实验绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白
绿⾊荧光蛋⽩绿⾊萤光蛋⽩（Green fluorescent protein；简称GFP），由下村脩等⼈于1962年在维多利亚多管发光⽔母中发现，其基因所产⽣的蛋⽩质，在蓝⾊波长范围的光线激发下，会发出绿⾊萤光，整个发光的过程中还需要冷光蛋⽩质⽔母素的帮助，冷光蛋⽩质与钙离⼦（Ca2+）可产⽣交互作⽤。
2008年10⽉8⽇，⽇本科学家下村脩、美国科学家马丁·查尔菲和钱永健因为发现和改造绿⾊荧光蛋⽩获得了诺贝尔化学奖。
绿⾊萤光蛋⽩现常被⽤来研究⾻架和细胞分裂、动⼒学和泡囊运输、发育⽣物学等，并可应⽤于转染细胞的确定、体内基因表达的测定、蛋⽩质分⼦的定位、细胞间分⼦交流的动态监测等。
基本信息中⽂名：绿⾊荧光蛋⽩英⽂名：green fluorescent protein别名：GFP发现者：下村修相关推荐慢病毒BSAdsDNA考马斯亮蓝CD34载体蛋⽩载体GAPDHcDNA⽂库免疫荧光PCR热休克蛋⽩鸟枪法shRNA显影液断裂基因同源重组酵母双杂交宏基因组透射电镜构造组成正在加载科学家在线形⾍体内植⼊绿⾊荧光蛋⽩质由⽔母Aequorea victoria中发现的野⽣型绿⾊荧光蛋⽩，395nm和475nm分别是最⼤和次⼤的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。
由海肾（sea pansy）所得的绿⾊荧光蛋⽩，仅有在498nm有⼀个较⾼的激发峰点。
在细胞⽣物学与分⼦⽣物学领域中，绿⾊荧光蛋⽩基因常被⽤作为⼀个报导基因(reporter gene）。
⼀些经修饰过的型式可作为⽣物探针，绿⾊荧光蛋⽩基因也可以克隆到脊椎动物（例如：兔⼦上进⾏表现，并拿来映证某种假设的实验⽅法。
蛋⽩作⽤绿⾊荧光蛋的发光机理⽐荧光素/荧光素酶要简单得多。
⼀种荧光素酶只能与相对应的⼀种荧光素合作来发光，⽽绿⾊荧光蛋⽩并不需要与其他物质合作，只需要⽤蓝光照射，就能⾃⼰发光。
在⽣物学研究中，科学家们常常利⽤这种能⾃⼰发光的荧光分⼦来作为⽣物体的标记。
绿色荧光蛋白和PCR技术
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。
由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm 分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。
由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。
在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。
一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。
2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。
GFP的性质GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。
GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。
而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。
中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。
GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。
但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。
绿色荧光蛋白发光原理
绿色荧光蛋白发光原理
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein）是一种重要的实验室研究手段，能够用于观察和定位细胞中分子的运动轨迹。
它是一种荧光蛋白，属于酶蛋白质家族，能够转化从低能量状态到高能量状态的光子水平，从而产生绿色荧光。
根据允许询时反应机理，绿色荧光蛋白发光可以概括由四步反应完成：异构化，吸收，发射，重蒙换，是一种非常有效，高效和精确的发光过程。
绿色荧光蛋白的能谱具有明显的红移，激发波长和发射波长分别为396 nm和508 nm。
由于绿色荧光蛋白具有可靠的稳定性，抗药性以及良好的杂交传递，它被广泛应用于医学及药物毒性研究，可以更快、更准确地定位细胞中被定位分子，从而提供可靠的数据。
此外，GFP也被用来监视受诱导的表达，可以同时观察多个基因在一个样品中的运动和表达情况，从而提供细胞动力学发展的模式和信息的定位和分析解决方案。
综上所述，绿色荧光蛋白是属于酶蛋白质家族，能够转换从低能量状态到高能量状态的光能而引发发光，具有可靠的稳定性、抗药性和良好的杂交传递，在实验室研究观察和定位细胞中分子的运动轨迹中有着重要的意义，在医学及药物毒性研究中也发挥着重要作用。
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种源自于海葵的蛋白质，具有绿色荧光特性。
它的发现和应用为细胞生物学研究带来了巨大的突破，成为了生物学研究中的重要工具。
本文将介绍绿色荧光蛋白的特性和它在细胞生物学中的应用。
绿色荧光蛋白的发现和研究始于上世纪60年代末。
由于GFP具有独特的荧光特性，能够发射绿色荧光，并且不需要外源性荧光素或酶辅助作用，使得它成为细胞生物学研究中的理想标记工具。
通过将GFP基因与其他基因融合，研究人员可以追踪和观察特定基因在活细胞中的表达和运动。
GFP的应用广泛涉及细胞生物学的多个领域。
首先，GFP可以用来研究细胞的结构和形态。
通过将GFP与细胞骨架蛋白或细胞器定位蛋白融合，研究人员可以直接观察细胞骨架的分布和细胞器的定位，进而了解细胞的结构和功能。
GFP在细胞生物学中的应用还包括研究蛋白质的亚细胞定位和动态变化。
通过将GFP与感兴趣的蛋白质融合，研究人员可以实时观察蛋白质在细胞中的定位和运动。
这种技术被广泛应用于研究蛋白质的转运、分泌和降解等过程，有助于揭示蛋白质的功能和调控机制。
GFP还可以用于研究细胞的信号传导和相互作用。
通过将GFP与信号分子或蛋白质相互作用的区域融合，研究人员可以观察信号分子的活动和相互作用过程。
这为研究细胞信号传导通路的调控机制提供了有力的工具。
除了在基础研究中的应用，GFP还被广泛用于生物荧光成像和生物医学研究。
通过将GFP标记的细胞或组织注射到动物体内，研究人员可以实时观察和追踪细胞或组织的活动和变化。
这种技术被应用于研究胚胎发育、神经元活动、肿瘤生长等过程，对于理解生物学的机制和疾病的发生发展具有重要意义。
总结起来，绿色荧光蛋白作为一种重要的标记工具，为细胞生物学研究提供了强大的支持。
通过GFP的应用，研究人员可以实时观察和追踪细胞和蛋白质的活动，揭示细胞的结构和功能，以及了解生物学的机制和疾病的发生发展。
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种自然存在于海洋水母Aequorea victoria中的荧光蛋白，其拥有强烈的绿色荧光。
由于其广泛应用于细胞生物学和生物化学领域，GFP已经成为研究生物过程和信号传递的强有力工具。
GFP的结构由238个氨基酸组成，具有一个单独的蛋白质区域，称为圆柱螺旋(Beta-can)。
GFP基因含有GFP编码序列，该序列通过表达可以产生GFP蛋白质。
GFP的荧光性质是由三个氨基酸残基组成的染色体枢纽部分决定的，即丝氨酸(Tyr66)、谷氨酸(Pro68)和脯氨酸(Ala80)。
在GFP的自然状态下，并不发出荧光。
但当该基因被转录和翻译成蛋白质之后，在有氧条件下，GFP的氨基酸序列会发生类似于玉米的光合作用过程，使得GFP的荧光激活。
在细胞生物学领域，GFP被广泛用作标记工具，以帮助研究人员观察细胞内部的某些组分或结构。
研究人员可以通过将GFP基因与目标蛋白的基因融合，使目标蛋白在表达时也表达GFP。
由于GFP的荧光性质，这样就可以通过荧光显微镜直接观察到目标蛋白的位置和分布。
通过GFP技术，科学家们得以研究细胞核或细胞器在发育过程中的变化，以及探索细胞活动的机制。
此外，通过将GFP基因与多个目标蛋白的基因融合，科学家们可以标记多种细胞结构，并观察它们在细胞活动过程中的相互关系和动态变化。
除了在细胞生物学领域的应用外，GFP还被广泛应用于分子生物学、生物化学、药物筛选和基因治疗等领域。
由于GFP的高度稳定性和荧光强度，它可以作为生物化学实验中定量和定位特定蛋白质的工具。
此外，GFP作为标记基因在基因治疗研究中也发挥着重要作用，用于追踪和监测基因表达和转导的进程。
尽管GFP已经成为生物科学研究中广泛应用的工具，但也存在一些局限性。
首先，GFP的结构和功能对温度和酸碱度非常敏感，因此在特殊环境中的应用可能受到限制。
荧光显微镜观察绿色荧光蛋白
荧光显微镜观察绿色荧光蛋白
荧光显微镜是一种高级的显微镜，它可以通过激发样品中特定分子的荧光来显示其位置和分布，其中最常用的是绿色荧光蛋白（GFP）。
GFP是一种干扰素，可以在细胞和组织中独立形成荧光，因此它成为细胞和分子生物学方面的一个热门话题。
在荧光显微镜观察GFP样品时，我们需要将GFP样品激发，使它发出荧光。
通常采用的方法是使用激光或白光照射样品。
在照射GFP样品时，蛋白发出绿色荧光，这是因为GFP吸收紫外线和蓝光，然后发出绿色光。
利用荧光显微镜观察GFP样品可以让我们深入了解生物体内的各种生物学过程。
例如，GFP可以被插入到生物体内的DNA序列中作为一个标签，这样我们可以跟踪GFP的位置和运动。
此外，GFP与其他蛋白质结合后，也可以跟踪这些蛋白质在细胞内的分布和活动。
除了在细胞和分子生物学方面的应用外，荧光显微镜观察GFP样品还可以在医学领域中进行应用。
例如，在肿瘤治疗中，我们可以将GFP 插入到体内肿瘤细胞中，然后使用荧光显微镜观察GFP样品，从而更好地理解肿瘤细胞的分布和活动，为治疗提供更准确的信息。
总之，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白是一个非常有用的技术。
它在诊断、治疗和研究方面都具有重要意义。
通过荧光显微镜观察GFP样品，我们能够更好地了解生命的本质和机理，有助于推动生物学科学的发
展和进步。
gfp绿色荧光蛋白检测原理
gfp绿色荧光蛋白检测原理GFP（Green Fluorescent Protein）是一种自然存在于水母中的蛋白质，最早被发现于1962年。
由于其独特的荧光性质，GFP已经成为生物成像和分子生物学研究中的重要工具。
GFP绿色荧光蛋白检测原理是一种非常常见的检测方法，下面我们将一步步介绍该原理。
首先，我们需要了解GFP的结构和性质。
GFP由238个氨基酸组成，其中包括三个特定的氨基酸序列，这些序列决定了GFP的二级和三级结构，从而决定了其荧光性质。
GFP在紫外线和蓝光的激发下能够产生绿色荧光，这是由于其内部含有一个芳香族环结构（环肽），在外界刺激下受激发并发出流明绿色的荧光。
在GFP检测中，我们通常使用荧光显微镜来观察样品。
为了实现这一点，我们需要将GFP引入到细胞、病毒或其他生物体中，并使用特定的荧光标记物标记它们。
这些标记物可以通过短脉冲激光激发荧光，然后使用荧光显微镜观察荧光信号。
由于GFP的某些特定结构，我们可以通过观察荧光强度和形态来确定GFP的位置和数量，从而对细胞或病毒的行为和功能进行研究。
此外，许多GFP变种已经被开发出来，这些变种具有不同的发射波长和荧光强度，可以用于不同类型的研究。
例如，我们可以使用蓝色荧光蛋白（BFP）来标记细胞核，使用黄色荧光蛋白（YFP）来标记细胞质，用红色荧光蛋白（RFP）来标记细胞膜，从而实现全面的细胞成像。
总之，GFP绿色荧光蛋白检测原理是一种基于GFP独特荧光性质的生物成像技术，通过标记和激发荧光信号来观察生物分子和细胞结构。
随着越来越多的GFP变种的开发，这种技术将成为生物学研究中不可或缺的工具之一。
绿色荧光蛋白的发光原理
绿色荧光蛋白的发光原理
绿色荧光蛋白（GFP）的发光原理可以简单归纳为以下几个步骤：
1. 激发：GFP的发光需要一个外部的激发源，通常为紫外光。
当紫外光照射到GFP上时，能量被吸收，并引发GFP分子内
部的电子跃迁。
2. 吸收和激发：GFP中存在一个色氨酸残基（Trp67），它会
吸收激发光的能量，并将其传递给GFP的染色基团。
染色基
团会通过共振能量传递机制，将激发能量传递给GFP分子中
的芳香族氨基酸残基（Tyr66和Tyr145），进一步激发GFP
分子的内部电子。
3. 激发状态稳定化：通过共振能量传递，激发的电子会从色氨酸残基传递给芳香族氨基酸残基，将能量逐渐稳定化。
此时，GFP的分子处于激发态。
4. 荧光发射：当激发态的电子返回基态时，会释放出能量。
在GFP中，这个能量以光的形式发射出来，形成绿色荧光。
总结起来，绿色荧光蛋白的发光原理是通过紫外光激发GFP
分子内部的电子，经过色氨酸和芳香族氨基酸的传递和稳定化，最终以绿色荧光的形式发射出来。
这个发光原理的理解和应用使得GFP成为生物医学领域中重要的荧光探针。
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生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：2011506066班级：11级生技02班前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.一.实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。
2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。
3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。
二．实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。
再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。
将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达三.实验材料及仪器1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21；2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。
四.实验内容4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定：1)实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸DNA 染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T4 lisase。
2)实验步骤：质粒的提取与鉴定（1）在含有质粒的DH5α平板菌落上挑取单菌落，接种于20ml含有100μl /ml Apm的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。
（2）分装菌液到1.5ml离心管中，冰浴2min。
4℃、12000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。
再用同样方法收集一次菌体。
（3）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，涡旋剧烈振荡，混匀，冰浴10min。
（4）加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管5次，充分混匀，冰浴5min。
（5）加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置10min。
4℃、12000rpm 离心10min。
（6）加等体积的酚/氯仿（1：1），震荡混合有机相和水相，冰浴3min。
4℃、12000rpm 离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。
（7）加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），振荡混合有机相和水相，4℃、12000rpm 离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。
（8）加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀DNA 10-20min。
4℃、12000rpm 离心10min，弃上清，留沉淀（管底有少量白色沉淀）。
（9）分2次加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀， 12000rpm 离心5min，抽吸去除所有上清，放置室温干燥，让酒精挥发。
（10）加30μl TE（内含浓度50μg/ml的RNase A）溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA。
-20℃保存备用。
（11）制1%的琼脂糖凝胶：加25ml×TAE缓冲液于三角瓶。
称取0.25g琼脂糖加到三角瓶中，与微波炉加热至完全溶化。
冷却至60℃左右，加1μl的GoldView 溶液，摇匀。
轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30min以上。
轻轻拔掉梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm。
（12）点样：取5μl质粒DNA及2μl加样缓冲液混合上样，80—100v约电泳20—30min。
质粒DNA的酶切（1）酶切：按如下双酶切体系（20μl）混合反应物ⅠⅡ质粒5μl 3μlXhoⅠ(10U/μl) 0.5μl 0.5μlNdeⅠ（10U/μl）0.5μl 0.5μl10×buffer 2μl 2μlddHO 12μl 14μl2先加水，再加buffer，加质粒，加内切酶，放离心机上混匀。
在37℃水浴4h。
（2）电泳，在紫外观察分析仪上观察酶切结果。
4.2目的基因的获得和重组载体的构建1)实验试剂：模板DNA；dNTP；Taq DNA聚合酶；引物；10×buffer（内含Mg2+）；ddH2O；10×T4DNA连接酶buffer；T4DNA连接酶。
2)实验步骤：目的基因的获得、检测及回收（1）依次混匀下列试剂：反应体系ddH2O 9.5 μlMix 12.5 μl上游引物 1 μl下游引物 1 μl模板 1 μl混合后瞬时离心。
（2）PCR反应程序94℃预变性 3 min94℃变性 30 sec52℃退火 30 sec 30个循环72℃延伸 1 min72℃延伸 1 min4℃（3）电泳：扩增产物用1% 的琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
（4）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。
（5）以0.1g 凝胶对应300μl 的体积加入PN。
（6）50℃水浴10min ，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解。
（7）将上一步的到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管中，13000rpm 离心60s，弃掉废液。
（8）加入800μl漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。
（9）加入500μl漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。
（10）将离心吸附柱放回收集管，13000rpm离心2min。
（11）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 30μl，洗脱缓冲液在65℃水浴中预热，室温放置2min，13000rpm 离心1min，然后将离心的溶液重新加回到离心吸附柱中，13000rpm离心1min。
（12）电泳检测回收产物，余置于-20℃保存。
重组质粒的连接将PCR扩增的目的基因片段产物与PGM-T载体连接。
反应体系（μl）如下；体系成分体积（μl）溶液Ⅰ 5PGM-T载体 0.2目的基因产物 4.8将反应液混合，16℃ 30 min。
4.3感受态细胞的制备及转化1)实验试剂:LB培养液；0.1mol/L CaCl2溶液；E.coli DH5α受体菌（R-M-）；LB培养基；氨苄青霉素；IPTG；X-gal。
2)实验步骤感受态细胞的制备（1）活化E.coli DH5α菌株：将实验室保存的E.coli DH5α菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。
（2）按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡继续培养至OD值为0.3-0.5左右。
400（3）在已灭菌的10ml离心管总吸取上述培养液10ml，冰浴20min 后，4℃、6000rpm离心10min，收集菌丝，弃上清。
（4）加2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl溶液，重悬菌体，冰浴10min。
4℃、6000rpm2离心10min，收集菌丝，弃上清。
溶液中，轻轻重（5）将每一份沉淀轻缓的悬于0.4ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬菌体沉淀。
冰上放置10min。
（6）分装100μl/管（冰浴分装），置-4℃冰箱保存。
连接产物转化感受态细胞（1）转化用固体LB培养基平板的制备向含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的固体LB培养基平板上加50mg/ml 的IPTG 16μl和20mg/ml的X-gal 40μl，用灭菌涂布棒涂布均匀，37℃避光倒置3 h，让溶解X-gal的二甲基酰胺尽量挥发干净。
加入IPTG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。
（2）连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞①去5μl连接产物加到100μl E.coli DH5α感受态细胞（从-70℃冰箱取出放于冰上，带钢解冻加入连接产物）中，轻弹混匀，冰浴20min。
②取出离心管，42℃水浴热击90s，立即置冰浴中冷却3min。
③向离心管中加入900μl 37℃预热的无抗生素的LB液体培养基，混匀后，37℃、200rpm振荡培养1 h，复苏菌体。
④取出离心管，6000rpm离心2min，弃上清800μl，用剩余的月100μl 上清液将沉淀菌体吹打混匀后，加到含100μl/ml氨苄青霉素（Amp）的IPTG 和X-gal的LB固体培养基平板上，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀。
放在室温直至液体吸收。
倒置平板，37℃恒温培养14-16h，直至长出单菌落。
4.4重组子的筛选鉴定1)实验试剂：dNTP；Taq聚合酶；引物；10×buffer（内含Mg2+）；ddH2O ；NdeⅠ；XhoⅠ；Apm；LB培养基2)实验步骤重组质粒的PCR鉴定（1）挑取单菌落：使用无菌枪头挑取5个白色单菌落，放入内含有氨苄抗生素的LB液体培养基的1.5ml离心管中，振荡培养4h以上，吸取0.5μl菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。
（2）PCR反应体系（10μl）O 9.5 μlddH2Mix 12.5 μl上游引物 1 μl下游引物 1 μl模板 1 μl混匀后瞬时离心。
（3）PCR反应程序94℃预变性 3 min94℃变性 30 sec52℃退火 30 sec 30个循环72℃延伸 1 min72℃延伸 1 min4℃（4）电泳：扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。