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果胶酶高产菌株EIM -4的鉴定及其液体发酵条件优化

柯崇榕,田宝玉,杨欣伟,林伟铃,黄薇,黄建忠

3

(福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,福建福州350108)

摘要:目的:通过了解高产果胶酶菌株EI M -4的背景信息及优化其最适的产酶条件,为下一步工业化生产提供依据。方法:通过基于18S rDNA 序列的系统发育进化分析对果胶酶高产菌进行鉴定,通过单因素试验和均匀设计获得最适产酶条件。结果:通过对18S rRNA 基因的分子系统进化分析,菌株EI M -4被鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger )。通过单因素和均匀设计试验确定最佳产酶培养基为(g ΠL ):橘皮粉3219,黄豆粉1017,(NH 4)S O 42.1,CaC O 31.0,pH 自然。结论:Aspergillus niger EI M -4的液体发酵产果胶酶的活力可达15159.82U Πm L 。

关键词:果胶酶;黑曲霉;分子系统进化;液体发酵;均匀设计

中图分类号:Q946.5;Q93-331 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)05-0069-04

Identification of A Pectinase -producing Fungi EIM -4and Its Orthogonal

Experiment of Submerge Fermentation Conditions

KE Chong -rong ,T ian Bao -yu ,Y ANG X in -wei ,LI N Wei -lin ,H UANG Wei ,H UANGJian -zhong

3

(Engineering Research Center of Industrial M icrobiology ,M inistry of Education ,Fujian N ormal University ,Fuzhou 350108,China )

Abstract :Objective :Developing available industrial technologies to produce pectinase by understanding basic in formation for a high pectinase -producing strain EI M4and optimizing its submerged fermentation conditions.Method :Identified strain EI M4by using m olecular phyloganatic

analysis of 18S rDNA sequences and im proved pectinase production by orthog onal experiment design.R esult :S train EI M -4was identified as As 2pergillus niger .Through orthog onal experiment ,the optimal submerge fermentation condition was obtained for producing extracellular pectinase.The suitable medium contained :orange peel power 32.97g ΠL ,s oybean flour 10.76g ΠL ,(NH 4)S O 42.14g ΠL ,CaC O 31.00g ΠL.,nature pH.Con 2clusion :The optimum pectinase activity of Aspergillus niger EI M -4is as high as 15159182U Πml.

K ey w ords :pectinase ;Aspergillus niger ;phylogenetic analysis ;submerge fermentation ;orthog onal experiment

收稿日期:2008-07-17;修回日期:2008-09-03

基金项目:福建省科技厅重大项目(2005Q007)资助

作者简介:柯崇榕(1984-),男,硕士生;3通讯作者:黄建忠(1966-),男,博士,教授,Email :hjz @https://www.360docs.net/doc/9611058832.html, 。

果胶质广泛存在于高等植物中,是植物细胞胞间层和初生壁的重要组成成分。近几年来,果胶质的生物降解日益引起国内外学者的广泛关注[1]。果胶酶(Pectinases )是分解果胶质的一类复合酶的总称,主要通过裂解或β消去作用切断果胶质中的糖苷键致使果胶质裂解为多聚半乳糖醛酸,它广泛存在于各种细菌、真菌和放线菌等微生物中。动植物天然来源的果胶酶产量低难于大规模提取制备,微生物才是生产果胶酶的优良生物资源[2]。果胶酶类的应用领域非常广泛,不仅可用于食品工业如水果加工及葡萄酒生产等方面,还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处

理和饲料等行业中[1,3]

。

黑曲霉是公认的安全菌株(G RAS:G enerally Regarded As Safe ),其代谢产物可直接用于食品工业,并且黑曲霉分泌的果胶酶系比较全[4]。目前,工业用的果胶酶生产菌大多是通过黑曲霉固体发酵生产获得,但由于固体发酵规模生产受限且杂蛋白含量高,影响果胶酶的分离纯化[5,6]。因此,筛选适合于液体深层发酵培养高产果胶酶菌株显得尤为重要。本文基于18S rDNA 序列的系统发育学分析对筛选得到的高产碱性果胶酶的真菌进行鉴定,并对其液体深层发酵产酶条件进行初步优化,为下一步工业化生产或者分子育种提高果胶酶比活力奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料1.1.1　菌株和质粒

真菌EI M -4和E scherichia coil DH5α(φ80lacZ ΔM15),均由

工业微生物教育部工程研究中心保存。pM D -18T S im ple Vec 2tor 购自T aK aRa Biotechnology (dalian )C o.,Ltd.1.1.2　试剂

DNA 限制性内切酶、X -gal 、IPTG 、Marker 购自T aK aRa Bio 2technology (dalian )C o.,Ltd.,胰RNA 酶(RNaseA )购自Biotech C o.,Ltd ,W ozard S V G el and PCR Clean -up System 购自Promega Biotech C o.,Ltd ,氨苄青霉素购自上海生工生物工程公司。1.1.3　培养基

(1)固体分离培养基:K 2HP O 40.1g ;M gS O 40.5g ;NaNO 3313g ;FeS O 40.01g ;果胶0.2g ;琼脂粉0.15g ;加水至1L ,自然pH;

(2)基础固体培养基:马铃薯200g ;葡萄糖20g ;琼脂粉15g ;水1L ,自然pH ;

(3)基础液体培养基:3%橘皮粉;2%麸皮;0.35%(NH 4)2S O 4;0.2%的CaC O 3。1.2　方法1.2.1　菌株基因组DNA 的提取

采用改良的S DS 裂解法提取真菌EI M -4的基因组DNA [7]

。1.2.2　引物设计

根据丝状真菌(曲霉)的18S rDNA 基因的保守序列设计一对通用扩增引物(由上海生工生物工程公司合成),其中:

正向引物P f :5’-T CC AACCTGG TTG AT CCTG CC AG T A -3’

反向引物Pr:5’-CCTTG TT ACG ACTT C ACCTT CCT CT-3’。

1.2.3　18S rDNA基因的克隆

以提取的基因组DNA为模版,以上述设计引物为扩增引物,克隆真菌EI M-4的18Sr DNA,PCR反应条件为94℃预变性5min;94℃变性35s,55℃退火35s,72℃延伸2min,30个循环, 72℃最后延伸10min。PCR结束后取2μl产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检验,其余-20℃保存备用。

1.2.4　18S rDNA基因的连接转化和阳性克隆子的PCR验证

根据W ozard S V G el and PCR Clean-up System试剂盒操作步骤回收纯化琼脂糖凝胶上的18S rDNA基因,连接到pM D-18T S im ple Vector上,并转化感受态细胞E.coil DH-5α,涂布于含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板,37℃培养。利用蓝白斑法筛选阳性克隆子,挑取数个白色菌落于4ml含有100μgΠml的LB培养基中过夜培养。分别以pM D-18T测序引物和18S rDNA通用引物为引物,以过夜培养菌液为模板进行菌落PCR。

1.2.5　序列测定及序列分析

挑取经菌落PCR验证的阳性克隆子用M13引物进行正反两方向序列测定,利用DNA ST AR拼接两条序列片段并去除pM D18-T S im ple载体序列获得目的18S rDNA,并将其提交NC BI。利用NC BI数据库中的BLAST工具对菌株EI M-4的18S rDNA序列进行序列相似性分析。选取部分同源序列和黑曲霉EI M-4的18S rDNA序列利用clustaL x软件包进行序列同源进化比对,形成一个多重序列匹配排列矩阵。然后,运用phylip软件包中的Seqboot程序生成1000个自展数据集,采用邻位相连(Neighbor-joining)算法,经C onsensus程序计算多数一致树,构建系统发育进化树[8]。

1.2.6　培养基的优化

通过单因素试验确定黑曲霉EI M-4的最佳碳氮源,以确定的最佳碳氮源和(NH

4

)2S O4、CaC O3四因素为变量[9],设计4因素6水平有重复的均匀设计U63。利用软件DPS专业版的试验设计功能,以中心化偏差为均匀性度量指针,经过计算机多次运行寻优确定多因素多(水平)处理的均匀设计方案,利用软件的多元分析功能进行实验数据分析[10]。

1.2.7　果胶酶活力测定

采用3,5一二硝基水杨酸法(DNS法)[11]。向15ml具塞试管中加入0.8m L1.0%的果胶溶液,于50℃水浴下保温3min,然后加入一定稀释倍数的酶液0.2m L反应10min,加入DNS试剂3m L,混匀,在沸水中加热10min,立即冷却定容至15m L, 540nm测定吸光值。空白用煮沸失活的酶液代替。活力定义为:上述实验条件下,每分钟水解果胶产生1μg还原糖(以半乳糖醛酸计)所需酶量定义为一个酶活力单位(u)。

2　结果与分析

2.1　基因组DNA的提取

利用改进的S DS裂解法所提取的基因组DNA经紫外检测和1.0%的琼脂糖凝胶(E B染色)电泳鉴定,均符合实验要求。

2.2　18S rDNA基因序列的鉴定

2.2.1　EI M-4的18S rDNA基因序列的克隆

在形态及产孢结构观察的基础上,对真菌EI M-4进行了18S rDNA分子鉴定。以基因组为模板DNA进行PCR扩增,30个循环后通过1.0%的琼脂糖凝胶(E B染色)电泳检测扩增产物,成功扩增出约1800bp的特异性扩增条带(图1-1)。

2.2.2　EI M-4的18S rDNA基因阳性克隆子的筛选与验证

将上述PCR产物回收纯化后,克隆到pM D18-T S im ple Vector中,转化E.coli DH5α,经蓝白斑筛选重组子。随机挑选白色菌落37℃振荡培养12h后进行菌落PCR,验证所挑选的阳性克隆子,1.0%的琼脂糖凝胶(E B染色)电泳检测扩增产物(图1-2)。从图中可以看出,4、6、8号泳道上均出现了大小约为1800bp的特异性条带,5、7、9号泳道上均出现了大小约为1900bp的特异性条带,与18S rDNA的PCR结果一致,表明所挑取的白色菌落为阳性克隆(4、6、8所采用的菌落模板分别对应于5、7、9)

。

图1-1　18S rDNA PCR产物电泳分析

Fig.1-1　E lectrophoresis of18S rDNA gene

图1-2　阳性克隆子的菌落PCR电泳分析

Fig.1-2　E lectrophoresis of colony PCR

M:D L2000M arker;1-3为18S rDNA扩增产物;4、6、8为18S rDNA引物的扩增产物;5、7、9为T载体通用引物的扩增产物。

2.3　18S rRNA基因序列及系统进化树分析

2.3.1　18S rDNA全序列测定

菌株EI M-4的18S rDNA基因序列全长为1770bp(图2,深色部分为引物序列),并提交NC BI(登录号:E U884135)。2.3.2　18S rDNA系统进化树分析

将EI M-418S rDNA基因提交G enBank进行Blast同源性检索。结果表明,该菌的18S rDNA基因与Aspergillus niger的相似性均超过98%,特别是与已完成基因组全序列的黑曲霉标准菌Aspergillus niger C BS513.88的相似性高达99%。

根据前期的菌种菌落形态、孢子形态和菌丝体形态初步鉴定该果胶酶产生菌为曲霉属菌株,为了进一步确定菌株的分类地位,以便对其进行更深入研究,选取了已公布18S rDNA 序列的曲霉属的菌株和与曲霉亲缘关系较近的青霉属的菌株进行聚类分析。同时选取根霉菌株Mucor racemosus作为外类群,利用N-J法构建系统进化树(图3)。

从系统发育树上可看出,果胶酶产生菌EI M-4与黑曲霉聚类在一起,可见该菌株与黑曲霉的亲缘关系最近。18S rDNA 作为分子标记可有效地鉴别果胶酶的分类地位,因此可以鉴定真菌EI M-4为Aspergillus niger。

2.4　果胶酶产生菌EI M-4液体发酵条件的优化

2.4.1　单因素试验

(1)最适碳源的选择

分别以4%橘皮粉(A)、4%葡萄糖(B)、4%乳糖(C)、4%可溶性淀粉(D)、4%蔗糖(E)作为碳源进行液体深层发酵进行最

图2　真菌EI M -4的18S rDNA 基因序列(G enBank :E U884135)Fig.2　18S rDNA

gene sequence of EI M -4(G enBank :E U884135)

图3　EI M -4的18S rDNA 进化树Fig.3　18S rDNA phylogenetic tree of EI M -4

适碳源筛选。试验重复3次,每次3个平行样。液体深层发酵结果(图4)表明,以4%橘皮粉为碳源的效果最好,其果胶酶活力可达9308U Πm L ,表明4%橘皮粉为最适碳源。

(2)最适氮源的选择

以4%橘皮粉作为发酵培养基中的碳源,分别以3%麸皮+0.35%硫酸铵(A )、3%玉米粉+0.35%硫酸铵(B )、2%硫酸铵(C )、3%黄豆粉+0.35%硫酸铵(D )、4%麸皮(E )为氮源进行液体深层发酵进行最适碳源筛选。试验重复3次,每次3个平行样。液体深层发酵结果(图5)表明,以3%玉米粉+0.

35%硫酸铵为氮源的效果最好,其果胶酶活力可达

11

087U Πm L ,表明3%玉米粉+0.35%硫酸铵为最适氮源。

图4　

不同碳源对产酶的影响

Fig.4　E ffects of different carbon s ources to pectinase activity

图5　不同氮源对产酶的影响

Fig.5　E ffects of different nitrogen s ources to pectinase activity

2.4.2　均匀设计

根据单因素试验结果,采用U63均匀设计试验对培养基中的碳氮源进行、源优化。(表1)

对表1的试验结果进行二次多项式回归分析,结果如下:对Y 的回归方程为:

Y=22125.41085-6789.134514X 4-1.1720288994X 23X 2+563.7696779X 43X 4+6.113766741X 23X 4

表1　均匀设计方案及结果T able 1　Uniform experimental design and pectinase activity 实验号

X1X2X3X4Activity (U Πm L )

1

50401516362106034123033030661724440505113280560104369006

20

20

2

2

10571

X1:orange peel power (g ΠL );X2:s oybean flour (g ΠL );X3:(NH 4)S O 4(g ΠL );X4:CaCO 3(g ΠL )。

相关系数R =1.0000,F 值=85220.1759,剩余标准差S =19.8784,显著水平p =0.0026,说明该方程能够较好得拟合出培养基主要成分对果胶酶产酶活力的影响,所建模型准确有效。

回归方程各项指标均通过检验,对方程各变量偏导求极值可得:橘皮粉为32.97g ΠL ,黄豆粉为10.76g ΠL ,(NH 4)S O 4为2.14g ΠL ,CaC O 3为1.00g ΠL ,Y (酶活)最优值预测为:16830.09U Πm L 。

采用优化后的培养基重新发酵,其它条件不变,试验重复3次,每次3个平行样。所测酶活15159.82U Πm L (图6),比理论预测值低,

但比未优化前提高了36%。

图6　Aspergillus niger EI M -4产生的果胶酶活力曲线Fig.6　Pectinase activity curve of A .niger EI M -4

3　讨论

目前,酸性果胶酶主要用于水果榨汁和果汁澄清,而碱性果胶酶的应用领域十分广泛,包括纺织、造纸、环境和食品等

领域[9,12]

。黑曲霉作为G RAS 菌株,其发酵产生的果胶酶在食品工业更具有广泛的应用前景。目前,固体发酵产果胶酶活

力可达40万U Πg [13]

而液体深层发酵最高酶活力只达18.59万

U Πm L [14]

,虽然固体发酵生产果胶酶的酶活力较高,但是由于固体发酵产生较多的杂蛋白,分离纯化成本很高,回收率较低(30%～50%左右),产品质量产量均很难达到食品行业的使用要求[3]。因此,寻找适合于液体深层发酵生产果胶酶的高产黑曲霉菌株已经成为工业果胶酶制剂的研究热点。

张浩森等[15]筛选得到一株曲霉并优化其发酵条件,果胶

酶活力可达13968U Πm L 。而佘秋生等[6]

通过在500L 发酵罐

进行深层液体发酵中试,将果胶酶活力从摇瓶发酵的3016.7U Πm L 提高到37262U Πm L 。作者根据18S rDNA 基因序列同源性分析法鉴定菌种原则,采用Felsenstein 进化距离算法构建系统发育进化树,确定EI M -4的分类学地位。结果表明,EI M -4菌株与黑曲霉具有很高的同源性,其序列相似性均在98%左右。因此,菌株EI M -4鉴定为Aspergillus niger 。通过单因素试验对Aspergillus niger EI M -4产果胶酶的碳氮源进行优化,采用橘皮分、玉米粉和硫酸铵为碳氮源有利于果胶酶的产生积累。采用均匀设计的统计学方法,建立黑曲霉产果胶酶液体发酵的二次多项式逐步回归数学模型。通过对模型方程的分析,获得了该菌株发酵产酶的最佳培养基配方,果胶酶发酵酶活高达15159.82U Πm L 。作者使用橘皮分和麸皮和廉价原材料作培养基,因而更具有工业化前景。本实验只优化Aspergil 2lus nige EI M -4的培养基,其果胶酶活力达15159.82U Πm L ,为下一步培养条件进行优化并进行发酵中试及其分子育种奠定基础。

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降解豆粕菌株的筛选及其发酵工艺研究

陈济琛,陈名洪,林新坚

3

(福建省农业科学院土壤肥料研究所,福建福州350013)

摘要:以脱脂豆粕粉为原料,接入产蛋白酶能力较强的菌株进行发酵,通过菌株所产蛋白酶作用于豆粕粉中的大豆蛋白将其水解为大豆多肽。以蛋白酶活力及水解度为指标逐步筛选降解豆粕的菌株,获得菌株CH D16;以水解度作为指标,对菌株CH D16发酵降解豆粕的条件进行了优化。通过液体发酵探讨菌株CH D16适宜的培养基组成、接种时间、接种量与发酵时间。结果表明:在豆粕含量11%,蔗糖含量2%的液体发酵培养基中接种3%的菌龄为21h 的液体种子,于温度40℃、转速120r Πmin 条件下发