鱼类多倍体育种的研究

鱼类多倍体育种的研究摘要：简述鱼类多倍体育种研究的简史和机制，重点介绍诱导多倍体鱼类的方法和鉴定多倍体鱼类的研究方法、步骤和原理，对多倍体鱼类的生长发育进行总结，综述多倍体鱼类在水产养殖上的应用和发展趋势。

关键词：三倍体诱导鉴定过度繁殖鱼肉品质多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，染色体加倍通过卵子第二极体的保留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现。

从群体，细胞，和分子水平的研究中，越来越多的资料表明，自然发生的多倍体，在群体遗传学和物种形成中有着十分重要的作用，鱼类多倍体育种在水产养殖上的应用和发展前景十分重要。

1·鱼类多倍体产生的机制根据鱼类受精细胞学的研究，鱼类精子入卵的时间是在第二次成熟分裂的中期，受精后放出第二极体。

如果让卵子受精后，因受各种理化因子的刺激而不排出第二极体，亦即它们没有经过减数分裂而形成所谓的二倍体卵核，然后与单倍体精核结合形成三倍体受精卵，而受精卵的第一次有丝分裂受到抑制，则产生四倍体。

2·鱼类多倍体的育种的研究简史关于人工诱导鱼类多倍体的研究，再早可以追溯到20世纪40年代，Makino 和Ojima曾以鲤鱼为材料以了解人工诱导动物多倍体的机制。

他们提出：如果二倍体卵核与单倍体精核结合可能形成三倍体合子并进而产生三倍体个体。

不久，Svardson（1945）用接近0℃的冷水处理受精后10分钟的白鲑以及大西洋鲑与褐鳟杂种卵约26小时而得到了少数三倍体囊胚。

真正诱导鱼类三倍体成功的是Swarup，他不仅以低温诱导三棘刺鱼获得三倍体，而且饲养殖性成熟。

后来，Purdom（1972）报道人工诱导海水经济鱼类鲽与川鲽杂种三倍体获得成功。

到目前为止先后已在三棘刺鱼，鲽，川鲽，大菱鲆，菱鲆，鲤鱼，奥利亚罗非鱼，尼罗罗非鱼，草鱼，鳙鱼，等30多种鱼类诱导多倍体获得成功。

3·诱导多倍体鱼类的方法人工诱导多倍体的方法有三种：生物学方法，物理学方法，化学方法。

3·1 生物学方法生物学方法主要通过杂交方法尤其是种间杂交获得异源多倍体3·1·1远源杂交远源杂交，是指在分类学上物种(species)以上分类单位的个体之间交配。

不同种间、属间甚至亲缘关系更远的物种之间的杂交。

可以把不同种、属的特征、特性结合起来，突破种属界限，扩大遗传变异，从而创造新的变异类型或新物种。

鱼类远缘杂交中，尤其是鲤科不同亚种之间的杂交，往往可以产生多倍体。

Marian等（1978）最早发现草鱼♀×鳙♂之间的杂种是三倍体。

后来，Beck等（1980）对草鱼、鳙及其F1的染色体组型进行了分析研究，结果发现草鱼与鳙具有二倍染色体数（2n=48），而F1全部具有三倍染色体数（3n=72）。

以后，Beck等（1982）又发现，当草鱼♀与鳙♂杂交时，同时出现二倍体杂种与三倍体杂种，但35.1％的二倍体杂种畸形，而三倍体杂种的畸形率仅为5.1％。

吴维新等（1981）在兴国红鲤♀和草鱼♂的远缘杂交组合中获得过异源四倍体杂种鱼。

刘思阳（1987）也证实草鲂杂种（草鱼♀×三角鲂♂）是异源三倍体，其中草鱼提供了两套染色体，三角鲂供了一套染色体。

推测草鲂杂种染色体加倍的原因是受精过程中卵子核内有丝分裂或第二极体的保留。

3·1·2 核移植核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制。

陆仁厚等（1982）用四倍化的草鱼培养细胞（核）作为供体移植到泥鳅的会核卵内，曾获得心跳期的四倍体胚胎。

如能对这种技术作进一步改善，它很可能是诱导鱼类四倍体较为有效的途径之一。

3·1·3 细胞融合是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。

应用这一技术，诱导鱼类囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵或者受精卵与受精卵之间的细胞融合，在理论上应该产生三倍体或四倍体，但由于细胞内染色体发生重排，实际上得到的是含各种不同数量染色体的鱼类细胞群。

例如，金志军等（1988）进行草鱼囊胚细胞与团头鲂受精卵之间的电融合试验，共用卵98个，其中73个发育至原肠胚（79.49％），65个发育至心跳期（66.33％），49个发育至仔鱼期（50％），染色体数目在56～88之间，因此是嵌合体（chimera）。

利用这一技术可以用来研究鱼类外源染色体对发育的影响和探索改良品种的可能性。

3·2物理学方法物理学方法有三种：温度处理，静水压处理，电休克3·2·1 温度处理又叫温度休克，包括热休克（heat shock）和冷休克（cold shock）对每一种鱼类来说，进行温度处理最重要的是必须确定处理的开始时间、持续时间以及温度高低。

有证据表明，温度休克敏感性的差异既与遗传背景有关（Streisinger等，1981），也与卵子成熟度有关（Refstie等，1982），根据我们的经验，为了增加刺激强度，冷水性鱼类如鲑科鱼类，宜用热休克，温度范围为28～36℃，不能超过该种鱼类的致死温度；温水性鱼类如鲤科鱼类，宜用冷休克，温度范围为0℃左右。

3·2·2 静水压处理静水压处理是新近发展起来的一种诱导鱼类多倍体的方法。

最初，Streisinger等（1981）成功地用静水压阻止第二极体排出并用这种处理与乙醚相结合阻止第一次有丝分裂而产生纯合二倍体雌核发育斑马鱼。

后来，桂建芳等（1990、1991）采用静水压处理获得了批量三倍体和少数四倍体水晶彩鲫。

日本山口县外海水产试验场高山繁昭等（1992）应用静水压处理已成功地较大批量地诱导出四倍体牙鲆稚鱼生长正常。

其诱导条件是：水温180C受精后53min以650kg／cm2静水压处理6min和水温170C受精后60min以650kg／cm2静水压处理6min。

虽然应用静水压处理比温度休克复杂，需要专门的设备，如水压机（hydraulic press），但处理的最佳条件易于掌握，处理程序易于标准化，且对胚胎的损伤比温度休克小。

因此，静水压处理是进行鱼类染色体组操作的有效方法。

3·2·3电休克Teskeredjic等（1993）报道用热休克与电休克（electric shock）相结合的方法诱导银大麻哈鱼三倍体获得成功。

他们发现交流电（AC）诱导三倍体比直流电（DC）更有效。

将受精后40min的卵置于260C并给以10min的交流电休克可得到100％的三倍体，而直流电休克和只有热休克而无电流休克处理的对照组分别为70％和15％。

电休克装置是定做的，交流电与直流电的电压皆为10V3·3 化学方法3·3·1细胞松弛素细胞松弛素（cytochalasin）是真菌类半知菌纲某些菌种的代谢产物。

细胞松弛素对于活细胞具有干扰细胞质分裂的特殊效应。

Refstie等（1977、1981）以及Alien等（1979、1981）报道受精卵置于细胞松弛素B后产生了多倍体与二倍体嵌合体虹鳟和大西洋鲑。

根据他们的试验，其浓度以10Pyml（溶解于0.1％二甲亚机水溶液中）为最好，从受精后30～40h0（积温）开始处理直至4细胞期为止。

国内虽有不少有关应用细胞松弛素B诱导软体动物（贝类）多倍体的研究报告，但还没有应用于鱼类的报道。

另外，尽管细胞松弛素B诱导效果较好，但价格昂贵，且新近发现它是一种致癌剂，因此影响它的使用推广。

3·3·2秋水仙素秋水仙素（colchicine）是从百合科秋水仙属水仙（Colchicum autumnale）的器官中提取的一种植物碱，性极毒，1934年开始应用于生物学研究，用它来抑制细胞分裂时纺锤丝的形成。

Smith等（1979）曾报道将第一次卵裂前的受精卵置于0.01％秋水仙素后产生了类似的多倍体与二倍体嵌合体美洲红点鲑。

目前，秋水仙素被广泛用来诱导植物多倍体，但动物细胞经过秋水仙素处理后，往往会失去分裂能力而趋向死亡，所以不常用。

3·3·3 聚乙二醇聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种常用的细胞融合剂。

Ueda 等（1986）用聚乙二醇处理过的虹鳟精子与卵子受精，结果得到高比例（1/3）的三倍体虹鳟胚胎。

染色体组型分析表明，三倍体细胞具有两套父本染色体组而只有一套母本染色体组，从而证实它是由双精受精所致。

造成双精受精的原因，据作者推测，可能是由于两个精子头部融合的结果，也可能是残留的聚乙二醇作用于卵膜，使得精子容许两个精子进入。

上野雄一等（1993）进一步用30％～50％PEG（分子量为4000）融合鱼类精子，结果发现最大融合率为18.5％（虹鳟）和15.9％（长背鲫）。

经PEG处理的精子，其运动时间与未处理的相比较，虹鳟减低至2/3，长背鲫减低至1/2。

3·3·4．6－二甲基氨基嘌呤6－二甲基氨基嘌呤（6－imethylaminopurine，6－DMAP）是一种蛋白激酶抑制剂，是影响磷酸激酶作用的嘌呤毒素类似物。

当6－DMAP与微管蛋白二聚体结合后，对微管的正常结构和功能起到了抗有丝分裂的作用，因此可以产生三倍体。

目前大有替代细胞松弛素B用来诱导贝类多倍体的趋势，但至今还没有应用于鱼类多倍体诱导的报道。

由于温度休克与静水压处理诱导鱼类多倍体效果较好，方法也较简便，成本亦低，因此化学处理不可能是被选中的方法。

不过，如能找出效果更好而且价格低廉的诱导剂，这种方法也是可以采用的。

4·鉴定多倍体鱼类的方法由于处理并不是百分之百成功，而且处理过的群体中也可能是由多倍体、二倍体或嵌合体等混合组成，因此采用一个准确而又简便的方法来确定其染色体的信性就显得格外重要。

根据文献报道，多倍体鱼可以用间接法（如核体积测量、蛋白质电泳、生化分析以及形态学检查等）和直接法（如染色体计数以及DNA含量测定等）加以鉴别，现分别介绍如下。

4·1核体积测量按照一般规律，细胞核大小与染色体数目成正比例增加，而且为了维持恒定的核质比率，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。

因此，组成多倍体的细胞及其细胞核通常要比二倍体大些。

但多倍体的器官或躯体并不一定都比二倍体大，因为随着细胞大小增加而细胞数目相应减少，从而保持器官或躯体大小大致相等。

目前，红细胞的测量被广泛用来鉴定多倍体鱼，其中以核体积之比最为常用。

总的来说，多倍体的红细胞要比二倍体的红细胞大得多。

鱼类红细胞及其核是椭圆形的，其计算公式是：核面积（nuclear area）=a2·b·π／4，核体积（nuclearvolume）＝a2·b／1.91（Becak等，1967）。