果胶酶高产菌株EIM_4的鉴定及其液体发酵条件优化
果胶酶高产菌株的分离筛选及产酶条件优化
果胶酶高产菌株的分离筛选及产酶条件优化果胶酶是指分解果胶质的酶，是含有多种组分的复合酶。
果胶酶可裂解单糖之间的糖苷键，并脱去水分子，分解包裹在植物表皮的果胶，促使植物组织的分解。
这类酶广泛分布于高等植物和微生物中，在某些原生动物和昆虫中也有发现。
在微生物中，细菌、放线菌、酵母和霉菌都能代谢合成果胶酶。
果胶酶在工业生产领域是一种重要的新兴酶类。
据统计，目前果胶酶在全世界食品酶的销售额中占25%。
主要应用于食品工业的果汁加工和果汁果酒澄清、饲料工业以及造纸工业的纸浆脱胶和麻类加工。
1 材料与方法1．1 材料1．1．1 试验材料采集绵阳市采摘果园土壤及腐烂的苹果、梨、枣等水果的腐烂部分。
1．1．2培养基和试剂果胶酶初筛培养基: 果胶4 g，蛋白胨10 g，氯化钠0．5 g，刚果红0．15 g，琼脂20 g，定容至1 000mL，pH7．0，121 ℃灭菌20 min．2) 牛肉膏蛋白胨培养基: 牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，琼脂15 ～20 g，水1 000 mL，pH7．0 ～7．2，121 ℃灭菌20 min．3) PDA 培养基: 马铃薯200 g，蔗糖10 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 值自然，121 ℃灭菌30 min．4) 发酵培养基: 桔皮粉10．0 g·L－1，( NH4)2SO420．0 g·L－1，KH2PO438 g·L－1，K2HPO4·3H2O2．0 g·L－1，pH5．5，121 ℃灭菌20 min．富集培养基：LB 培养基，蛋白胨 1.0 g，酵母膏0.5 g，NaCl 1.0 g，蒸馏水100 mL，灭菌。
筛选培养基：果胶1.0 g，（NH4）2SO40.2 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，调pH 至中性，琼脂2.0 g，蒸馏水100 mL，灭菌，倾倒平板。
一株高产果胶酶青霉菌株的筛选鉴定
一株高产果胶酶青霉菌株的筛选鉴定蓝丽精;周琴;蔡琪敏;董夏梦;汪鹏荣;蒋冬花【期刊名称】《浙江师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(34)4【摘要】从淤泥中筛选、分离纯化,得到了一株高产果胶酶的青霉菌株,编号为L5.根据培养特征、形态特征和内转录间隔区(ITS)序列分析,将L5菌株鉴定为草酸青霉菌(Penicillium oxalicum).该菌株在28℃,pH 6.0,摇床转速160 r/min条件下培养70 h,其果胶酶活性可达39 940 U·mL-1·min-1.%A high-yield pectinase strain L5 was screened from sludge. It was identified as Penicillium oxali-cum by morphological observation, and internal transcribed spacer (ITS) sequence analysis. This strain was cultured at the condition of 28 ℃ , pH 6. 0, 160r/min for 70 h, its pectinase activity reached to 39 940 U · mL-1 · min -1 .【总页数】5页(P452-456)【作者】蓝丽精;周琴;蔡琪敏;董夏梦;汪鹏荣;蒋冬花【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004【正文语种】中文【中图分类】Q93【相关文献】1.一株高产木聚糖酶菌株的筛选鉴定及酶学特性研究 [J], 郑虹;李莉娟;童秋霞;陈联邦;王艳君;季潇炜;邓加聪2.一株聚β-羟基丁酸高产菌株的分离与研究--Ⅱ.出发菌株的筛选鉴定及合成PHB 条件的研究 [J], 薛林贵3.果胶酶高产菌株AspT7的分离及筛选鉴定 [J], 童娟4.一株琼胶酶高产菌株的筛选鉴定及产酶条件的优化 [J], 徐丽;刘江涛;蔡俊鹏5.果胶酶高产菌株EIM－6的筛选鉴定及其液体发酵产酶条件优化 [J], 杨欣伟;林伟铃;田宝玉;柯崇榕;黄薇;黄建忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一株高产果胶酶青霉菌株的筛选鉴定
下降法 、 脱胶作用时间法、 还原糖测定法 、 紫外吸 收测 定法 等 ． 实 验 酶 活性 测 定 均 采用 还 原 糖 测 本
定法 中的 ３５二 硝基水 杨 酸 （ Ｎ ） ，一 Ｄ Ｓ 法 ． 果胶 酶 主要应 用于食 品加 工业 ， 在纺 织 、 环境
菌和根霉 等也有相关 的报道 ， 而关 于草酸青霉
文 章 编 号 ：０ １ ０ １ ２ １ ）４０ ５ －５ １０ － ５ （０ １ ０ －４ ２株 的筛选 鉴定
蓝 丽精 ， 周 琴 ， 蔡琪敏 ， 董夏 梦 ， 汪鹏 荣， 蒋冬花
（ 浙江师范大学 化学与生命科学学院， 浙江 金华 ３ １０ ） ２０４
摇床转速 １０ｒｍ ｎ条件 下培养 ７ ， ６ ｉ ／ ０ｈ 其果胶酶活性可达 ３ ４ ・ ～ ・ ’～． ９９０Ｕ ｍＬ ｍｌ ｎ
关键词 ： 胶酶 ； 果 酶活性 ； 草酸青霉 ； 筛选
中 图分 类 号 ：９ Ｑ３ 文献 标 识 码 ： Ａ
Ｓｃ ｅ ｎ ｎｇ ａ ｄ ｎｔｆｃ ｔｏ ｏ ｉ ｈ－ ｉｌ ｃｉ ｓ ｅ ｃｌｉ ｍ ｔ ａ ｎ ｒ ｅ ｉ ｎｄ ｉ ｅ ｉ ａ ｉｎ ｆａ ｈ ｇ ｙ ｅｄ ｐｅ ｔｎａ ｅ ｐ ｎｉｉ ｕ ｓｒ ｉ ｉ ｌ
（ ｅｉｌｕ ｘｌｕ 的相关 报道甚 少 ， 酸青 霉 Ｐｎｃｌｍ ｏａｉ ｍ） ｉｉ ｃ 草 （ ｅｉＵｕ ｘｌｕ 产 果 胶 酶 的 液 体 发 酵 更 是 Ｐ ｎ ｉｉｍ ｏａｉ ｍ） ｃ ｃ 鲜有报 道 ．
保护 、 饲料加工 、 生物制浆 、 木材防腐等行 业中也
有 广泛 的应 用 ． 献 ［ ］ 研 究 了 草 酸 青 霉 文 ５还
第３ ４卷第 ４期
２１年 １ ０ １ １月
浙江 师范 大学学报 （ 自然科学 版）
高产原果胶酶菌株的筛选鉴定及在桔皮果胶提取中的应用的开题报告
高产原果胶酶菌株的筛选鉴定及在桔皮果胶提取中的应用的开题报告一、背景果胶是一种在植物细胞壁中广泛存在的高分子物质，具有细胞壁增强、保水、保护作用，同时也是食品、医药、化妆品等行业的重要原材料。
目前，从植物中提取果胶的方法主要有热水浸提、微生物发酵法和化学法。
其中微生物发酵法是比较环保、高效的提取方法，利用果胶酶对果胶进行降解，可以获得高质量的果胶产品。
然而，目前使用的微生物菌株多为自然分离的分泌果胶酶能力较弱的细菌菌株，导致果胶的提取效率低下，成本较高。
因此，需要开展高产原果胶酶菌株的筛选鉴定，以提高果胶的产量和质量，进一步拓宽果胶的应用领域。
二、目的和意义本研究旨在通过筛选鉴定，获得一种高产原果胶酶的微生物菌株，并应用于桔皮果胶的提取中，探究高产原果胶酶菌株在果胶提取中的技术优势和经济效益，为果胶酶的应用开发提供技术支持，促进果胶的生产和应用。
三、研究内容1. 构建原果胶酶表达载体并进行原果胶酶的表达和纯化；2. 从不同来源的土壤、水样等环境样品中分离筛选具有高产原果胶酶能力的菌株；3. 对筛选出来的菌株进行鉴定，并对其果胶酶特性进行研究；4. 将筛选出的高产原果胶酶菌株应用于桔皮果胶提取中，比较其与其他常规菌株的果胶提取效果和经济效益。
四、拟采用的方法1. PCR技术构建原果胶酶表达载体，并通过转化技术将其导入到大肠杆菌中进行原果胶酶表达和纯化；2. 采用标准分离和鉴定方法，从不同的环境样品中分离出能够高效产生原果胶酶的微生物菌株，如土壤、水样等；3. 对筛选出的菌株进行形态学和生理生化特性分析、16S rRNA基因序列分析，确定其分类地位和菌种名称，并对其果胶酶特性进行评价；4. 应用筛选出的高产原果胶酶菌株和其他常规菌株在相同条件下进行桔皮果胶的提取和分离，分析其提取效果和经济效益。
五、预期结果1. 构建原果胶酶表达载体并表达出纯度较高、活性较强的果胶酶；2. 从不同来源的环境样品中筛选出高产原果胶酶的微生物菌株，获得相关特性数据并对其进行分类鉴定；3. 筛选的高产原果胶酶菌株在桔皮果胶的提取和分离中表现出较高的效率和经济效益。
果胶酶高产菌种的紫外诱变选育及其培养条件的响应面法优化
果胶酶高产菌种的紫外诱变选育及其培养条件的响应面法优化林伟铃;田宝玉;秦勇;吕睿瑞;王春香;强慧妮;黄建忠【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2010(040)002【摘要】以果胶酶产生菌黑曲霉EIM6为出发菌株,初始果胶酶活为14 539 U/mL,经紫外诱变反复处理,摇瓶复筛和遗传稳定性试验,最终获得一株果胶酶高产菌株EIMU2.EIMU2菌株的形态特征发生了明显的改变,相较于原出发菌株EIM6,孢子色泽更黑,孢子团也较出发菌株大,菌丝与孢子上凝结有更多的液珠.复筛后EIMU2酶活为32 161 U/mL,较原出发菌株提高了1.212倍.进一步通过响应面法对EIMU2菌株的液体发酵培养条件进行优化.优化后的培养条件为甜菜渣1.83%,花生饼粉1.69%,(NH4)2SO4 0.5%,K2HPO4 0.3%,CaCO3 0.2%,MgSO4 0.15% (w/v),接种量6% (v/v),装液量21.36 mL.优化的突变菌株产酶活性进一步提高至98 794.3 U/mL,提高了2.07倍.【总页数】5页(P5-9)【作者】林伟铃;田宝玉;秦勇;吕睿瑞;王春香;强慧妮;黄建忠【作者单位】福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,生命科学学院,福建省现代发酵技术工程研究中心,福州,350108;福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,生命科学学院,福建省现代发酵技术工程研究中心,福州,350108;福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,生命科学学院,福建省现代发酵技术工程研究中心,福州,350108;福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,生命科学学院,福建省现代发酵技术工程研究中心,福州,350108;福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,生命科学学院,福建省现代发酵技术工程研究中心,福州,350108;福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,生命科学学院,福建省现代发酵技术工程研究中心,福州,350108;福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,生命科学学院,福建省现代发酵技术工程研究中心,福州,350108【正文语种】中文【相关文献】1.紫外诱变黑曲霉筛选高产果胶酶菌种 [J], 佘秋生;杨海波;杨冠军;薛银磊;祝小龙;单林娜2.12C6+离子束诱变选育温度耐受螺旋藻高产藻株及其培养条件的优化 [J], 王丽娟; 郑天翔; 杨宋琪; 李欣; 罗光宏3.利用木糖高产谷胱甘肽酵母菌株的诱变选育及培养条件优化 [J], 王晓琼;陈叶福;梁音;杨旭;肖冬光4.复合诱变选育壳聚糖酶高产菌种及产酶条件优化 [J], 王俊芳;张震;申梦雨;王刚5.人参叶中高产皂苷菌种的筛选及培养条件优化 [J], 冯颖;陶亮;肖学爱;赵存朝;李畅;田洋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
果胶酶高产菌株EIM_4的鉴定及其液体发酵条件优化
业,2000,26(4):82-85.[3]Feron G,Du fosse L ,Pierard E ,et al.Production ,identification and toxicity of γ-decalactone and 4-hydroxyde -canoic acid from Sporidiobolus spp .[J ].Applied and E nvironmental Microbiology ,1996,62(8):2826-2831.[4]王建龙,施汉昌.聚乙烯醇包埋固定化微生物的研究及进展[J ].工业微生物,1998,28(2):35-39.[5]李峰,吕锡武.聚乙烯醇作为固定化细胞包埋剂的研究[J ].中国给水排水,2000,16(12):14-17.[6]牛红星,邱蔚然.用固定化啤酒酵母细胞合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱[J ].华东理工大学学报,2002,28(4):372-375.[7]W anikawa A.,H os oi K.,K ato T.C onversion of unsaturated fatty acids to precurs ors of γ-lactones by lactic acid bacteria during the production of maltwhisky[J ].Journal of the American Society of B rewing Chemists ,2000,58(2):51-56.[8]于伟,徐岩,喻晓蔚,等.生物法转化分离耦合制备γ-癸内酯[J ].化工进展,2007,26(8):1151-1154.[9]周瑾,李雪梅,吕春华,等.地霉属真菌和棒状杆菌属株协同发酵生产γ-癸内酯[J ].生物技术通讯,2003,14(1):39-41.[10]王聪,宋焕禄,吕跃钢.复合诱变选育γ-癸内酯生产菌株[J ].食品科学,2007,28(6):237-240.[11]李花子,王建龙,文湘华.聚乙烯醇-硼酸固定化方法的改进[J ].环境科学研究,2002,15(5):25-27.[12]Zhuge J.M odern Ferment M icroorganism Experimental T echnology [M ].Beijing :Chem ical Industry Press ,2005:223-225.果胶酶高产菌株EIM -4的鉴定及其液体发酵条件优化柯崇榕,田宝玉,杨欣伟,林伟铃,黄薇,黄建忠3(福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,福建福州350108)摘要:目的:通过了解高产果胶酶菌株EI M -4的背景信息及优化其最适的产酶条件,为下一步工业化生产提供依据。
高速液相色谱法测定果胶酶活性的优化条件
高速液相色谱法测定果胶酶活性的优化条件果胶酶是一种特殊的水解酶，广泛存在于植物、真菌和细菌中。
其主要功能是分解果胶，促进果实软化，增加果汁浓度和流动性。
果胶酶的活性检测及分析一直是食品工业、饮料业和制药工业中非常重要的研究领域之一。
其中高速液相色谱法是一种快速、简便、准确，且能解决高分子物质分析问题的一种方法。
本文旨在探讨高速液相色谱法测定果胶酶活性的优化条件。
一、色谱柱的选择根据需求选择适当的色谱柱是高速液相色谱法测定果胶酶活性的第一步。
一般可选用聚合物或硅胶固定相的色谱柱，常见的是树脂交联聚合物色谱柱。
这种色谱柱具有较高的稳定性和抗溶液性，使得它能够在不同的实验条件下保持稳定性和准确性。
同时，聚合物色谱柱的多孔性能也保证了准确的分离和纯化果胶酶的效果。
二、流动相的配置高速液相色谱法需要在某些严格的条件下进行，如选择合适的流动相是非常关键的一步。
在测定果胶酶活性时，可以使用一些简单的有机酸盐类溶液作为流动相。
以磷酸二氢钾缓冲液和甲酸铵溶液（pH值为3.5）为例。
三、pH值的控制果胶酶比较适合在酸性条件下进行测定，因此需要严格控制流动相的pH值。
在进行实验前，应首先确定合理的流动相pH值范围。
通常采用pH值为3.5的磷酸二氢钾缓冲液和甲酸铵溶液进行测定。
当然，不同类型的果胶酶可能对不同的pH值有不同的适应性，因此需要根据实际情况进行合理的调整。
四、温度的影响温度是高速液相色谱法测定果胶酶活性的另一个重要参数，直接影响到果胶酶的活性。
一般情况下，室温（20-25℃）下进行实验即可，但需要根据实际情况进行调整。
如在低温（暴冷）下进行实验时，果胶酶的活性会下降，需要将流动相加温以提高温度。
五、测定数据的处理高速液相色谱法测定果胶酶活性后，需要对数据进行处理和分析。
通过对数据的统计和分析，可以得到果胶酶的活性值和一些相关的技术参数。
处理数据时需要注意对数据进行初步筛选和选择，确保获得的结果符合实际情况，同时需要对数据的精度和可靠性进行检查。
果胶酶高产菌的筛选及发酵条件的优化
酶 的总称 ， 同来 源 的果 胶酶其 特点也 不 同 ， 中微 不 其
生物来 源 的果 胶酶 主要有 聚半乳 糖醛 酸酶 （ Ｇ） 聚 Ｐ 、
半乳糖 醛酸裂 解酶 （ ＧＬ 、 甲基半 乳 糖 醛酸 裂 解 Ｐ ）聚
酶 （ ＭＧＬ 和 果胶 酯酶 （ Ｅ ｃ 果 胶 酶 的应用 十 分 Ｐ ） Ｐ ） ．
果胶 酶 （ ｅｔ ａｅ ） 指 能分 解 果 胶质 的多 种 ｐ ｃｉ ｓｓ 是 ｎ
பைடு நூலகம்
和 Ｆ ｓｒｕ ｎｌ ｏｍｅ进行 混合培 养 ， 生 的果 ｕａｉｍ ｍｏ ｉｆ ｙ ｉ 产
胶 酶 的活性可 以达到 １０ １ ６Ｕ ・ ， 单独 培养 ４ ． ｇ 是 Ａｓ ｅｇ ｌｕ ｉ ｅ ｐ ｒ ｉ ｓ ｇ ｒ活性 的 １ ７ ． ｌ ｎ ．倍 近年来 ， 随着 我 国果 汁和果酒 行业 的迅猛 发展 ， 对果胶 酶 的需求 日益 增 长 ， 胶 酶 制剂 的产 量和 质 果
．
ｐ ｏ ｕ ｅ ｙ ｔ ｅ ｓ ｒ ｉ ｎ ｅ ｈ ｐ ｉ ｕ ｃ ｎ ｉ ｏ ｅ ｃ ｅ ０ ７ ８ Ｕ ・ｍＬ ｒ ｄ ｃ ｄ ｂ ｈ ｔ ａ ｎ ｕ ｄ ｒｔ ｅ ｏ ｔ ｍ ｍ ｏ ｄ ｔ ｎ ｒ ａ ｈ ｄ １ ５ ｉ
Ｋｅ ｒ ｓ ｐ ｃ ｉ ａ ｅ ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ ｌ ｕ ｄ ｓ ｂ ｒ ｅ ｅ ｍｅ ｔ ｔ ｎ ｏ ｔ ｉｉ ｇ ｏ ｅ ｍｅ ｔ ｔ ｎ ｃ ｎ ｉ ｏ ｙ ｗｏ ｄ ： ｅ ｔ ｓ ； ｃ ｅ ｎ ｎ ；ｉ ｉ ｕ ｍｅ ｇ ｄ ｆ ｒ ｎ ａ ｉ ； ｐ ｉ ｚｎ ｆｆ ｒ ｎ ａ ｉ ｏ ｄ ｔ ｎ ｎ ｑ ｏ ｍ ｏ ｉ
中 图分 类 号 ： Ｑ ２ ． Ｔ ９５ ３ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ：１０ —３５ ２ １ ）３０ １—５ ０ ３４ １ （０ ０ ０ —１ ７０
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
业,2000,26(4):82-85.[3]Feron G,Du fosse L ,Pierard E ,et al.Production ,identification and toxicity of γ-decalactone and 4-hydroxyde -canoic acid from Sporidiobolus spp .[J ].Applied and E nvironmental Microbiology ,1996,62(8):2826-2831.[4]王建龙,施汉昌.聚乙烯醇包埋固定化微生物的研究及进展[J ].工业微生物,1998,28(2):35-39.[5]李峰,吕锡武.聚乙烯醇作为固定化细胞包埋剂的研究[J ].中国给水排水,2000,16(12):14-17.[6]牛红星,邱蔚然.用固定化啤酒酵母细胞合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱[J ].华东理工大学学报,2002,28(4):372-375.[7]W anikawa A.,H os oi K.,K ato T.C onversion of unsaturated fatty acids to precurs ors of γ-lactones by lactic acid bacteria during the production of maltwhisky[J ].Journal of the American Society of B rewing Chemists ,2000,58(2):51-56.[8]于伟,徐岩,喻晓蔚,等.生物法转化分离耦合制备γ-癸内酯[J ].化工进展,2007,26(8):1151-1154.[9]周瑾,李雪梅,吕春华,等.地霉属真菌和棒状杆菌属株协同发酵生产γ-癸内酯[J ].生物技术通讯,2003,14(1):39-41.[10]王聪,宋焕禄,吕跃钢.复合诱变选育γ-癸内酯生产菌株[J ].食品科学,2007,28(6):237-240.[11]李花子,王建龙,文湘华.聚乙烯醇-硼酸固定化方法的改进[J ].环境科学研究,2002,15(5):25-27.[12]Zhuge J.M odern Ferment M icroorganism Experimental T echnology [M ].Beijing :Chem ical Industry Press ,2005:223-225.果胶酶高产菌株EIM -4的鉴定及其液体发酵条件优化柯崇榕,田宝玉,杨欣伟,林伟铃,黄薇,黄建忠3(福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,福建福州350108)摘要:目的:通过了解高产果胶酶菌株EI M -4的背景信息及优化其最适的产酶条件,为下一步工业化生产提供依据。
方法:通过基于18S rDNA 序列的系统发育进化分析对果胶酶高产菌进行鉴定,通过单因素试验和均匀设计获得最适产酶条件。
结果:通过对18S rRNA 基因的分子系统进化分析,菌株EI M -4被鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger )。
通过单因素和均匀设计试验确定最佳产酶培养基为(g ΠL ):橘皮粉3219,黄豆粉1017,(NH 4)S O 42.1,CaC O 31.0,pH 自然。
结论:Aspergillus niger EI M -4的液体发酵产果胶酶的活力可达15159.82U Πm L 。
关键词:果胶酶;黑曲霉;分子系统进化;液体发酵;均匀设计中图分类号:Q946.5;Q93-331 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)05-0069-04Identification of A Pectinase -producing Fungi EIM -4and Its OrthogonalExperiment of Submerge Fermentation ConditionsKE Chong -rong ,T ian Bao -yu ,Y ANG X in -wei ,LI N Wei -lin ,H UANG Wei ,H UANGJian -zhong3(Engineering Research Center of Industrial M icrobiology ,M inistry of Education ,Fujian N ormal University ,Fuzhou 350108,China )Abstract :Objective :Developing available industrial technologies to produce pectinase by understanding basic in formation for a high pectinase -producing strain EI M4and optimizing its submerged fermentation conditions.Method :Identified strain EI M4by using m olecular phyloganaticanalysis of 18S rDNA sequences and im proved pectinase production by orthog onal experiment design.R esult :S train EI M -4was identified as As 2pergillus niger .Through orthog onal experiment ,the optimal submerge fermentation condition was obtained for producing extracellular pectinase.The suitable medium contained :orange peel power 32.97g ΠL ,s oybean flour 10.76g ΠL ,(NH 4)S O 42.14g ΠL ,CaC O 31.00g ΠL.,nature pH.Con 2clusion :The optimum pectinase activity of Aspergillus niger EI M -4is as high as 15159182U Πml.K ey w ords :pectinase ;Aspergillus niger ;phylogenetic analysis ;submerge fermentation ;orthog onal experiment收稿日期:2008-07-17;修回日期:2008-09-03基金项目:福建省科技厅重大项目(2005Q007)资助作者简介:柯崇榕(1984-),男,硕士生;3通讯作者:黄建忠(1966-),男,博士,教授,Email :hjz @ 。
果胶质广泛存在于高等植物中,是植物细胞胞间层和初生壁的重要组成成分。
近几年来,果胶质的生物降解日益引起国内外学者的广泛关注[1]。
果胶酶(Pectinases )是分解果胶质的一类复合酶的总称,主要通过裂解或β消去作用切断果胶质中的糖苷键致使果胶质裂解为多聚半乳糖醛酸,它广泛存在于各种细菌、真菌和放线菌等微生物中。
动植物天然来源的果胶酶产量低难于大规模提取制备,微生物才是生产果胶酶的优良生物资源[2]。
果胶酶类的应用领域非常广泛,不仅可用于食品工业如水果加工及葡萄酒生产等方面,还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理和饲料等行业中[1,3]。
黑曲霉是公认的安全菌株(G RAS:G enerally Regarded As Safe ),其代谢产物可直接用于食品工业,并且黑曲霉分泌的果胶酶系比较全[4]。
目前,工业用的果胶酶生产菌大多是通过黑曲霉固体发酵生产获得,但由于固体发酵规模生产受限且杂蛋白含量高,影响果胶酶的分离纯化[5,6]。
因此,筛选适合于液体深层发酵培养高产果胶酶菌株显得尤为重要。
本文基于18S rDNA 序列的系统发育学分析对筛选得到的高产碱性果胶酶的真菌进行鉴定,并对其液体深层发酵产酶条件进行初步优化,为下一步工业化生产或者分子育种提高果胶酶比活力奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和质粒真菌EI M -4和E scherichia coil DH5α(φ80lacZ ΔM15),均由工业微生物教育部工程研究中心保存。
pM D -18T S im ple Vec 2tor 购自T aK aRa Biotechnology (dalian )C o.,Ltd.1.1.2 试剂DNA 限制性内切酶、X -gal 、IPTG 、Marker 购自T aK aRa Bio 2technology (dalian )C o.,Ltd.,胰RNA 酶(RNaseA )购自Biotech C o.,Ltd ,W ozard S V G el and PCR Clean -up System 购自Promega Biotech C o.,Ltd ,氨苄青霉素购自上海生工生物工程公司。
1.1.3 培养基(1)固体分离培养基:K 2HP O 40.1g ;M gS O 40.5g ;NaNO 3313g ;FeS O 40.01g ;果胶0.2g ;琼脂粉0.15g ;加水至1L ,自然pH;(2)基础固体培养基:马铃薯200g ;葡萄糖20g ;琼脂粉15g ;水1L ,自然pH ;(3)基础液体培养基:3%橘皮粉;2%麸皮;0.35%(NH 4)2S O 4;0.2%的CaC O 3。
1.2 方法1.2.1 菌株基因组DNA 的提取采用改良的S DS 裂解法提取真菌EI M -4的基因组DNA [7]。
1.2.2 引物设计根据丝状真菌(曲霉)的18S rDNA 基因的保守序列设计一对通用扩增引物(由上海生工生物工程公司合成),其中:正向引物P f :5’-T CC AACCTGG TTG AT CCTG CC AG T A -3’反向引物Pr:5’-CCTTG TT ACG ACTT C ACCTT CCT CT-3’。
1.2.3 18S rDNA基因的克隆以提取的基因组DNA为模版,以上述设计引物为扩增引物,克隆真菌EI M-4的18Sr DNA,PCR反应条件为94℃预变性5min;94℃变性35s,55℃退火35s,72℃延伸2min,30个循环, 72℃最后延伸10min。
PCR结束后取2μl产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检验,其余-20℃保存备用。