果胶酶高产选育课程论文

海南大学（儋州校区）农学院

生物技术专业课程论文（设计）

题目：果胶酶高产菌种选育研究进展

学生：王鹤松

学号： B0704030 专业年级： 2007级生物技术（1）班

指导教师：朱稳

二o一o年六月二十五日

果胶酶高产菌种选育研究进展

王鹤松

（海南大学海南儋州571737 B0704030）

摘要：果胶酶是能协同分解果胶质的一组酶的总称，在生产，造纸，食品发酵等方面有广泛应用。本文对酸性果胶酶和碱性果胶酶生产菌种的特点分别进行了介绍，并从传统育种、诱变育种和基因工程育种三个方面对果胶酶产生菌的高产育种技术的研究进展进行了综述。关键词：果胶酶；微生物；选育；影响因素

Development on the Breeding of Pectinase High-yielding

Strains

Hesong Wang

( Hainan University, Danzhou, Hainan ，571737，B0704030 )

Abstract：For pectinase is coordinated with pectin can decompose the floorboard of a group of enzymes in production, papermaking, fermentation etc, food is widely used. Based on acid and alkaline pectic enzymes for pectinase strains of production were introduced, and from conventional breeding, mutation breeding and gene engineering to produce three aspects of bacteria for pectinase high-yielding breeding technology is reviewed.

Key words：pectinases；microbe；mutafacient；influencing factor

果胶酶（pectinases）是指能协同分解果胶质的一组酶的总称，是一种复合酶（由D-半

乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接形成的直链状的聚合物）。它通常包括原果胶酶（PPase）、多

聚半乳糖醛酸酶（PG）、裂解酶（PL）和果胶酯酶（PE）等4类。如果从生产、应用领域

和最适用pH值环境来划分，果胶酶通常可以分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。酸性果胶酶通

常是指内聚半乳糖醛酸酶（endo-polygalacturonase，EC3.2.1.15）[1]，因为大多数的聚半乳糖

醛酸酶的最适pH值为3.5~5.5。它是以水解作用方式无规则切断果胶酸分子的α-1，4糖苷

键，主要应用于食品工业中果蔬汁和果酒的提取和澄清。碱性果胶酶一般多指聚半乳糖醛酸

裂解酶（polygalacturonate lyase，EC4.2.2.1），它是以反式消去作用方式裂解果胶酸分子的α

-1，4糖苷键[1]，将复杂的果胶分解成小分子，如半乳糖醛酸。碱性果胶酶在碱性范围内具有较高活性，其主要应用于植物病毒的纯化、诱导植物抗病、纸浆漂白、棉织物处理、含果胶污水处理、咖啡和茶的发酵生产，以及榨油、木材防腐、洗涤剂和家禽饲料加工[2]等。并且，果胶酶在全世界食品酶的销售额中占25%[3]。因此，果胶酶的菌种选育尤为重要，通过对酸碱性果胶酶菌种的种群特点的深入研究，更有利于菌种进行选育，获得高产的优良菌株，并通过对影响微生物产果胶酶的各种因素进行分析，可以更深层次为果胶酶的选育提供帮助。

1 产果胶酶的微生物种群及其特点

在微生物中,细菌、放线菌、酵母和霉菌都能代谢合成果胶酶，但主要以霉菌中的曲霉以及杆菌为主。由于真菌中的黑曲霉（Aspergillus niger）属于公认安全级,其代谢产物是安全的,因此目前市售的食品级果胶酶主要来源于黑曲霉，最适pH 值一般在酸性范围[4]。目前国内外研究和应用较多的果胶酶产生菌是细菌和霉菌，也有放线菌中的链霉菌属产生果胶酶的报道[3]。酵母菌中只有很少一部分株系产生果胶酶，如：酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）[5]。日本学者Sakai早在1978年就从酵母菌中筛选出产原果胶酶的菌株。但是有关酵母菌产生果胶酶的报道更多的是在关于基因克隆技术的应用和研究上。

1.1产酸性果胶酶的微生物种群及其特点

生产酸性果胶酶的菌种以霉菌居多，已见报道的产果胶酶的霉菌种类大约包括20个属，如曲霉属（Aspergillus sp）.、灰霉菌属（Botrytis sp）.、镰孢菌属（Fusarium sp）.、炭疽菌属（Colletotrichum sp）.、核盘菌属（Scletorium sp）.和玉圆斑菌属（Cochliobolus sp）.等[3]。目前，黑曲霉、根霉和盾壳霉作为产果胶酶的菌株已经商品化。国内外对霉菌发酵产果胶酶的研究又主要集中在曲霉属中，而对于曲霉属中研究最多的是黑曲霉。其原因是，果胶酶被广泛应用于食品工业中，而生产食品酶制剂的菌株必须是安全菌株。黑曲霉分泌的胞外酶系较全，不仅可以产生大量果胶酶，而且黑曲霉是公认的安全菌株。另外，黑曲霉产生的果胶酶最适pH值一般在酸性范围内，这也是其被应用于食品工业行业中的原因之一[3]。孙维国等人[5]选育的黑曲霉SS-A-52产果胶酶活力达10.46×104 U/mL，尝试分批补料工艺，产酶更是提高到18.59×104 U/mL。田林茂等人[7]以黑曲霉HG-1为生产菌，通过优化发酵条件，生产的果胶酶酶活力可达22 248 U/g。除了黑曲霉之外，邬敏辰等人[7]选育了一株高产酸性果胶酶的宇佐美曲霉，在优化的发酵条件下，干曲的酶活力最高达48 31I U/g。彭霞薇等人[8]对草酸青霉菌BZH-2002产果胶酶固态发酵条件及酶学特性进行了研究。张宁欣等人[9]以米曲霉为出发菌株，选育出一株果胶酶高产稳定突变株ZI-47，其产酶为出发菌株的10倍。顾红燕等人[10]还研究了高大毛酶产酸性果胶酶。

1.2产碱性果胶酶的微生物种群及其特点

碱性果胶酶大多由细菌、放线菌产生。至今已分离鉴定出几十种碱性果胶酶生产菌[11]。其中细菌杆菌属的碱性果胶酶日益受到重视[4]。细菌中的欧文氏杆菌（Erwinia sp）.、芽孢杆菌（Bacillus sp）.、节杆菌（Arthrobacter sp）.和假单胞杆菌（Pseodomonas sp）.都产生果胶酶，但能生产碱性果胶酶并具有工业化使用前景的菌种并不多，仅有嗜碱性芽孢杆菌属和欧文氏杆菌属。另外，放线菌及螺孢菌等也是具有工业使用前景的碱性果胶酶生产菌[13]。嗜碱性芽孢杆菌属和欧文氏杆菌属由于在苎麻和红麻的脱胶、生物制浆及污物的处理软化等方面的可观应用前景，因而受到较多的关注和研究。碱性果胶酶也可由真菌产生，包括意大

利青霉（Penicillium Italicum）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）[11]。张健红等人[10]从腐烂的苹果皮中筛选出一株芽孢杆菌WSHB04-02，在优化培养条件下，其酶活力达到34 U/mL。李建洲等人[12]对嗜盐嗜碱菌（Alkalibacterium sp）.F26的发酵产碱性果胶酶培养基和培养条件进行优化，酶活力达1 015 U/mL。张保国等人[13]对克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausi）iS-4菌株产碱性果胶酶的固态发酵条件进行优化，甜菜粕产酶活力可达2 300 U/g。李祖明等人[14]研究的吉氏芽孢杆菌产碱性果胶酶，干甜菜渣酶活力达6.05×103 U/g。刘慧娟等人[15]优化了芽孢杆菌产碱性果胶酶的温度控制策略，使产碱性果胶酶酶活力达53.0 U/mL。

2高产菌种的选育

通过传统育种和诱变育种以及基因育种的手段，我们可以获得许多高产的优良菌株，而应用上大部分采用是诱变育种，通过不定向的诱变方式，采用多种手段，如化学试剂、激光、等方法，可以更好的使我们获得高产优良的菌株。当然采用定向的基因工程和比较传统的育种方式往往也可以得到不错的成果。

2.1传统选育

用平板筛选菌株是最传统的选育方法，据目标菌种的生长特点，应用不同的培养基进行筛选，过程步骤简单原理简明易懂，是微生物筛选菌种技术最为成熟的方法。全桂静等利用平板菌落法从腐烂的南果梨中成功第筛选出果胶酶的生产菌株，并以沉淀圈确定胞外果胶酶的存在；通过比较果胶酶活力,筛选得到一株果胶酶高产霉菌，最后得干曲果胶酶活性高达到6635U/ g[16]。杨欣伟, 林伟铃等以黑曲霉菌株为菌种,经过3轮的果胶平板初筛, 筛选到具有较好果胶水解活性的菌株12 株, 再通过DNS法对其进行复筛, 实验得到一株果胶酶产量达到14562 U/mL的优良菌株[17]。通过科研人员的大量实验,结果表明用平板筛选菌株是可行的。

2.2诱变育种

虽然诱变育种方法产生的是不定向变异，但诱变结果相对于单纯的培养基选育均有较大的突变率。菌种通过合适的诱变，能更好地选育出产酶量更高、酶学性质更稳定、针对性更强的新菌株。目前多种诱变技术相结合的复合诱变已广泛应用于果胶酶菌种诱变选育中。2.2.1化学诱变

化学诱变是由于化学试剂能导致遗传物质中一个或几个碱基发生变化，由不正常配对而产生突变。化学诱变由于其用量少、操作简便，因此成为生产果胶酶常用的诱变育种方法之一。果胶酶生产菌种常用亚硝基胍、硫酸二乙酯（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝酸等作为化学诱变试剂。Hadj-TaiebNoomen[18]采用亚硝酸对青霉菌（Penicillium occitanis）进行诱变，得到一株突变型菌株CT1，该菌株产酶活力远远高于原始菌株，并且不需果胶或其他类似物的诱导，降低了生产成本。但由于有高效诱变作用的诱变剂并不多，因此更多的人都选用化学诱变配合其他诱变方式的诱变方法，几乎很少使用单一的化学诱变法。

2.2.2辐照诱变

辐照诱变一般是利用具有穿透性的射线照射需诱变的生物体，使其发生突变的一种育选方法。只要放射性物质不泄露，就不会对人体产生危害，操作也甚为简便，是一种安全简便、行之有效的育种手段。果胶酶育种中使用的辐照诱变通常有紫外线诱变、微波诱变、60Co-γ射线诱变、He-Ne激光诱变等。紫外线诱变应用得相对比较多。而微波诱变、He-Ne激光诱变尽管在众多的果胶酶的研究报告中应用得还比较少，但也越来越被重视。李延生等人[19]使用微波诱变表明，诱变的突变率较大，且最高正突变发生的酶活力都要高出数十个百分点。其实，许多诱变育种经常是将几种方法组合进行连续诱变，如李延生等人[18]利用紫外线和微波复合诱变选育出一株高产菌株Aspergillus niger 3502，其果胶酶产酶能力比出发菌株提高了2倍，酶活力达2 644 U/g。张宁欣等人[9]以米曲霉为出发菌株，经紫外线、60Co-γ射线、硫酸二乙酯连续诱变，获得一株果胶酶高产、稳定的突变株ZI-47，其产酶为出发株的10倍，并且遗传性状十分稳定，在连续传12代、4℃冰箱中保存1年的条件下，酶活力基本没有降低。辐照诱变由于其相对经济，操作简便，效率高，因而是使用较多的诱变方法。

2.2.3 N+离子注入诱变

另外，还有一种N+离子注入诱变，即用一定能量的离子束，以一定的离子注入剂量注入生产菌的成熟孢子中。N+为组成DNA碱基的重要元素之一，N+注入不仅可以直接引起前碱基分子结构的变化，还可产生大量反应活性很高的自由基，导致DNA直接或间接的损失或断裂，产生的诱变突变较多[20]。南京农业大学的张一青等人就使用此方法对黑曲霉进行诱变育种，筛选出一株稳定的高产原果胶酶菌株Z-25，发酵至72 h时，酶活力达最高，比原始菌株提高179%，每1 g干细胞活性比原始菌株提高了84%。此方法能大幅度地提高菌株产酶能力，诱变效率高，但是，对于设备和操作技术的要求较高，成本也较高。离子注入技术现已成为一种日趋成熟的特殊物理化学复合诱变方法。

2.3基因工程育种

近年来，果胶酶分子生物学研究进展迅速，对果胶酶基因的结构、功能、调控、录译后加工等方面均进行了深入研究，已从不同属的真菌、细菌和放线菌中克隆和测序的果胶酶基因至少有70个[3]，其中从11个属的真菌中克隆并测序了50个以上的基因。已克隆的微生物以黑曲霉和欧文氏菌为主；克隆的果胶酶基因以多聚半乳糖醛酸酶基因和果胶裂解酶基因为主[21]，也有果胶酯酶（PE）基因和鼠李半乳糖醛酸酶（RHG）基因，大多有内含子。尽管国内的果胶酶研究也已步入了分子水平，但国内研究者更多的还是从事菌种的筛选、诱变和培养条件的优化等工作，对分子生物学方面的研究也是近几年才开始多起来。随着生物技术的发展，利用基因工程技术进行菌种选育已经成为科学探索的重要方向。

目前克隆技术研究报道较多的是碱性果胶酶。南京农业大学的刘连成等人[22]从实验室筛选保存的地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis DG-3）菌株中扩增出碱性果胶酶的结构基因pelA，将pelA基因在大肠杆菌中（E.col）i表达，发酵液菌体的碱性果胶

酶酶活力为12 U/mL。

江南大学的甄东晓等人[23]从耐热梭状芽孢杆菌（Clostridium stercorarium PCR）中扩增得到产耐热果胶裂解酶的结构基因pel9A，并将其克隆于表达载体pET28a中，最后将此重组质粒转化到受体菌E.colBL-21中进行表达，测得粗蛋白的果胶酶比酶活力为15 U/mg。Kluskens L D[24]通过基因工程技术构建了一株产果胶酸裂解酶的菌株，所产酶最适温度为90℃，热稳定性很好，是迄今所知最耐热的果胶酶。

基因工程技术改变菌株的遗传结构，不仅使菌种的产酶量有较大的提高，而且能够改变酶的性质，使多种有利特性集中到一株菌种上，缩短了从探索研究到应用的时间，克服了传统育种方法的盲目性。

3建议与展望

自然界产果胶酶的菌种很多,但采集的样品中常含有多种多样的微生物,其产酶的性能差异很大,所需要的目的菌种含量很少,为此,需要通过选择一定的增殖培养基并控制一定培养条件而提高分离所需菌株的筛选机率。目前，对不同来源的果胶酶菌种的高产育种已有相关研究，单一诱变方法的使用较少，许多都是几种诱变方法的组合，化学诱变以及辐照诱变中的紫外诱变由于其操作简单、来源方便而使用较多。另外，随着基因工程技术在高产菌选育领域的不断突破，果胶酶应用领域也将更加拓宽。

而今后的研究应当从以下几个方面进一步加强，首先是选育高产应用效果良好的菌株，发现更好、更合适的生产菌；其次是菌种培养技术的改进（包括发酵条件和诱变方法）；再次是从分子生物学方面着手进行研究。最后对于技术的改革，尽量的改革创新，采用多方面结合的手段，进行改造，例如在分子生物学方面，可以采取更有效，更有针对性的改造，使育种的目的性更明确，甚至可以培育一些综合性较强的菌种。在随着基因工程菌的筛选和构建，将有望选育出一些极端环境下（如广泛pH值、高温）高活性的果胶酶生产菌，以及一些专项针对某种产品的特殊果胶酶生产菌。这样，果胶酶生产菌大规模应用所受到的限制将有望得到突破，生产应用将得到更好的发展。

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