T细胞免疫学功能研究进展

T细胞免疫学功能研究进展摘要过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy, ACI)是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方法之一。

随着技术的日趋成熟, 已在多种实体瘤和血液肿瘤的临床治疗中取得较好疗效。

其中, 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)T细胞技术是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。

通过基因改造技术, 效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高, 并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。

目前, CAR的信号域已从第一代的单一信号分子发展为包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信号结构域(第二、三代), 临床应用广泛。

但是, 该技术也存在脱靶效应、插入突变等临床应用风险。

该文将就CAR-T细胞技术在恶性肿瘤免疫治疗中的应用及可能存在的问题作一综述。

关键词嵌合抗原受体；基因改造；过继性免疫细胞治疗；CD4+T 细胞；TH17 细胞；分化；调控机制；微RNA；T细胞；抗感染免疫；抗肿瘤免疫早在1989年, Eshhar研究小组[3-4]就将免疫球蛋白样scFv和FcεRI 受体(γ链)或CD3复合物(δ链)胞内结构域融合形成嵌合受体, 即第一代CARs。

表达CAR的T细胞以抗原依赖、非MHC限制的方式结合肿瘤抗原, 启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。

CARs表达的稳定性依赖于所用的胞内信号域。

尽管最近研究报告显示, 去除CD3δ链的两个ITAMs磷酸化作用, 能减少T细胞转导后的凋亡, 有利于转基因的长期表达[5-6]。

但是, 目前含CD3δ链的CAR-T细胞相对于含FcεRIγ链的CAR-T细胞临床研究更多。

原因可能是因为CD3δ含有三个ITAMs, 而FcεRI γ链只有一个ITAM, 虽然体内表达率较低, 但是能更有效激活T细胞, 对肿瘤根除能力更强。

此外, CAR-T细胞的跨膜区一般由同源或异源的CD3、CD8或CD28等二聚体膜蛋白组成, 通过CAR 二聚化以及与内源性TCR的相互作用产生的信号有助于T细胞的激活。

研究表明, T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。

其中第一信号为特异性信号, 由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动; 第二信号为协同刺激信号, 通过CD28/B7等重要的共刺激分子, 促进IL-2合成, 并使T细胞充分活化及免于凋亡。

对于初始型T细胞(未与抗原接触的T细胞), 如只在信号1而没有信号2条件下无法使T细胞发挥正常作用; 即使T细胞与抗原接触, 如果没有协同刺激信号, 细胞也不能发挥正常功能。

相应的, 仅含有CD3δ序列的嵌合抗原受体, 如没有协同刺激信号2, 也无法激活CAR-T细胞。

因此, 依照T细胞活化的双信号学说, 第二和第三代CARs 在嵌合受体上加上如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子(costimulatory molecule, CM)[13-15], 以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性, 维持T细胞应答, 延长T细胞存活时间等(图2)。

其中, CD28分子在调节淋巴细胞增殖和存活方面有着重要作用, 也对效应细胞和记忆细胞的建立起着关键作用, 其通过募集如PI3K、Grb2和Lck 等分子, 以调节关键转录因子如NFκB的活性并且增加IL-2和Bcl-xL的分泌。

CD134能使初始T细胞获得持久的体外增殖和较强的IL-2分泌能力。

CD137则为维持T细胞应答提供信号, 在T细胞生存和CD8+ T细胞记忆中起关键作用。

Till等[23]以逆转录病毒为载体构建第三代CAR-T细胞（CD20-CD28-CD137-CD3δ), 治疗3例非霍奇金淋巴瘤。

经PCR检测, 效应细胞在体内存活的时间超过12个月。

临床反应持续完全缓解2例, 部分缓解1例。

其中1例28岁利妥昔单抗难治性滤泡性淋巴瘤患者, CAR-T细胞治疗3.5月后, 颈部淋巴结在1~2周内迅速减小3 cm。

而美国国家癌症研究所Morgan等[24]报道一例结肠癌合并肝和肺转移患者接受第三代HER2-CAR-T细胞治疗。

该患者输注后4小时血液就检测出有高水平的IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-6等细胞因子。

因为细胞静脉输注后首先经过肺循环, 输注大量的HER2-CAR+ T细胞后, 识别并攻击表达HER2的正常肺细胞, 释放的过量细胞因子, 引起“细胞因子风暴”, 患者于治疗后5天死亡。

这也是迄今为止公布的最为严重的1例CAR-T细胞相关的不良反应。

由于目前第三代CAR-T细胞临床应用还比较少, 故其安全性和有效性是否就一定优于第二代CAR-T细胞, 以及选择怎样的共刺激分子组合, 还需进一步观察。

TH17 细胞的发现更多的是与自身免疫性疾病的研究相关，人们发现当效应T 细胞出现调节紊乱时易导致自身免疫性疾病及过敏性疾病的产生［3］。

TH1 细胞具有高度促炎症生成的特点并且与很多种自身免疫疾病的产生相关［4］，但是，在IFN-γ基因敲除小鼠中， IFN-γ信号或IFN-γ受体的缺失并不诱导机体对自身免疫性疾病产生抵抗；相反，这些小鼠更易产生自身免疫性疾病［5］。

这些现象表明，机体内有不同于TH1 细胞的其它效应T 细胞亚类，它可以诱导组织炎症和机体自身免疫反应，这类细胞后来被人们定义为产生IL17 的效应T 细胞（TH17 细胞）。

TH17 细胞是一类可以特异性地产生IL-17的细胞，IL-17 家族有6 个成员。

目前，6 个家族成员的配体（IL-17 A～E）和5 个受体（IL-17RA～IL-17RD 和SEF）己经被证实。

TH17 细胞在部分自身免疫疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）、胶原诱导的关节炎（CIA）和抗原特异性疾病发病中起重要作用［6］。

TH17 细胞并不表达TH1 或TH2 型T 细胞所表达的转录因子T-bet或GATA-3，这也说明了它们是不同于TH1 或TH2 型T 细胞的另一类T 细胞亚类。

最近研究发现孤独核受体RORγt 是TH17 T 细胞所特有的主要转录因子［8］，也进一步验证TH17 细胞是T 细胞分化过程中一种特殊的细胞亚群。

由于IL-12 对TH1 细胞有重要作用并促其达IFN-γ，IL-12 可能在TH1 和TH17 相互间调节上起重要作用。

对这种相互作用的典型例子之一是，IL-12 亚单位p40 基因缺陷小鼠或用IL-12 p40 中和抗体处理的小鼠对EAE 和CIA两种疾病的产生出现显著的抑制作用［14］。

IL-23是IL-12 家族的一个新成员［15］，它在TH17 细胞分化中有重要的作用，同时它也带有p40 亚单位，因此，IL-23 和IL-12 的共同特性也体现出p40 亚单位在TH17 分化中的地位。

对于TH1 效应细胞对TH17 分化的影响，Mangan 等研究表明［16］，在初始CD4+T 细胞中加入TGF-β导致TH17 细胞分化的过程可通过加入TH1 和TH2 分化相关的细胞因子抗体（如抗IL-4 和抗IFN-γ），或通过使用IFN-γ缺陷小鼠CD4细胞来实现。

这表明，TH1 或TH2 细胞分化过程都可以对TH17 分化产生一定程度的抑制作用（图2）；另一实验结果表明，初始CD4+T 细胞在IL-23 单独存在时用TCR 刺激并不引起IL-17生成细胞的显著增加，但如果同时加入IFN-γ和IL-4 中和抗体时将导致明显的IL-17阳性CD4+T 细胞的产生，如果额外补充IFN-γ和IL-4 则IL-17 生成细胞减少［17］。

这些结果显示，产生IL-17 的效应T 细胞的生成受到TH1或TH2 T 细胞的调控。

另一个与TH1 T 细胞相关的细胞因子受体也在TH17 分化中起重要作用，研究发现IL-18Rα缺失小鼠可产生对EAE的保护力。

从中可见，抗原递呈细胞上的IL-18R参与了TH17 病理过程，这一现象也与抗原递呈细胞所分泌的IL-23 的量相关［18］。

在研究TH1和TH2 通路对TH17 生成影响的实验中发现IFN-γ和IL-4 的主要下游信号分子STAT1和STAT6 的CD4+T 细胞将显著提高IL-17 的生成能力［19］。

从转录因子水平上分析，TH1 途径的主要转录因子是T-bet，T-bet 在CD4+T 细胞中的表达可通过STAT1 引起IFN-γ和IL-27 表达信号增强来实现。

值得注意的是，T-bet 缺陷小鼠并不易于诱导产生EAE［20］，说明此时机体内并不对CD4+T 细胞新的亚类TH17 T 细胞的研究将更加丰富免疫反应调节过程的研究领域，这对深入研究机体免疫调节、免疫病理和机体防御反应机制具有重要意义。

TH17 T 细胞产生的特异性效应因子IL-17 在自身免疫性疾病和感染性疾病中发挥重要的作用；目前对TH17 细胞的研究主要集中在对自身免疫疾病的生成、调控及最终对其合理的干预治疗方面。

抗原递呈细胞和病原菌诱生物质间的相互作用，并不仅在于启动TH17 T 细胞，还在于对自身免疫疾病的致病过程，因而可以在疾病症状开始后进行疾病干预。

总之，对TH17 T 细胞分化及其调机制的研究有助于加深对自身免疫疾病调控的认识，而这种细胞亚类也有潜在的可能成为炎症疾病治疗的新靶标，并为新型免疫抑制药物的研发提供新的研究思路与方向。

miRNA对于T细胞介导的抗肿瘤免疫也有重要作用。

Huffaker等[43]发现，miR-155和miR-146a通过调节IFN-γ的水平分别在T细胞介导的抗肿瘤免疫中发挥保护性和抑制性作用，并且以miR-155的抗肿瘤作用占主导地位。

Jiang等[4]证实miR-17-92簇对于效应CD4+ T细胞的抗肿瘤应答是必不可少的。

此前，研究发现miR-155、miR-17-92簇在多种肿瘤细胞中表达上调，二者因此被认为可能作为肿瘤标记物和抗肿瘤治疗的靶点。

而上述研究结果显示miR-155、miR-17-92簇对于T细胞介导的抗肿瘤免疫是必需的。

因此，临床治疗中非特异的抗miRNA治疗是不恰当的。

Yang等[44]发现，miR-34a能抑制肝癌肝内转移及门静脉癌栓形成。

乙肝病毒的持续感染导致TGF-β信号通路活性提高，从而抑制miR-34a的表达，其下游靶基因趋化因子C-C模体配体22(C-C motif chemokine 22,CCL22)表达上调，有利于募集Treg细胞，从而使肿瘤细胞发生免疫逃逸。

目前，miRNA对T细胞分化和功能的调节作用方面的研究有一定进展，但多数研究结果都是通过体外实验或小鼠模型获得的，miRNA对人类T细胞亚群的调控还有待进一步探索。