制发光工作液：分别取等体积溶液A和B混合，放置使之升 到室温否则会减弱荧光强度。建议立即使用工作液，室温放置数小时 后仍可使用，但灵敏度略有降低。 3、用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，但勿使膜完全干燥。将膜 完全浸入并与发光工作液充分接触。 4、用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。 5、在X光胶片暗盒内面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将杂交膜贴在保 鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹杂交膜，去除气泡和皱褶，用滤纸 吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖杂交膜的保鲜膜固定在暗盒内， 6、在黑暗中放入X光胶片，分别曝光不同的时间如数秒到数分钟。显 影冲洗。 发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可 避免。
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问题
• 问题：有杂信号
• 解决方法： • (1)优化一抗和二抗的工作浓度； • (2)缩短一抗孵育时间； • (3)增加一次洗涤，并延长洗涤时间至10min； • (4)减少样品上样量； • (5)更换特异性更高的二抗。
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问题
• 问题四.同一张膜如何进行蛋白的反复检测？
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ECL显色原理
• 发光液A和B在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作 用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物， 过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电 子激发中间体,当后者由激发态返回至基态，就会 产生荧光。在发光过程中不需要消耗HRP,HRP只 是起催化作用，所以只要HRP没降解失活,是可以 重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶,在室温 放置时间过长,是会降解的；同时在发光过程中有 什么物质(比如显影液)污染了膜的话,也有可能灭 活膜上的HRP。
白介素因子实验室检测方法
白介素因子实验室检测方法白介素因子是一类蛋白质，它在调节免疫系统、细胞信号传导以及控制炎症反应等方面起着重要的作用。
检测白介素因子的实验室方法可以帮助医生判断机体的免疫状态、炎症程度以及相关疾病的发展情况。
下面是关于白介素因子实验室检测的10条方法：1. 酶联免疫吸附法（ELISA）：这是一种常用的检测白介素因子的方法。
它利用特异性抗体与目标蛋白结合，然后用酶标记的抗体进行检测，最后用染色剂检测酶的活性来确定目标蛋白的浓度。
2. 免疫荧光法：该方法利用荧光标记的特异性抗体与目标蛋白结合，然后通过荧光显微镜观察样本中的荧光信号，来确定目标蛋白的存在与否。
3. 电化学发光法（ECL）：这是一种灵敏度高、重复性好的检测方法。
它利用酶标记的抗体与目标蛋白结合，在特定的底物存在下，通过电化学反应产生发光信号，从而确定目标蛋白的浓度。
4. 蛋白微阵列技术（Protein microarray）：该技术将大量的目标蛋白固定在晶片上，然后用荧光标记的特异性抗体进行检测。
通过分析荧光信号的强度和位置，可以确定目标蛋白的存在与否及其浓度。
5. 质谱法（Mass Spectrometry）：质谱法是一种高精度的分析方法，可以对目标蛋白的质量、结构和浓度进行准确测量。
可利用质谱法检测目标蛋白的分子量以及相关的修饰等信息。
6. 免疫印迹法（Western Blotting）：该方法通过将蛋白样品进行电泳分离，然后转移到膜上，并利用特异性抗体进行检测。
通过测定荧光信号的强度，可以确定目标蛋白的存在与否及其浓度。
7. 流式细胞术（Flow cytometry）：这是一种高通量的细胞分析技术。
通过对细胞进行染色和标记，利用流式细胞仪检测免疫细胞中白介素因子的存在与否，并可定量分析其浓度。
8. RNA表达分析：通过分析细胞中的RNA水平，可以了解细胞中白介素因子的表达情况。
这可以通过实时定量PCR等技术来实现。
9. 蛋白质互作分析：通过利用蛋白质互作技术，可以研究白介素因子与其他蛋白质的相互作用关系，从而深入了解白介素因子在细胞信号传导中的作用机制。