慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达
GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达
GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达姬灿灿;王震英;燕鹏荣;陈楠;吴静;张永飞;宋亚丽;张莉【期刊名称】《中国麻风皮肤病杂志》【年(卷),期】2015(031)001【摘要】目的:明确GJB6目的基因蛋白Cx30在GJB6 3种突变体A88V、G11R 和V37E在HaCaT细胞中的表达.方法:构建GJB6基因突变体的慢病毒载体,并转染至HaCaT,应用荧光倒置显微镜检测其表达.结果:突变体中G11R和A88V经过多次转染实验,能够明确观察到HaCaT细胞细胞膜上有Cx30蛋白的荧光表达;而V37E突变型荧光表达极弱或无.结论:3种突变体的Cx30表达量不同,初步推测突变体编码的蛋白质或不能定位于角质形成细胞膜或不能形成功能性的Cx30,从而影响了HaCaT细胞正常的增殖和分化.【总页数】4页(P11-14)【作者】姬灿灿;王震英;燕鹏荣;陈楠;吴静;张永飞;宋亚丽;张莉【作者单位】山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021【正文语种】中文【相关文献】1.网素蛋白1和增强绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体构建和鉴定及在结直肠癌细胞SW480中表达 [J], 何佳;邓峰美;林友胜;刘漪沦2.β-catenin和突变体△N90腺病毒载体的构建及其在MSCs中的表达 [J], 崔恒进;王春燕;胡君;谢桂琴;徐晓静;张焕相3.表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建 [J], 于永生;罗晓彤;吴晓洁;周艳荣;陈红星;邓继先4.IK4基因突变体与其逆转录病毒载体的构建及在白血病细胞中的表达 [J], 史柳芝;郑倩倩;贺立彩;5.IK4基因突变体与其逆转录病毒载体的构建及在白血病细胞中的表达 [J], 史柳芝;郑倩倩;贺立彩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小动物活体成像技术原理及常见问题分析
小动物活体成像技术原理及常见问题分析活体成像技术是指应用影像学方法，在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。
通过这项技术可以非侵入式、直观地观测活体动物体内肿瘤的生长，转移、疾病的发展过程、基因的表达变化等生物学过程。
与传统剥瘤称重测量的方法相比，活体成像能够对同一种实验对象在不同时间点进行观察，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)，数据更加真实可信，成本更低，灵敏度更高。
目前活体成像技术主要采用生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）两种技术，生物发光技术是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光蛋白（如GFP,RFP,Mcherry等）标记细胞或是蛋白等研究对象。
其中生物发光技术因其操作简单，反应灵敏，在肿瘤，分子互作及信号传导等研究中得到了广泛应用。
LUC荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。
萤火虫荧光素酶属于加氧酶（oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。
萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。
将萤火虫荧光素酶的基因插入慢病毒介导的载体中，通过CAG启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。
常用于细胞标记后小动物细胞移植活体成像追踪，从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果等。
GFP绿色荧光蛋白1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互作用。
将绿色荧光蛋白的基因插入慢病毒介导的载体中，通过flap-Ub启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。
利用重组慢病毒载体建立稳定表达绿色荧光蛋白细胞系
绿色荧光蛋白——结构及应用
绿色荧光蛋白——结构及应用孙艺佩【摘要】绿色荧光蛋白(GFP)有稳定、灵敏度高、无毒害、载体便于构建等优点,因此在各个领域已经有了广泛的应用,在细胞生物学与分子生物学领域中,基因常被用作一个报导基因作为生物探针,拿来映证某些假设的实验方法;在医学领域,常用利用绿色荧光蛋白观测肿瘤发生、生长和转移等过程.本文就绿色荧光蛋白的发现与应用背景、结构、生色机理、相对于其他荧光分子的优点和在各领域的应用进行了综述.【期刊名称】《化工中间体》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】2页(P124-125)【关键词】绿色荧光蛋白(GFP);荧光生色机理;生色团;技术应用【作者】孙艺佩【作者单位】山东省实验中学山东 250000【正文语种】中文【中图分类】Q绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，1962年，下村修等人于维多利亚管状水母中第一次发现并提取出了绿色荧光蛋白。
1994年，马丁·查尔菲首次在实验中成功表达GFP基因，向人们展示了绿色荧光蛋白作为遗传标签的价值。
同年，钱永健与其同事提出GFP生色团发光机理并改造GFP，使其更易作为标记物应用于各类试验。
2008年，诺贝尔化学奖授予钱永健、马丁·查尔菲和下修村，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白。
这一发现成果为生命科学的进步提供了更便捷的渠道。
从维多利亚多管水母中分离出来的野生型GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约27kDa。
它具有β-桶的结构，几乎是个直径2.4nm，长4.2nm的完美圆柱。
11个β-折叠链形成β-筒的外周，筒两端分别被一些分子量较小的短α-螺旋覆盖，组成生色团的三个残基（Ser65-Tyr66-Gly67）与α-螺旋共价相连，位于圆筒中央螺旋中部。
β-圆筒与短α-螺旋形成致密的结构域，使配体不能扩散进入,生色团被严格保护在筒内，因此其性质稳定，不易被淬灭。
稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建
稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建阳小飞;余意;刘孟雪;荣伊;林显光【摘要】为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.%In order to investigate whether green fluorescent protein (GFP) can stably express with the proliferation of cells in the passage cells, HEK293T cells were infected by the third generation lentivirus to build a cell line stable expressing GFP.The fluorescence intensity and the morphology of the cells were measured by the cell imaging, the current voltage (I-V) curve of HEK293T cells was recorded by whole cell patch.The results showed that GFP could stably express with the proliferation of cells, and the morphology and basic electrophysiological activity were not significantly changed between experimental cells and control cells.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(036)002【总页数】4页(P38-41)【关键词】绿色荧光蛋白;HEK293T细胞;慢病毒【作者】阳小飞;余意;刘孟雪;荣伊;林显光【作者单位】中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q813.6绿色荧光蛋白(GFP)是在水母体内发现的一种荧光蛋白. 经过改造后GFP其结构与光学性质更加稳定，在488 nm的激发光下会发出绿色荧光[1]. 由于其极强的稳定性，在细胞内蛋白的定位、基因表达的监测等实验中发挥了巨大的作用.慢病毒载体是对HIV-1进行改造后得到的慢病毒载体[2,3]，使用慢病毒载体可以有效地将外源shRNA或者基因在宿主细胞内表达[4]. 将慢病毒的几个核心元件(RRE、REV和VSVG)同时转染到体外培养的人胚肾细胞HEK293T中，元件表达后得到的蛋白会互相识别，组装成具有侵染能力的慢病毒[5-7]. HEK293T细胞生物学性质稳定，且表达5型腺病毒E1A蛋白和SV40大T抗原，转染效率高[8-10].选取HEK293T细胞作为宿主细胞. 通过慢病毒侵染的方法将GFP导入HEK293T细胞，侵染后的HEK293T细胞(HEK293T- GFP)在488 nm的激发光下会发出绿色荧光[11]。
ErbB4基因miRNA慢病毒载体的构建及其在小鼠海马齿状回的表达
ErbB4基因miRNA慢病毒载体的构建及其在小鼠海马齿状回的表达李树玲;颜慧;宫泽辉【期刊名称】《中国药理学与毒理学杂志》【年(卷),期】2013(027)001【摘要】目的构建靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体,包装产生高滴度慢病毒并观察其感染小鼠海马齿状回基因的表达.方法将靶向ErbB4基因的miRNA干扰质粒利用Gateway重组技术构建慢病毒表达质粒,并与慢病毒包装系统共转染HEK293T包装细胞,收获上清并浓缩得到慢病毒浓缩液,通过测定绿色荧光蛋白(GFP)表达水平测定其滴度.所得慢病毒浓缩液经立体定位微量注射感染小鼠海马齿状回.观察鼠脑冰冻切片基因表达情况,并用神经元标志物神经元核抗原(NeuN)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)特异性抗体行免疫染色分析转导的细胞类型.结果阳性克隆测序结果与设计序列一致,说明靶向ErbB4基因的miRNA慢病毒干扰载体构建成功.包装收获慢病毒.浓缩的慢病毒包装上清感染HEK293T细胞后,流式细胞术检测GFP阳性率,计算得慢病毒活性滴度为1.0×1012转导单位(TU)·L-1.小鼠海马齿状回立体定位微量注射1.0×1012 TU· L-1慢病毒6个月后,观察到注射部位外源基因的显著表达.免疫荧光染色显示,慢病毒转导的细胞多呈NeuN标记阳性,并与GFAP的表达不重叠.结论靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体构建成功,获得了靶向ErbB4基因的高滴度miRNA慢病毒颗粒,并实现了脑实质的局部长期稳定转导,慢病毒转导的主要细胞类型为神经元.%OBJECTIVE To construct a lentiviral vector containing miRNA targeting ErbB4, package high titer lentivirus and observe its infection and expression in thehippocampus dentate gyms of mice. METHODS Lentiviral miRNA vector targeting ErbB4 was constructed from miRNA expression vectors by Gateway recombinant technology. HEK293T producer cell line was contransfected with the lentiviral expression construct and packaging mix, viral supernatant was harvested and condensed, and the titer was determined using green fluorescent protein (GFP) expression with flow cytometry. Lentivirus was stereotactically micro-infused into the hippocampus dentate gyrus of mice. Six months later, brain cryosections were used to observe gene expression. Immunofluorescence staining of brain sections with antibodies specific for neurons marker neuronal nuclei (NeuN) and astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) was used to analyze lentivirus transduced cell types. RESULTS Lentiviral miRNA vector targeting ErbB4 was validated by sequencing, showing the correct construction. Lentivirus were harvest and concentrated after packaging in HEK293T cells. After transduction HEK293T cells with 10 -fold serial dilutions of lentivirus stocks, GFP positive cells were detected by flow cytometry and the lentiviral titer was determined to be 1.0 ×1012 transduction units (TU) ·L-1. Lentivirus mediated expression using GFP as a reporter were observed on hippocampus dentate gyrus in mouse brain sections 6 months after stereotactic micro-infusion lentivirus 1.0 ×1012 TU·L-1. In immunofluorescent staining analysis, most GFP positive cells were labelled for NeuN and no cell was double-labelled for GFP and GFAP. CONCLUSION ErbB4 specific lentiviral miRNA vector is successfully constructed. High titer lentiviral stocks are prepared and transduced braintissue in vivo successfully and stably. Neurons are the primary cell type transduced by lentivirus.【总页数】5页(P29-33)【作者】李树玲;颜慧;宫泽辉【作者单位】军事医学科学院毒物药物研究所新药评价研究室,北京100850;北京军区总医院中心实验科,北京100700;军事医学科学院毒物药物研究所新药评价研究室,北京100850;军事医学科学院毒物药物研究所新药评价研究室,北京100850【正文语种】中文【中图分类】R963【相关文献】1.小鼠SPINK5基因重组过表达腺病毒载体构建及其对特应性皮炎小鼠模型皮损疗效的研究 [J], 狄正鸿;许静;侯殿东;纪莲;刘晓梅;孙鲁宁2.小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达 [J], 孙智慧;韩杰;邵蕾;王利宏;宋俊贤;魏钟海;郑良荣3.小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定 [J], 孙钦儒;贾宁4.基于基因芯片技术研究氯化锂-匹罗卡品致痫小鼠海马组织miRNA-187的表达及GO和KEGG分析 [J], 吴琼;汪顺贵;郭雪峰;李华琼;陈爱玲;刁丽梅;仇小强5.POCD小鼠海马组织中差异表达miRNA的筛选、靶基因预测和生物信息学分析及其调控机制探讨 [J], 张英立;刘乘麟;于明懂;王莹;胡南;卢悦淳;吕国义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠Smad4基因慢病毒表达载体构建及在293T细胞中的表达
１ 哈尔滨医科大学附属第 二医院耳鼻 咽喉头颈外科 （ 哈尔滨 １ ５ ０ ０ ８ １ ） ２ 中国人民解放军 总医院耳鼻 咽喉头颈外科 解放军 总医院耳鼻喉研究所 （ 北京 １ ０ ０ ８ ５ ３ ）
慢病毒介导的绿色荧光蛋白报告基因对人多能干细胞的生物风险评估研究
工 作 液 、Blebbistatin购 自 安 徽 中 盛 溯 源 生 物 科 技 有 限 公 司 ； 2 m M 谷氨酸盐,0.18 pM p- 巯 基 乙 醇 和 10 mM Y-27632)培养
Matrige丨 购 自 美 国 Coming 公 司 ；Ubi-MCS-EGFP] RES- 8 天 ，形成拟胚体( embryonic body,E B ),将 这 些 E B 铺 到 0.1%
A 通 讯 作 者 ：聂 魏 ，主 要 研 究 方 向 ：干 细 胞 与 组 织 重 建 ，E - m a i l :dr.xinnie@
( 收稿丨J 期 ：2020-丨2 - 2 3 接 受 日 期 :202丨-01-1 8 )
现 物 医 学 Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO.12 JUN^021
GFP)报 告 基 因 在 研 究 中 的 应 用 十 分 普 遍 ，且具有其独特的优 势161其 中 慢 病 毒 载 体 由 于 其 整 合 基 因 组 的 特 性 ，其在感染时可 以 有 效 地 将 其 遗 传 物 质 引 入 靶 细 胞 ，可 在 细 胞 或 组 织 中 长 期 稳 定 表 达 目 标 蛋 丨 广 泛 应 用 于 基 W转染m 。但对于慢病毒的安全 性一直存在疑虑，是 否 对 0 标细胞的生物学特性产生不良影响 也较少报道。本 研 究 的 目 的 是 通 过 慢 病 毒 构 建 稳 定 表 达GFP 的 hiPSC,并 验 证 G F P 是否影响细胞的多能性和分化能力。
Green Fluorescence Protein Reporter Gene Labeled Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Lentivirus*
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慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达
【摘要】本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统，并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。
应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道元件、泛醌启动子和绿色荧光蛋白基因连接至pLO134载体，构建成pTK153载体。
之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统共转染293T细胞，12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞，在荧光显微镜下和应用流式细胞仪观察感染情况。
结果表明：慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，FACS分析转染效率为%，病毒滴度测定为
×106 U/ml。
感染小鼠T淋巴细胞后，荧光显微镜下观察到GFP的表达，FACS分析转导效率为%。
结论：成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体，对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。
【关键词】慢病毒载体 T淋巴细胞绿色荧光蛋白基因
Expression of Green Fluorescent Protein Gene in Mouse T Lymphocytes Mediated by Lentiviral Vector
Abstract This study was purposed to
the lentiviral vector carrying the green fluorescent protein (GFP) gene and to investigate the expression of GFP in T lymphocytes of the mouse. The polypurine tract (PPT) element, ubiquinone promoter (PUB) and GFP were ligated to plasmid pLO134 using subcloning technology to construct plasmid pTK153. Human kideny 293T cells were
system containing packaging plasmid
△NRF, plasmid pTK153 and envelope
calcium phosphate DNA precipation and the expression of GFP was observed under
fluorescence microscope after 12 hours. The viral particles were collected after transfection 72 hours, were frozen at -80℃ and were used to infect mouse T lymphocytes at multiplicity of infection ( .) of 3. The expression of GFP in mouse T lymphocytes was observed by fluorescence microscopy and
(FACS). The results showed that the transfection efficacy was ±% in 293T cells analysed by FACS and the viral titer was (±)×106 U/ml. The expression of GFP was also evident in mouse T lymphocytes and the transduction efficacy was (±)%. It is concluded that
vector containing GFP gene is successfully constructed and the transduction efficacy is high in mouse T lymphocytes.
Key words lentiviral vector; mouse T
lymphocytes; green fluorescent protein gene
J Exp Hematol 2007; 15(1):125-128
逆转录病毒载体系统已被广泛应用于临床前及临床的基因转移研究，虽然对其复制以及转导外源目的基因至细胞的相关机理研
究得较为深入，但是逆转录病毒载体不能有效转导非分裂期细胞，因而其应用于临床基因治疗受到了一定的限制［1］。
围绕这一问题，近年来人们把目光投向了来源于包括人类免疫缺陷病毒在内的慢病毒载体。
LV 最大的特点是可以感染非分裂期细胞如神
经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞等［2］。
我们构建了以为基础的LV三质粒系统，并以绿色荧光蛋白基因作为标志基因，观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。
LV三质粒系统的构建及鉴定
用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ分别从pTK131、pTK145及pTK54切下PPT元件、PUB 启动子及GFP基因，用T4DNA连接酶依次将PPT元件、PUB启动子及GFP基因连接至由
BamHⅠ酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去除
的载体pLO134上，连接产物转化感受态细胞DH5α，同时设立空白对照。
37℃过夜培养，次日从连接板挑取6-8个克隆进行扩增培养，用Promega公司质粒小量提取试剂盒提取质粒后，分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SacⅡ和AgeⅠ+XbaⅠ鉴定连接产物的正反向。
包装质粒△NRF、包膜蛋白质粒、pTK131、pTK145及pTK54均为本科徐开林教授构建。
慢病毒载体包装细胞系的建立
应用Ivitrogen 公司无内毒素的质粒中量提取试剂盒提取pTK153、△NRF及
用于转染。
转染前24小时选择生长状态良好的293T细胞按1∶3传代，24小时后细胞生长达60%-70%汇合时采用磷酸钙沉淀法进行转染。
将转移质粒pTK153 15 μg、ΔNRF 10 μg、μg、CaCl2 125 μl，补加消毒的双蒸水至500 μl，在涡旋混合器上边振荡边加入500 μl 2×BES，室温放置30分钟。
将转染液加到培养板中，轻轻混匀，3% CO2、37℃培养箱中培养3小时后，。