洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶_一种应用前景广阔的生物催化剂
酶法合成淀粉接枝聚己内酯共聚物的核磁分析
酶法合成淀粉接枝聚己内酯共聚物的核磁分析1徐玲，杨成，段彬，蒋超江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡（214122）E-mail：ckxl0571@摘要：在有机溶剂DMSO中，以猪胰脂肪酶为催化剂，合成了淀粉接枝聚己内酯共聚物。
利用红外光谱初步验证接枝情况，再采用1H-NMR、13C-NMR核磁共振光谱表征产物微结构，完成了1H-NMR、13C-NMR谱带的归属，并计算了己内酯的接枝率及主要接枝位置，实验结果己内酯接枝率达30％以上，主要接枝在C2、C3上。
关键词：淀粉，脂肪酶，开环聚合，己内酯，核磁共振1. 引言随着环境污染问题的越来越严重，完全生物可降解材料的研究引起了人们广泛的关注。
淀粉及其衍生物凭借其优良的性能成为研究的热点。
其中，淀粉接枝聚己内酯是近几年研发的新产物[1,2]。
目前报道的合成方法基本是利用钛酸四丁酯、辛酸亚锡等引发剂引发己内酯开环聚合并接枝到淀粉基上的化学合成，但所得产物易引入杂质、色泽偏黄、淀粉葡萄糖单元上三个羟基都有可能接上聚己内酯，位置选择性差。
酶催化作为一种生物催化方法，与传统的化学催化相比具有反应条件温和、位置选择性好、产物结果单一、纯度高、色泽浅等优点[3]，故本文选择以脂肪酶为催化剂，DMSO为溶剂，淀粉、己内酯为底物，尝试性合成淀粉-聚己内酯接枝共聚物。
应用1H-NMR、13C-NMR核磁共振光谱对合成产物进行微结构表征，分析谱带归属，计算己内酯的接枝率及主要接枝位置。
2. 实验2.1 原料ε-己内酯单体：Fluka Chemie GmbH CH-9471 Buchs(瑞士)，纯度≥99％；玉米淀粉：百灵威公司；猪胰脂肪酶：Sigma–Aldrich公司；二甲亚砜、甲醇、丙酮等，AR，国药集团化学试剂有限公司。
2.2 方法2.2.1 淀粉脱脂处理：乙醚为抽提液，用脂肪抽出器抽提12h，真空干燥后备用。
2.2.2 pH记忆酶的制备[ 4]：取适量酶浸泡在浓度为0.2mol/L不同pH值的磷酸缓冲溶液中，搅匀，冻干后备用。
微生物发酵生产脂肪酶的研究进展
微生物发酵生产脂肪酶的研究进展脂肪酶是一类在生物催化领域具有重要作用的酶类，可以催化脂肪的水解，将脂肪分解为脂肪酸和甘油。
因其在食品加工、医药、生物燃料等领域的广泛应用前景，脂肪酶的研究备受关注。
与传统的化学法相比，利用微生物发酵生产脂肪酶具有成本低、环境友好等优势，因此备受研究者的青睐。
本文将对近年来微生物发酵生产脂肪酶的研究进展进行综述，以期为相关研究提供参考。
一、脂肪酶的微生物来源微生物是脂肪酶的重要生产来源，包括细菌、真菌、酵母和其他微生物。
在近年的研究中，发现了大量的具有脂肪酶生产潜能的微生物。
革兰氏阳性细菌是脂肪酶的主要来源，如枯草芽孢杆菌、葡萄球菌等。
一些真菌和酵母菌也被广泛应用于生产脂肪酶，如毛霉属、曲霉属等。
这些微生物不仅能够在自然界中产生脂肪酶，而且在实验室条件下也可以进行有效的培养和发酵，因此被广泛应用于脂肪酶的生产中。
二、脂肪酶的发酵生产工艺微生物发酵是脂肪酶生产的主要工艺，通过在适宜的温度、pH和营养条件下培养脂肪酶生产微生物，可以获得高效的脂肪酶产量。
近年来，研究者们在提高发酵工艺的稳定性和产量上做出了许多努力。
通过优化培养基配方和发酵条件，可以显著提高脂肪酶的产量。
在控制发酵过程中的温度、pH和氧气供应等因素时，可以更好地保证脂肪酶的生产和稳定性。
还可以利用遗传工程技术改良脂肪酶的生产菌株，使脂肪酶的生产达到最佳化。
三、脂肪酶的鉴定和纯化鉴定和纯化是脂肪酶生产的重要步骤，通过这一步骤可以获得纯度较高的脂肪酶，为后续的应用和研究提供了可靠的基础。
在近年的研究中，研究者们发展了一系列高效的脂肪酶鉴定和纯化技术，如蛋白质亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
这些技术可以有效地降低脂肪酶的生产成本，提高脂肪酶的纯度和活性。
还可以利用基因工程技术改良脂肪酶结构，提高其稳定性和特异性，使脂肪酶更好地适应不同的应用环境。
四、脂肪酶的应用领域脂肪酶具有广泛的应用前景，在食品加工、医药、生物燃料等领域都有重要作用。
脂肪酶的概述及应用
脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。
脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。
包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。
脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。
植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。
脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。
脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。
迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。
总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。
脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。
溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。
这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。
酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。
固定化酶
1.2 脂肪酶的研究与应用1.2.1 脂肪酶的研究概况脂肪酶可以根据其来源分类，分为微生物脂肪酶、动物脂肪酶和植物脂肪酶。
脂肪酶可以很容易地从微生物真菌（如南极洲假丝酵母）或细菌（如荧光假单胞菌）中通过发酵过程高产量地生产出来，其过程缺乏基本的净化步骤。
一些脂肪酶表现出对底物的位置专一性，而另一些则不然。
对不同来源的游离脂肪酶类型的比较研究表明，荧光P.脂肪酶具有最高的酶活性。
通常，来自真菌来源的脂肪酶比来自细菌来源的脂肪酶表现出更好的甘油三酯酯交换活性。
作为一种多功能生物催化剂，脂肪酶具有其他酶蛋白无法比拟的优点[15]：1、在有机溶剂中具有良好的稳定性；2、催化过程不需要辅助因子，一般不发生副反应；3、可以催化水解，酯化，酯交换等众多反应[16]；4、具有独特的化学选择性、区域选择性及立体选择性；5、底物谱广，可催化非天然底物进行反应。
与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶生产周期短，分离纯化相对简单，并可利用基因工程和蛋白质工程等技术实现酶的改造并构建生产工程菌[17]，适合工业化生产与应用。
1994年，丹麦Novozymes公司首次应用基因工程菌生产来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lipolase，此后许多来源于微生物的脂肪酶也实现了商业化生产[18]。
脂肪酶的应用领域日益扩大，被广泛运用于生物柴油、食品加工、面粉改良、造纸造酒、有机合成等化工领域[19]。
1.2.2 脂肪酶的结构及催化机制脂肪酶是一类重要的水解酶，催化三酰甘油酯中酯键的裂解，具有广泛的生物技术应用价值。
脂肪酶是在人体内正确分配和利用油脂所必需的酶。
脂蛋白脂肪酶(LPL)在毛细血管中很活跃，它通过水解包装脂蛋白中的甘油三酯，在防止血脂异常方面起着至关重要的作用。
30年前，有人提出了一种不活泼的LPL低聚物的存在。
M., Tushar Ranjan (2020)指出天然油中高浓度的omega - 3脂肪酸(ɷ-3 FAs)对于维持身体健康非常重要。
洋葱伯克氏菌Burkholderia contaminans抗菌蛋白分离纯化及生物学特性分析
洋葱伯克氏菌Burkholderia contaminans 抗菌蛋白分离纯化及生物学特性分析张婧婷1，施俊凤2,*，范三红1,*（1.山西大学生命科学学院，山西 太原030006；2.山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所，山西 太原 030031）摘 要：洋葱伯克氏菌（Burkholderia contaminans ）从杏果实表面分离，实验证明其对果蔬采后多种病原真菌具有较强的抑制作用。
为了进一步揭示其抑菌机理，通过菌体裂解、硫酸铵分级盐析、纤维素DE-52阴离子交换柱层析及Sephadex G-100凝胶过滤柱层析，得到一种具有抗菌活性的蛋白。
经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ，SDS-PAGE ）检测结果表明，该蛋白呈单一条带，其分子质量约为17.6 kDa 。
粗提蛋白溶液具有一定热稳定性，在不同pH 值条件下稳定，对有机试剂、紫外照射、蛋白酶不敏感。
50 mg /mL 的Tween-80处理粗提液，活性比对照增加了12.5%，对还原剂SDS 和二硫苏糖醇敏感。
关键词：洋葱伯克氏菌（Burkholderia contaminans ）；抗菌蛋白；分离纯化；理化性质Isolation, Purification and Characterization of an Antifungal Protein from Burkholderia contaminansZHANG Jingting 1, SHI Junfeng 2,*, FAN Sanhong 1,*(1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Institute of Agricultural Product Storage and Fresh Keeping, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China)Abstract: Burkholderia contaminans B-1, isolated from the surface of apricots, is an antagonistic bacterium against Botrytis cinerea and other important postharvest pathogenic fungi in fruits and vegetables. In order to investigate the mechanism of action of B-1, we extracted a protein with antimicrobial activity after lysis of the cells. The protein was purified by bioassay-guided fractionation using fractional ammonium sulfate precipitation, DEAE-cellulose DE -52 ion-exchange and Sephadex G-100 gel filtration column chromatography. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis suggested that the purified protein was homogeneous and its apparent molecular mass was 17.6 kDa. The protein was stable to heating and pH variations and was insensitive to organic reagents, protease and UV irradiation. Its inhibitory activity was increased by 12.5% in the presence 50 mg /mL Tween-80 as compare to that of the control (CK). The protein was sensitive to SDS and dithiothreitol (DTT).Keywords: Burkholderia contaminans ; antifungal protein; isolation and purification; characteristics DOI:10.7506/spkx1002-6630-201814027中图分类号：Q93 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2018）14-0179-06引文格式：张婧婷, 施俊凤, 范三红. 洋葱伯克氏菌Burkholderia contaminans 抗菌蛋白分离纯化及生物学特性分析[J]. 食品科学, 2018, 39(14): 179-184. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201814027. ZHANG Jingting, SHI Junfeng, FAN Sanhong. Isolation, purification and characterization of an antifungal protein from Burkholderia contaminans [J]. Food Science, 2018, 39(14): 179-184. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201814027. 收稿日期：2017-07-04基金项目：山西省重点研发项目（201703D221010-1）；山西省农业科学院博士后基金项目（BSH-2015JJ-003）；山西省农业科学院特色农业项目（YGG17001）第一作者简介：张婧婷（1992—），女，硕士研究生，研究方向为果蔬贮藏保鲜技术。
葡萄糖在稀硫酸催化下的降解反应动力学
葡萄糖在稀硫酸催化下的降解反应动力学1彭新文，吕秀阳浙江大学化工系，杭州（310027）E-mail：luxiuyang@摘要：葡萄糖是纤维素的组成单体。
葡萄糖在酸催化下的降解是从生物质资源出发制备乙酰丙酸过程中重要步骤。
从生物质资源出发制备乙酰丙酸通常是采用1.5%以上的硫酸作为催化剂，既造成严重设备腐蚀，又给环境保护带来很大压力。
为了探索在稀硫酸浓度下水解生物质制备乙酰丙酸工艺的可行性，本文系统地测定了压力5MPa，初始浓度5～20 mg·mL-1、温度160～190℃、硫酸浓度0.05%～0.4wt%范围内葡萄糖的降解反应动力学数据，并以带有平行反应的一阶连串反应动力学模型对数据进行了拟合。
拟合结果表明在实验范围内，葡萄糖降解的主、副反应对葡萄糖均为一级反应；葡萄糖降解的主反应对H+为0.716级，反应的活化能129 kJ·mol-1；副反应对H+为1.06级，反应的活化能为154 kJ·mol-1。
通过对动力学方程进行分析，发现在硫酸浓度到达一定量后（0.3wt%左右），若再增加硫酸浓度，对乙酰丙酸收率影响较少。
因此在综合考虑收率、硫酸用量以及污染等因素的前提下，稀浓度硫酸(0.3%左右)催化降解生物质制备乙酰丙酸工艺是有发展前景的。
关键词：葡萄糖；乙酰丙酸；稀硫酸；降解；动力学中图分类号：TQ 032；O 643.121．引言纤维素含量约占50%的生物质资源，是一种有广阔应用前景的可再生资源，它是由许多D-吡喃葡萄糖彼此以β-1-4糖苷键连接起来的线性高分子化合物，葡萄糖是其组成单体。
乙酰丙酸（levulinic acid，LA）是一种能从纤维素出发，低成本、大规模制备的新平台化合物[1-2]。
从纤维素出发制备LA一般采用1.5～30wt%硫酸做催化剂[3-5]。
但是以高浓度硫酸作催化剂，对反应设备有很大的腐蚀性，且反应后会产生大量的酸性废渣和废液，给环境保护带来严重的问题。
食品制造中主要微生物酶制剂及其应用
食品制造中主要微生物酶制剂及其应用酶是一种生物催化剂，具有催化效率高、反应条件温和及专一性强等优点，广泛存在于动植物组织细胞、微生物细胞及其培养物中，可以通过各种理化方法将其提取、精制后制成较纯的酶制剂。
近年来，酶制剂已广泛应用于食品发酵、日用化工、纺织、制革、造纸、医药、农业等各个方面，日益受到人们的重视。
早期酶制剂的生产多数是从动、植物组织中提取的。
但动、植物组织生长缓慢，来源有限，并受到季节、气候和地域条件的限制，而微生物生产酶制剂则可避免上述缺陷，具有许多的优越性：首先是微生物种类繁多，酶种丰富，一般认为微生物细胞至少能产生2500种以上不同的酶；其次，微生物生长速度快、酶产量高，且不受气候、季节、地域等条件的限制，便于进行工业化生产。
一、主要酶制剂、用途及产酶微生物（一）淀粉酶按照水解淀粉方式不同可将淀粉酶分为：α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和普鲁兰酶（葡萄糖异构酶）。
1．α-淀粉酶也称液化淀粉酶。
它作用于淀粉时，可随机地从淀粉分子内部切开α-1，4-糖苷键，产物为糊精和还原糖，但不能分解α-1，6-糖苷键。
工业上大规模生产α-淀粉酶的主要微生物是细菌和霉菌，特别是枯草杆菌。
目前，具有实用价值的α-淀粉酶生产菌有淀粉液化芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、马铃薯芽孢杆菌、嗜热糖化芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌等。
2．β-淀粉酶β-淀粉酶最初是从麦芽、大麦、甘薯和大豆等高等中提取的，近些年来发现不少的微生物也能产β-淀粉酶，而且在耐热比等方面优于植物β-淀粉酶，更适合于工业化应用。
β-淀粉酶是外切酶，只能水解α-1，4-糖苷键，不能水解α-1，6-糖苷键。
而且只能从非还原端开始，依次切下一个个麦芽糖，生成的麦芽糖在光学上属于β型。
目前，研究最多的是多黏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌和链霉菌等。
3．糖化酶糖化酶也称葡萄糖苷酶。
其作用方式与β-淀粉酶相似，也由淀粉非还原端开始，逐次分解淀粉为葡萄糖，它也能水解α-1，6-糖苷键，所以水解产物除葡萄糖外，还有异麦芽糖，这点与β-淀粉酶不同。
脂肪酶
真菌脂肪酶
真菌脂肪酶具有温度和pH 稳定性、底物特异性以及在有机
溶剂中具有高活性，且提取成本比较低等优点，因而发展迅
速。 商业化的真菌脂肪酶主要有: 黑曲霉, 米曲霉等。
三、脂肪酶的催化机理
• 脂肪酶的活性中心是丝氨酸（Ser）残基， Ser与天冬氨
酸（Asp）、组氨酸（His）组成的三元组催化中心，正常 情况下，该中心埋在一个或数个 –螺旋结构的“盖子”下 面，受 –螺旋的保护。“盖子”的疏水集团与这个三元组 的疏水区域相结合。这个带有色氨酸（Trp）的盖子具有 两亲性， Trp疏水表面与催化中心的疏水区域相结合，暴 露出的另一端则面向外，与水分子以氢键连接，此时脂肪 酶处于非活性构象。当脂肪酶与界面相接触时，覆盖活性 位点的螺旋结构打开，暴露疏水残基增加与脂类底物的亲 和力，暴露活性位点，同时该变化导致脂肪酶在Ser周围 产生一个亲电区域，可保护催化过程中过度中间产物稳定， 脂肪酶处于活性中心。
五 蜡脂的生产过程
• 利用固定化脂肪酶酶膜，使用价格低廉的大豆油为原料，
在无溶剂体系中催化大豆油和十六醇转酯化反应合成不饱 和的蜡脂。
六 影响蜡脂产率的因素
• 1固定化酶用量对产率的影响
随固定化酶用量增加，反应产率也逐渐 增加到一个极致保持稳定。
• 2底物摩尔比对产率的影响
蜡脂的产率随醇油摩尔比的增加而增加 达到一个最高值，当十六醇继续增加时蜡 脂的产率开始下降。分析主要是十六醇在 反应中的底物抑制作用导致的。
七未来趋势
• 以大豆油和十六醇为底物，固定化酶在无
溶剂体系中催化转酯化反应合成蜡脂。脂 肪酶作为催化剂节能环保使用的固定化酶 为实验室自制，生产成本低，可以考虑利 用此方法实现液态蜡脂的工业化生产。
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第7卷第5期2009年9月生 物 加 工 过 程Ch i nese Journa l o f B ioprocess Eng i neer i ng V o.l 7N o .5Sep .2009do:i 10.3969/.j issn .1762-3678.2009.05.001收稿日期:2008-12-22基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2006AA020203,2007AA05Z417,2007AA100703);教育部新世纪优秀人才基金资助项目(NCET 07 0336);武汉市攻关项目(200720422138)作者简介:汪小锋(1983 ),男,湖北安陆人,博士,研究方向:微生物学;闫云君(联系人),教授,博士生导师,E m ai:l yanyun j un@to m.co m洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶:一种应用前景广阔的生物催化剂汪小锋,贾 彬,刘 涛,杨江科,闫云君(华中科技大学 生命与科学技术学院 分子生物物理教育部重点实验室,武汉430074)摘 要:洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶对有机溶剂(醇)、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等具有良好的抗性,在有机合成、对映体拆分、非水相催化等领域应用十分广泛。
综述了洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的发酵生产、分离纯化、基因克隆与表达、固定化与生物印迹、蛋白质结构解析及应用研究等,并展望了其未来发展方向,以期为该工业酶的研发与广泛应用提供参考。
关键词:洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶;分离纯化;固定化;蛋白质结构中图分类号:Q 814 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2009)05-0001-07Burkholderia cepaci a li pase:a potenti al versatil e bi ocatal yst forfuture bioche m ical i ndustryWANG X iao feng ,JIA B in ,L IU Tao ,YANG Jiang ke ,YAN Y un jun(K ey L aboratory ofM o lecu l ar B iophy si cs of t he M i n i stry of Educati on ,Co ll ege of L ife Sc i ence and T echno logy ,H uazhong U niversity of Sc i ence &T echno l ogy ,W uhan 430074,Ch i na)Abst ract :Burkholderi a cepaci a lipase (BCL )was found to have better resi s tance to hea,t organ i c so l vents ,ox idants ,surfactants ,detergents ,and pr o tease .It is w idely applied i n organic synthesis ,resolutionof race m ic m i x tures ,and non aqueous enzy m atic catalysi s .The fer m entative production ,i m m obilizati o n ,m o lecu lar i m printi n g ,gene clon i n g and overexpression ,purifica ti o n and applicati o n o f BCL w ere summ a rized .K ey w ords :Burkholderi a cepacia li p ase (BCL);purification ;i m m ob ilization;pr o te i n struct u re 洋葱伯克霍尔德菌(Burkhol d eria cepacia ,BC )为G -杆菌,由美国微生物学家W illia m Burkho lder 自腐坏洋葱中分离出来,是一组基因型不同、表型相近的细菌群,根据基因特征和表型特征至少可以将B.cepacia 分为10个基因型[1],称为洋葱伯克霍尔德菌复合型(B.ce pacia co m p lex ,简称BCC )。
洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶(B cepacia lipase ,BCL)对多种有机溶剂(醇)、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等有较好抗性,是目前在有机合成、洗涤剂添加剂和非水相催化中应用最为广泛的脂肪酶之一[2]。
脂肪酶(EC 3 1 1 3)是一类特殊的酯键水解酶,能在油水界面上催化脂类物质分解、合成和酯交换等反应。
作为重要的工业用酶,脂肪酶在食品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等传统工业领域应用十分广泛[3],在生物能源(生物柴油)、有机合成、药物手性拆分和工具酶等新型应用领域前景也十分广阔[4]。
国外学者对BCL研究,主要集中在分子克隆、有机溶剂中的性质研究、酯合成、立体选择性、对应体拆分以及结构与功能的研究等,关于发酵工艺的报道较少。
应用较多的是日本天野酶制品株式会社(Am ano Enzy m e I nc )商品化的PS脂肪酶。
国内则只有本实验室对该脂肪酶进行了系统的研究与开发,目前,在基因克隆、高效表达、分离纯化、酶固定化、生物柴油制备应用等方面均取得了一系列成果。
本文就BCL的发酵生产、分离纯化、基因克隆与表达、固定化、蛋白质结构及应用研究作全面综述。
1 发酵生产国内外有关BCL发酵的报道较少,不同菌株的发酵条件存在较大差异。
1988年,Lonon等[5]从胆囊纤维化肺炎病人体内分离出10株产脂肪酶的洋葱伯克霍尔德菌,发现活力最高菌株产生的BCL纯化后,其相对分子质量大约为2 5104,最佳p H为9 0,最佳反应底物为Tw een40。
一般洋葱伯克霍尔德菌最适生长温度为30~35!,而Rath i等[6-7]报道了1株产BCL的耐热菌B ce pacia RGP 10最适生长温度范围为45~50!。
采用响应面法优化发酵产酶条件,发现诱导时间、接种量和C源质量浓度是最重要的影响因素,减少C源的供应可以缩短脂肪酶生产的时间,蓖麻油为最佳诱导物,培养基中Ca2+和M g2+浓度分别为0 4mmo l/L和0 6 mmo l/L时脂肪酶产量最高。
将摇瓶中优化的产脂肪酶培养基在14L发酵罐中培养15h后比酶活达到160U/mg。
尹利等[8]也采用了响应面法对洋葱伯克霍尔德菌产脂肪酶发酵条件进行了优化,发现橄榄油、豆饼粉水解液以及初始p H是最显著的影响因素。
汪小锋等[9]发现尿素、接种量以及初始pH 对B cepacia产脂肪酶影响显著,响应面法优化后的试验条件能够在10L发酵罐上成功实现放大。
Fer nandes等[10]报道了以玉米糠为基质,质量分数5%的玉米油为诱导剂固态发酵生产BCL,72h后的平均比酶活为108U/g,冻干的脂肪酶能直接应用到酯化和转酯化反应中。
2 分离纯化脂肪酶的酶制剂产品分为粗酶制剂和纯酶制剂,大多数工业应用不需要制备纯酶,然而纯化的程度会影响酶的利用率,医药和化妆品中使用的脂肪酶对其纯度要求较高,必须对粗酶制剂进行分离纯化才能满足应用要求。
Sug i h ara等[11]采用Acri n o l杀菌处理发酵上清液后,通过M acro Prep m ethy lH I C疏水层析和Sephacry l S 100HR凝胶过滤两步纯化使BCL纯化了1120倍,收率为54%。
纯化后的BCL相对分子质量3 65104Da,PI为5 1,最适底物为中短碳链的甘油三脂肪酸酯(C链长∀12),能裂解三油酸甘油酯所有的酯健,偏爱1,3位酯健;而Bor nscheuer等[12]将商品化的PS脂肪酶用苯基 琼脂糖CL 4B柱层析纯化后发现纯酶的相对分子质量3 41104,PI为4 3,偏爱中长碳链(C链长#8)和不饱和的甘油三脂肪酸酯。
在体积分数70%的异丙醇体系中纯化BCL可以有效防止脂肪酶分子的团聚[13],通过错流过滤、两步异丙醇处理、液液萃取和疏水层析,脂肪酶被纯化400倍,收率为30%。
工业上,多采用双水相系统进行脂肪酶的初步纯化。
Terstappen等[14]利用基于表面活性剂(六乙二醇单十四醚)的双水相系统纯化了BCL,发现BCL显示偏好富集于表面活性剂相,单步纯化使脂肪酶浓缩了4倍,纯化了24倍。
黄瑛等[15]采用PEG 2000(质量分数10%)/磷酸盐(质量分数15%)双水相系统纯化了洋葱伯克霍尔德菌G 63生产的脂肪酶,脂肪酶纯化了3 98倍,最高回收率达到87 25%。
3 脂肪酶基因克隆与表达NCBI核酸数据库中可以检索到9条BCL基因序列,它们之间的同源性较高,序列相似性在87%~ 100%之间。
洋葱伯克霍尔德菌复合型产生的脂肪酶几乎都具有耐有机溶剂和耐热性能以及在水相和非水相中具有较高的催化活力和独特的催化性质;但不同基因型的洋葱伯克霍尔德菌分泌的脂肪酶的酶学性质方面也存在一定的差异,主要表现在相对分子质量、等电点、底物特异性等方面[11-12]。
常规使用的细菌学鉴定方法很难将BCC以及与之相似的细菌区分开,基于rec A基因限制性片段长度多态性分析和特异基因序列分析以及全基因组水平的分型等技术已经可以将洋葱伯克霍尔德菌复合菌群区分开,这将对BCC中基因型不同菌株产生脂肪酶的研究具有重要意义。
目前,有关BCL转录调控机制还没有完全被阐释清楚。
BCL的转录受群体感应调控体系的影响。
B cepacia中至少存在2种不同的信号分子对脂肪2生 物 加 工 过 程 第7卷酶的转录调控起重要的作用[16]。
脂肪酶基因的转录调节蛋白基因(LuxR)的失活也将极大降低了脂肪酶的产量[17]。
洋葱伯克霍尔德菌分泌脂肪酶的途径为GSP途径(General Secreti o n Pathw ay)。
GSP 途径分泌的脂肪酶具有N端信号肽,可被Sec 复合体识别,穿过内膜到达周质。
在周质中,BCL在特异的分子伴侣蛋白帮助下形成正确的折叠构像,并在Dsb蛋白酶的作用下形成一个分子内二硫键,从而形成有活性的脂肪酶。
随后脂肪酶通过由12个Xcp蛋白组成的孔状结构穿过外膜,分泌到胞外。
许多学者都发现BCL基因(L i p A)的表达需要一个伴侣基因(L i f)来帮助其折叠成有活性的构象[18]。
L i p A编码44个氨基酸的信号肽序列,L i p A 和L i f拥有一个共同的启动子,两者的比例为1∃1时是未成熟的脂肪酶加工和分泌所必须的。