褪黑素对饮水氟染毒大鼠脑组织氧化应激的影响_王菲

取脑组织匀浆上清液 1.0 ml，严格按照试剂盒的说明进行 操作。采用二硫代二硝基甲酸比色法测定 GSH 含量，采用黄嘌 呤氧化酶法测定 SOD 活力[6]，采用硫代巴比妥酸法测定 MDA 含 量。同时，采用考马斯亮蓝 G250 测定细胞内蛋白质水平，并进 行校正。 1.7 血清褪黑素水平的检测
作者单位：1.中国医科大学公共卫生学院地球化学性疾病教研室(辽宁 沈阳 110001)；2.中国医科大学七年制学生（辽宁 沈阳 110001）
作者简介:王菲(1985-），女，硕士研究生，从事地球化学性疾病研究。 通讯作者:席淑华，E-mail：shxi@
化应激状态和 MEL 分泌影响以及 MEL 的干预作用，本研究通 过建立饮水氟染毒中毒模型，同时给予 MEL 干预，检测脑组织 中的氟含量、氧化应激状况以及 MEL 水平，以探讨氟引起的中 枢神经系统损伤机制，为防治氟中毒提供实验依据。
Key words：Fluorides；Oxidative stress；Melatonin；Brain tissue
氟是人体必需的微量元素，在体内发挥重要的生物学作用， 但过量的氟摄入会导致氟中毒。氟中毒除可引起氟斑牙和氟骨 症外，也可引起其他器官系统的损伤。近年来，有调查显示，高氟 可引起中枢神经系统功能的改变，高氟地区的儿童智商（IQ）水 平要比低氟地区的儿童低 8～10 分[1，2]，但氟所致的神经系统损 伤机制尚不清楚。目前，被普遍接受的是氟致氧化应激学说，氟 可以刺激活性氧自由基产生，抑制抗氧化酶的活力，引起氧化损 伤[3，4]。褪黑素( melatonin，MEL)具有抗衰老和清除自由基的作 用，而且易于穿过生理屏障进入细胞，以保护细胞膜的脂质、胞 质中的结构蛋白和胞核内的 DNA，特别是对胞膜脂质的保护可 减少氧化产物的产生。有实验证明，在衰老的过程中，MEL 可以 抗氧化应激相关的细胞损伤和细胞凋亡[5]。为了解氟对大鼠脑氧
环境与健康杂志 2010 年 10 月第 27 卷第 10 期 J Environ Health, October 2010, Vol．27, No．10
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公司，大鼠褪黑素酶联免疫分析试剂盒（美国 RB 公司）。 氟化钠 （分析纯，北京化工厂），MEL （纯度≥98%，美国
Sigma 公司），脂肪酶、K 蛋白酶（瑞士 Roche 公司），浓 H2SO（4 优 级纯，北京化工厂），硫酸银（优级纯，天津市光复精细化工研究 所)，氢氧化钠乙醇溶液，显色剂，Tris 液。其他分析试剂均为分 析级。
将大鼠驯化 1 周后，按体重随机分为 5 组，分别为对照组 （蒸馏水，8 只），60、120 mg/L 氟单独染毒组 （各 7 只），60 mg/L 氟+5 mg/kg MEL 联合染毒组和 120 mg/L 氟+5 mg/kg MEL 联合 染毒组（各 6 只）。染毒期间，各组小鼠饮用相应浓度的氟化钠溶 液，每天约饮用 28.898 ml；从第 7 周开始，腹腔注射 MEL 溶液， 注射时间为每日 16：00—17：00，染毒容量为 1 ml/kg；连续染毒 10 周。MEL 的配制：取 0.5 g 的 MEL，溶于 1～2 ml 无水乙醇中， 再用生理盐水定容到 100 ml，其浓度为 5 mg/ml，以 5 mg/kg 腹 腔注射，用生理盐水定容至 1 ml。 1.3 一般生理发育状况观察
摘要：目的 研究不同浓度饮水氟染毒对大鼠脑氧化应激状态的影响及褪黑素（MEL）的干预作用。方法 将清洁级
初断乳 Wistar 大鼠 34 只随机分为 5 组，分别为对照组（蒸馏水，8 只），60、120 mg/L 氟单独染毒组（各 7 只），60 mg/L 氟+5
mg/kg 褪黑素联合染毒组和 120 mg/L 氟+5 mg/kg 褪黑素联合染毒组（各 6 只）。各组大鼠饮用相应浓度的氟化钠溶液；从
取脑组织 0.05 g，加入去离子水超声 1 h，分别加入脂肪酶 和蛋白 K 酶消化，随即加入 0.8 ml 去离子水和 2.4 ml 的 2%硫 酸银-硫酸溶液，并迅速盖上已用饱和 NaOH 溶液涂成碱膜的干 燥盖子，置于 55 ℃恒温箱中扩散 24 h，取下盖子，加入显色剂
150 μl，用酶标仪于 630 nm 波长处测定脑组织中的氟含量。 1.6 氧化损伤指标测定
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环境与健康杂志 2010 年 10 月第 27 卷第 10 期 J Environ Health, October 2010, Vol．27, No．10
文章编号：1001-5914（2010）10-0880-03
【论著】
褪黑素对饮水氟染毒大鼠脑组织氧化应激的影响
王菲 1，潘峙宇 2，张志瑜 1，吴慧华 1，黄金波 1，席淑华 1
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂
KHB st-360 型酶标仪 （上海科华安验系统有限公司），KA1000 型低速台式离心机 （上海安亭科学仪器厂），恒温水浴箱 （奥特仪表有限公司），隔水式电热恒温培养箱（上海市跃进医疗 器 械 厂）， 超 声 波 清 洗 器 （北 京 医 疗 设 备 二 厂），Heidolph DIAX900 型组织匀浆器（德国 Heidolph 公司），T6 紫外可见分光 光度计（北京普析通用仪器有限公司）。谷胱甘肽（GSH）测定试 剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试 剂盒、蛋白含量检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限
氟化钠溶液的配制：将氟化钠溶解至蒸馏水中，配制成 60、 120 mg/L 的氟化钠溶液。 1.2 实验动物与分组
选 择 清 洁 级 初 断 乳 Wistar 大 鼠 34 只 ， 体 重 （59.375 ± 10.704）g，雌雄各半，由中国医科大学实验动物中心提供，动物 许可证号：SCXK-LN 2003-2009。饲养于清洁级动物实验室中， 温度为 18～23 ℃，相对湿度为 45%～55%，实验动物可自由饮水、 摄食。
间比较，差异无统计学意义。与对照组比较，60 mg/L 氟单独染毒组大鼠脑组织中褪黑素浓度略有升高，120 mg/L 氟单独染
毒组大鼠脑组织中褪黑素浓度有下降趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 氟能透过血脑屏障在脑中蓄积，产生
一定程度的氧化损伤，小剂量的褪黑素干预未能见到明显的抗氧化作用。
每天观察大鼠的行为、精神状态、氟斑牙形成情况，记录每 天的饮水量，每周一、四称量体重，记录体重变化情况。
染毒结束后，隔夜禁食，于转天早上 8：00—9：00，乙醚麻醉 并处死大鼠，在冰排上迅速分离全脑组织，放入预冷的 5 ml EP 管中，-20 ℃低温保存，备用。 1.4 脑组织匀浆的制备
取脑组织 0.2 g 放入试管中，加入 1.8 ml 生理盐水。用 匀浆机 将 组 织 匀 浆 ， 然 后 3 000 r /min 离 心 （离 心 半 径 为 12 . 5 cm）15 min。取上清液进行下一步测定。制备过程在冰 上进行。 1.5 脑组织中氟含量的测定
计学意义（P<0.01）。氟单独染毒各组之间比较，GSH、SOD、MDA 含量差异无统计学意义。与相同浓度氟单纯染毒组比较，
60 mg/L 氟+5 mg/kg MEL 联合染毒组大鼠脑组织中 GSH 含量和 SOD 活力均较高，但差异无统计学意义；120 mg/L 氟+5
mg/kg MEL 联合染毒组大鼠脑组织中 GSH 含量较高，SOD 活力较低，差异均无统计学意义。各组大鼠脑组织中 MDA 含量
第 7 周开始腹腔注射褪黑素溶液，连续染毒 10 周。染毒结束后，取脑组织测定氟含量和谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶
（SOD）、丙二醛（MDA）水平以及单纯氟染毒组大鼠血清褪黑素水平。结果 与对照组比较，120 mg/L 氟单独染毒组以及
60 mg/L 氟+5 mg/kg 褪黑素联合染毒组和 120 mg/L 氟+5 mg/kg 褪黑素联合染毒组大鼠脑组织中氟含量均较高，差异有统
Abstract：Objective To study the effects of fluoride on oxidative stress in the brain of rats，and the intervention of melatonin. Methods Thirty-four weanling Wistar rats were randomly divided into five groups：contro（l distilled water, 8 rats），NaF (60 mg/L, 7 rats)，NaF (120 mg/L, 7 rats)，NaF+ melatonin (60 mg/L and 5 mg/kg, 6 rats)，NaF+ melatonin (120 mg/L and 5 mg/kg, 6 rats). NaF was given through drinking water for 10 consecutive weeks and melatonin (1 ml/kg) by intraperitoneal injection, from 7th week to 10th week. After 10 weeks of treatment, the brain tissue was collected and fluoride content, the content of GSH ，the activity of SOD, the content of MDA in the tissue and the level of melatonin of single NaF-treated groups were measured. Results The content of fluoride in brain in 120 mg/L NaF group，60 mg/L NaF+ 5 mg/kg melatonin group and 120 mg/L NaF+ 5 mg/kg melatonin group increased significantly compared with the control (P <0.01). Compared with the corresponding control, in the observed indexes, melatonin did not present significant antagonism to fluoride. Conclusion Fluoride can pass through blood-brain barrier and accumulated in the brain，and cause oxidative damage. The application of melatonin in this study does not show the antagonistic effect to fluoride-induced oxidative damage.