海洋生物技术海洋动物细胞培养定稿
海洋生物技术
绪论一．海洋生物技术定义：运用海洋生物学与工程学的原理和方法，利用海洋生物或生物的代谢过程生产有用物质或定向改良海洋生物遗传特性的综合科学技术。
二．重点发展领域：1.发育与生殖生物学基础2.基因组学与基因转移3.病原生物学与免疫4.生物活性及其产物5.海洋环境生物技术三．最新研究进展：动物细胞培养一、细胞培养：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
二、细胞培养基本过程：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。
将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。
当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。
此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。
再配成一定浓度的细胞悬浮液。
另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。
当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。
当培养超过50代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性，即癌变。
此时的细胞被称为细胞系。
三、原代培养：从供体取得组织细胞后在体外进行首次培养四、传代培养：即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖五、细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞六、细胞系：原代培养的细胞顺利传至40--50代，并保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种传代细胞成为细胞系动物细胞融合技术1.细胞融合：是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。
海洋生物技术：海洋动物细胞培养
4、透析袋或膜式生物反应器
膜式生物反应器
在动物细胞培养过程中，会产生一些代谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产物的产生 会产生抑制作用，因此有些学者设计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有害代谢产物透 析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使 产物保留在膜内或与细胞分离开。
3、中空纤 维式生物 反应器
中空纤维反应器
由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤 维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50100 m，呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为 200 m，两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一 起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个 隔开的腔。
1. 不能重复使用；②不能耐受高压灭菌，需用环氧 乙烷或其细胞悬浮液利于培养
4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成 新个体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成 新的动物个体
Thank You !
细胞计数原理
细胞计数操作步 骤
1、将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片 和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左 侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细 胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备 细胞悬液。
二 动物细 胞大规模 培养：
在人工条件下（设定pH、温度、溶氧 等），在细胞生物反应器 （bioreactor）中高密度大量培养动 物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、 猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细 胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代 细胞，贴壁依赖)等。
海洋生物技术—海洋动物细胞培养定稿
3、半连续式培养(Semi-continuous culture) 半连续式培养是在分批式培养的基础上，将分批培养的培养 液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培养基，从而使反 应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。 4、连续式培养(Continuous culture) 连续式培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行 培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将 反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。与 分批式培养不同，连续式培养可以保持细胞所处环境条件长 时间地稳定，可以使细胞维持在优化的状态下，促进细胞的 生长和产物的形成。由于连续式培养过程可以连续不断地收 获产物，并能提高细胞密度，在生产上已被应用于培养非贴 壁依赖性细胞。
传代培养：把原代培养增殖的细胞定期用
胰蛋白酶把细胞从瓶壁上脱离出来，配制 悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶 中培养，这称为传代培养。
细胞株：原代细胞和50代前的传代细胞叫做
细胞株。
细胞系：50代后，遗传物质发生了改变，
并且有癌变的特点，无限传下去的传代 细胞。
细胞株
细胞系
细胞悬浮液 10代细胞
动物胚胎或 幼龄动物的 器官、组织
胰蛋白酶
制成
剪碎 单个细胞 加培养液
海洋生物技术：微生物的培养技术
以群体为 研究单位
于适宜条 件下培养
容积恒定
定期检测培养基中细 菌群体的生长情况
如何测定？
❖ 微生物群体数量的测定方法
▪ 测数目
▪ 测重量
❖ 例 待测样品1ml,稀释100倍后,取1ml稀释液与1ml含有红
细胞1000个的液体混合均匀,显微镜下随机选若干个视野
计数,得出细菌个数与红细胞个数比为5:1,则待测样品中含
○ 生产上常用这个时期的细菌作为菌种，以缩短生产周期。 ○ 如果适当补充营养物质，就有助于延长稳定期、提高代
谢产物的产量
海洋微生物的分离
主要内容
任务一
海洋微生物的分离
任务二
微生物的培养技术
任务三
海洋微生物培养的新方法
任务二、微生物的 培养技术
一．微生物的营养物质
1. 碳源 2. 氮源 3. 生长因子 4. 水 5. 无机盐
生
固体培养基 半固体培养基 液体培养基
伊红美蓝 培养基
金黄色葡萄球菌
思考讨论
如何利用选择培养基从混合微生 物中分别分离出硝化细菌（硝化 细菌能将有毒的氨转换为无毒性 的硝酸盐，并可抑制病原菌生长， 自养微生物）、圆褐固氮菌、金 黄色葡萄球菌（嗜盐）、酵母菌？
选择培养 基
加入青霉素的培养基
○ 分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基
○ 分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基
○ 分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基
○ 分离自养型微生物
（二）、微生物的代谢
微生物的代谢与其他生物相比,有什么不同？为什么？
思考：
微生物的代谢异常旺盛
微生物的表面积与体积的比，约为 同等重量成年人的三十万倍。
海水单细胞藻类培养技术
海水单细胞藻类培养技术海水单细胞藻类是海洋及沿海水域中使用最广泛、生长最迅速的生物群落，在全球海洋生态系统中占据重要地位，而建立海水单细胞藻类稳定培养，对于进一步开发及利用这种有价值的海洋资源，如基因组学研究、海洋药物研究、生物制剂研究等具有重要意义。
本文将针对海水单细胞藻类的培养技术进行详细的论述，首先将介绍海水单细胞藻类的分类、生物学特性及研究价值；其次，将介绍培养海水单细胞藻类的基本要求、常用培养介质构制、饲料内容及添加方法；再次，重点介绍培养海水单细胞藻类的异种合子和活体突变的技术；最后将介绍培养海水单细胞藻类的应用与展望。
一、海水单细胞藻类的分类海水单细胞藻类是一类代表性的单细胞生物，是目前已知的最小的海洋生物，具有单细胞的细胞结构。
按体形大致可分为球形、棒状、螺旋形等三大类。
按其培养条件可分为嗜暖型、嗜凉型及复杂性类型。
按其功能基因及表达产物特征，可以分为高尔基体藻类、响应性藻类、共生性藻类及其他特殊功能藻类。
二、海水单细胞藻类的生物学特性及研究价值1.物学特性海水单细胞藻类是历史最悠久的海洋单细胞生物，具有独特的生物学特性，最大的特点是它的体形是细长的棒状细胞，其长度可达100微米，是一类可以活在非常低温极端环境的海洋微生物。
2.究价值由于它的生物学特性，海水单细胞藻类可以作为非常重要的生物模型，具有重要的研究价值，可供研究细胞凋亡、抗病毒、抗污染、互作关系等方面。
此外，海水单细胞藻类还可以作为潜在的医药材料，可以分离和制备有特殊活性的化合物，具有重要的药物开发前景。
三、培养海水单细胞藻类的基本要求1.择藻类首先要确定要培养的藻类，根据海水单细胞藻类的分类，可以选择不同的培养介质构制，以满足不同藻类的培养需要。
2.择培养介质构制在选择培养介质构制时，要根据藻类的嗜温性、抗药物性以及温度要求等不同因素，构建适当的培养介质，以确保藻类的生长及其工作成果。
3.择正确的饲料在培养海水单细胞藻类的过程中，饲料供给是非常重要的，必须选择适当的饲料添加，才能满足藻类的生长需求，使藻类获得良好的生长。
《海洋生物技术》课程教学大纲
《海洋生物技术》课程简介课程内容：《海洋生物技术》是生物技术的一个分支科学，是新兴的高技术学科之一，是传统海洋生物学发展的一门新兴研究领域。
目前，世界各国正在进行的海洋生物技术研究的内容，主要是以海洋生物为对象，综合应用基因工程、细胞操作技术和细胞培养等技术手段，进行海洋生物遗传性改造，或生产对人们有用的海洋生物产品。
随着神经生物学、海洋生态学、海洋工程学、电子学，以及遥感技术和深海探测技术不断向海洋生物技术领域渗透，并与之相结合，海洋生物技术的研究范围将逐步拓宽。
通过本课程的学习，要求学生了解海洋生物技术在现代生物科学中的重要作用，系统掌握海洋生物技术的原理、方法以及各种海洋生物技术的应用，掌握细胞培养的方法、过程，性别控制的原理，全雌鱼的培育方法，三倍体动物的特点，分子标记辅助育种方法及理论，了解海洋生物技术的应用前景及发展方向。
Brief IntroductionCourse Description:Marine biotechnology is an emerging field encompassing marine biomedicine, materials technology, bioremediation, marine biomedical model organisms, molecular genetics, genomics, bioinformatics and much more. The fundamental enthusiasm for this discipline is clearly derived from the enormous biodiversity and genetic uniqueness of life in the sea. Thirty-four of the 36 fundamental Phyla of eukaryotes are found in the world's oceans. Many of these life forms, such as those that reside in the deep oceans, are poorly known. Marine microbiology, still in its infancy, is likely to change how we look at global biodiversity.There is no question that training students in these areas will be responsive to the growing needs of industry. New pharmaceutical companies focusing on developing new drugs from marine resources now require trained personnel with experience across the disciplines of marine biology, microbiology, chemistry, genomics, bioinformatics and more. As society will soon realize the end of centuries of open ocean fishing, the enhanced focus on aquaculture will generate thousands of jobs for trained marine biotechnologists with training in marine microbiology, pathology, nutrition, genomics, proteomics and more. The growing use of marine products in the food, cosmetic, and agriculture industries has created a current demand we can barely meet. Our marine biotechnology students are currently among the top candidates to fill these positions, and they are in significant demand.《海洋生物技术》课程教学大纲绪论1.海洋生物技术2.海洋生物技术的发展3.海洋生物资源概况第一章长在瓶子里细胞1.细胞的原代培养2.细胞的传代培养3.长生不老的细胞4.细胞的保存5.用细胞分离病毒和生产疫苗6.用细胞筛选药物7.用细胞生产珍珠教学难点：细胞培养。
沪科教版选修3现代生物科技专题《动物细胞培养》说课稿
沪科教版选修3现代生物科技专题《动物细胞培养》说课稿引言大家好，我是XX学校的XX老师，今天我将为大家带来本课《动物细胞培养》的说课稿。
本课是沪科教版选修3现代生物科技专题的一部分，旨在帮助学生了解动物细胞培养的原理和应用。
通过本课，学生将进一步认识到细胞培养在现代生物科技中的重要性，培养学生的科学素养和实践能力。
一、课程信息•教材版本：沪科教版选修3•课程名称：现代生物科技专题•课程主题：动物细胞培养•课时安排：2课时二、教学目标1.知识目标：了解动物细胞培养的概念，掌握动物细胞培养的基本原理和步骤。
2.能力目标：能够进行简单的动物细胞培养操作，并了解动物细胞培养在生物科技领域的应用。
3.情感目标：培养学生的团队合作意识和实验安全意识。
三、教学重难点1. 教学重点•动物细胞培养的基本原理•动物细胞培养的步骤和注意事项2. 教学难点•细胞培养技术的细节操作•细胞培养在生物科技领域的应用四、教学过程1. 导入 (5分钟)向学生们展示一张细胞培养实验的图片，引导学生们思考并回答以下问题：你知道这是什么实验吗？这个实验有什么作用？2. 知识讲解 (20分钟)2.1 动物细胞培养的概念和意义教师通过简明扼要的语言向学生介绍动物细胞培养的概念和意义，让学生了解细胞培养对于生物科技的重要性和影响。
2.2 动物细胞培养的基本原理教师通过图示和简单实例，向学生解释动物细胞培养的基本原理，包括细胞培养基的成分和作用，细胞培养中需要的组织培养器具等。
2.3 动物细胞培养的步骤和注意事项教师结合实际操作演示和图示，详细介绍动物细胞培养的步骤和注意事项，包括细胞的分离和接种、培养基的配制、培养条件的控制等方面的内容。
3. 实践操作 (50分钟)将学生分成小组，每个小组配备一套动物细胞培养实验用具，进行实践操作。
老师和助教进行现场指导和帮助，确保实验操作安全和顺利进行。
在实践过程中，老师可以与学生进行互动交流，解答学生的问题，并引导学生观察实验现象和总结实验结果。
动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立-080125(1)
实用文档
8
动 物
取材
细
胞
切割
原
代
消化
培
养
过
接种培养
程
图
实用文档
9
原代细胞的取材
一、取材的基本要求
（1）取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功，取材时应 尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养， 应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清 除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内 4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋 巴组织应加入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基，按细胞冻 存方式于液氮中冷冻保存。
洗手和着装 原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果实验
过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养 室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。
培养过程中的无菌操作 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，
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或动物胚胎
原 代 培 养
分散成单个细 胞
一定浓度的细 胞悬浮液
动物胚胎或 幼龄动物的 器官、组织
胰蛋白酶 剪碎
制成
单个细胞 加培养液
细胞悬浮液 细胞系
原代培养 传代培养
细胞株
遗传物质改变 传代培养
原代培养：将组织取出来后，先用胰蛋白
酶等处理使组织分散成单个细胞，然后配 制成一定浓度的细胞悬浮液，再将悬浮液 放入培养瓶中，这个过程称为原代培养。 (第1代~第10代以内)
For 5 L For 10 L For 1 L
P0425
M199培养基,含Earles' Salts,含L-Glutamine,不含碳酸氢钠,含25mM Hepes,干粉
For 5 L For 10 L For 1 L
P0410
M199培养基,含Hanks' Salts,不含L-Glutamine,不含碳酸氢钠,干粉
一、细胞工程与细胞培养
1 细胞工程的定义
细胞工程 (cell engineering)是以细胞生物学和分子生物 学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或
技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的
性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关 理论和技术方法的学科。
500 ml
500 ml 500 ml For 1 L
300.00
320.00 430.00 70.00 250.00 440.00 70.00 250.00 440.00 70.00 250.00 440.00
P0420
M199培养基,含Earle's Salts,含L-Glutamine,不含碳酸氢钠,干粉
在对鱼类组织进行细胞培养时，要根据不同种类 的鱼选择适合其生长的培养基。在培养海水鱼类
细胞时，要在培养基中加入适当量的NaCl
（1.5%），以维持渗透压（4ⅹ105Pa），但是
NaCl的浓度不能太高，太的营养研究。如今，M199培养基广泛用于非转 化细胞、疫苗和病毒的研究以及上皮细胞的原代 培养。
定子。决定动物细胞全能性的关键在于细胞质。
植物体细胞具有全能性
1．动物细胞培养与植物组织培养的重要区别 在于：[ ] A．培养基不同； B．动物细胞培养不需要在无菌条件下进行； C．动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能； D．动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能 培养成植株。
动物细胞培养技术的发展
传代培养：把原代培养增殖的细胞定期用
胰蛋白酶把细胞从瓶壁上脱离出来，配制 悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶 中培养，这称为传代培养。
细胞株：原代细胞和50代前的传代细胞叫做
细胞株。
细胞系：50代后，遗传物质发生了改变，
并且有癌变的特点，无限传下去的传代 细胞。
细胞株
细胞系
细胞悬浮液
10代细胞
For 5 L For 10 L
合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、碳水化合物、
无机盐和一些其它辅助性成分。 (1)氨基酸 必需氨基酸是动物细胞本身不能合成的，因此，在制备培
养基时需加入必需氨基酸，另外还需要半胱氨酸和酪氨酸。而且由于
细胞系不同，对各种氨基酸的需要也不同。有时也加入其他非必需氨 基酸，氨基酸浓度常常限制可得到的最大细胞密度，其平衡可影响细 胞存活的生长速率。在细胞培养中，大多数细胞需要谷氨酰胺作为能 源和碳源。(氨基酸为L型) (2)维生素 Eagle基本培养基中只含B族维生素，其他维生素都靠从血 清中取得。血清浓度降低时，对其他维生素的需求更加明显，但也有
细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖
目的：获得新性状、新个体、新物质
2 细胞工程的研究范畴
•动物细胞与组织培养
•植物细胞与组织培养
•细胞融合
•细胞核移植
•染色体工程 •胚胎工程 •干细胞与组织工程 •转基因生物与生物反应器
3 动物细胞工程
常用的技术手段：
包括动物细胞培养、动物细胞融合、单 克隆抗体、胚胎移植、核移植等 。 动物细胞培养是其他细胞工程技术的基 础。
货号
L0325 L0330 L0331
产品名称/描述
M199培养基,含Hanks' Salts,不含L-Glutamine M199培养基,含Hanks' Salts,含L-Glutamine M199培养基,含Hanks' Salts,含L-Glutamine,含25mM Hepes
规格
500 ml 500 ml 500 ml
50代细胞
传代培养
原代培养
动物细胞培养的应用
1）生产有价值的蛋白质生物制品；如病毒 疫苗、干扰素、单克隆抗体等。 2）为治疗和预防疾病提供理论依据 （如为皮肤大面积烧伤的病人培养可供移 植皮肤） 3）用于检测有毒物质
2. 鱼类细胞培养的方法与技术
2.1鱼类细胞培养基的选择
主要是合成培养基，常用的有以下几种：Eagles MEM、Leibowitz L-15、M199和M1640。 Eagles MEM适用于多种细胞的生长培养，如 CCO、AS、CHSE-214、RTG-2等，还可以通过 在其中添加或减少某些成分用于特殊研究的细胞 培养，是一些海水鱼类细胞系培养常用的培养基； M199所含的营养成分丰富而且全面，可以在细胞 培养中用作维持液，可以使一些细胞的存活时间 达到33天，是一些淡水鱼类细胞系常用的培养基；
单价
300.00 320.00 430.00
L0356
L0355 L0360
M199培养基,含Earles' Salts,不含L-Glutamine
M199培养基,含Earle's Mod. Salts,含L-Glutamine,含1.25g/L碳酸氢钠 M199培养基,含Earle's Salts,含L-Glutamine,含25mM Hepes
些情况，即使血清存在，它们也必不可少。维生素限制可从细胞存活
动植物、微生物细胞的培养特征
植物
分化成熟的植物细胞体，仍有可能发育成完整植株。
动物
随着分化的演进，分化成熟细胞逐渐丧失其分化潜能,不
能发育成为完整的动物个体。
实验证明，囊胚阶段的细胞乃至成熟的体细胞，保持着
全套基因组的细胞核仍具有全能性——可能发育成完整个 体。
细胞质中有着决定细胞分化全能性的物质，称为分化决