同工酶测定技术
临床生物化学检验-第7章 临床酶学检验技术
酶活性的国际单位定义； 酶活性测定的连续监测法的概念、计算和分 类；酶活性测定的影响因素及最适条件的确定原则。
血清酶变化的病理机制；酶动力学参数的含义；电泳法和免疫抑制法 测定同工酶的原理。
酶蛋白质量测定的优点；定时法测定临床常用诊断酶的原理和评价； 同工酶的其他检测方法。
2
第一阶段（1908 ~ 1950） ：利用化学和有机化学的反应原理测定酶促反应生成量或底物消耗量定 时法测定AMY (1908年， Wohlgemuth)、 LPS、ALP、ACP等几种酶。
2. 国际酶学委员会将每种酶用4个数字加以系统编号： 数字前冠以EC ，数字之间用黑点 隔开。第一个数字表示酶的类别 ，第二个表示亚类 ，第三个表示亚-亚类 ，第四个表示 酶的编号序数：如EC1.1.1.27 LD (乳酸脱氢酶)。
3. 同工酶：催化相同化学反应， 但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的
心梗、肌病、颅脑损伤、肿瘤 心梗、肌病、肺梗死、肝病、肿瘤 肝胆疾病、骨病、妊娠、结肠炎、肿瘤
红细胞、前列腺、溶酶体 γ-GT1、 γ-GT2、 γ-GT3、γ-GT4
前列腺癌、血液病、骨肿瘤 肝癌、梗阻性黄疸
P-AMY(P1、P2、P3)、S-AMY(S1、 S2、 S3、S4) ALT、 mALT AST、 mAST
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连续监测法（continuous monitoring assay）： 在多个时间点连续测定产物生成量或底物消耗量 ，选取线性期的速率来
计算酶活性 ，又称速率法。将酶与底物在特定条件 (缓冲液、温度等) 下孵育 ，每隔一定时间 (2s∼60s) 连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信 号的变化 ，从而计算出每分钟的信号变化速率 ，求 出酶活性浓度。 尤其适合在自动化分析仪上使用
心肌同工酶(CK-MB)测定操作规程(SOP)
心肌同工酶(CK-MB)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清样品中肌酸激酶同工酶（CKMB）的活性。
二、临床意义（一）概述肌酸激酶是由M型和B型两种亚基组成的二聚体，结合形成三种CK同工酶：CK-BB、CK-MB、CK-MM。
骨骼肌中大多数为CK-MM；胃肠道和脑组织中以CK-BB为主；心肌中以CK-MB为主。
当心肌损害，特别是发生心肌梗塞时，血液中CK-MB水平升高。
胸疼发生后4-6小时CK-MB水平开始升高，12-24小时到达高峰，48小时后回到基质水平。
（二）临床意义CK－MB主要存在于心肌中，约为心肌总CK的１4％,血清CK-MB上升先于总活力的升高，24小时达峰值，36小时内其波动曲线与总活力相平行，至48小时消失。
（三）医学决定水平15U/L: 高于此值，且有持续性临床表现（胸痛、心电图显示特异性改变等），提示为急性心肌梗塞，应及时进行治疗。
90U/L: 高于此值多由于非心肌性CK-MB释放，如恶性肿瘤，应采取其他有关诊断方法，予以确诊。
三、检验原理磷酸肌酸 + ADP −−→−-B CK肌酸 + ATP ATP + 葡萄糖−−→−HK葡萄糖-6-磷酸 + ADP葡萄糖-6-磷酸 + NADP −−−−→−PDH G 66-磷酸-葡萄糖 + NADPH + H+用特异的抗CK-M 抗体抑制CK-M 的活性，在340nm 波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A ／min)，测定CK-B 的活性，将CK-B 活性测定值乘以2，即可计算出样品中CK-MB 的活性。
四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。
样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。
血清CK及其同工酶测定.ppt
扰，试剂易得，操作条件易于掌握。
缺点：需精密荧光分光光度计，不适宜基
层单位使用。
酶偶联-丙酮酸测定法步骤（顺向反应）
空白
标准
测定
H2O
0.1
血清
0.1
标准
0.1
酶试剂
0.5
0.5
0.5
37℃，10min
DNP
0.5
0.5
0.5
37℃，15min
0.4N NaOH
Mg2+是CK 的必需激活剂，但过量反而 抑制；
样品宜用血清或肝素化血浆；
标本应避免严重溶血；
血清中CK较不稳定，室温4h或4℃12h可 使酶失活。
二、CK测定方法
比色法 紫外分光光度法 荧光法
比色法
利用顺向反应
1、测磷法 CrP在酸液中易水解成Cr及无
机磷酸。（ATP与ADP在酸性条件下较 稳定）
4
4
4
室温5min，440nm比色
计算：Au/As×200U/L
三、血清CK同工酶测定
方法：琼脂糖凝胶电泳法。
2、酶偶联-丙酮酸测定法
CK
肌酸+ATP
磷酸肌酸+ADP
丙酮酸激酶
ADP+磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸+ATP
丙酮酸+2，4-二硝基苯肼
丙酮酸-2，4-二硝
基苯腙
☆顺向反应测定CK的底物较便宜； ☆测磷法的试剂较易得而稳定； ☆丙酮酸激酶价格较贵，不易获得； ☆顺向反应速度较慢，灵敏度较低。
利用逆向反应
多利用逆向反应，是国际最常用方法
CK
CrP+ADP
实验9-10 植物过氧化物酶同工酶的测定(凝胶圆盘电泳)
（五）记录并计算： 记录并计算： 观察、记录酶谱， 观察、记录酶谱，并 计算各同工酶的相对 迁移率。 迁移率。
【要点提示】 要点提示】
1. 分离胶聚合时间应控制在 ～60min，聚合过 分离胶聚合时间应控制在30～ ， 快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或 快使凝胶太脆易断裂，主要是 或TEMED过 过 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是 或 TEMED用量不足或已失效。 用量不足或已失效。 用量不足或已失效 2. 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水， 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 凝胶底部断裂等，应注意调整。 凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/ 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过 管。
（四）染色： 染色： 临用时配制染色液：（ ml ） 临用时配制染色液：（10 ：（ 联苯胺母液 H2O 3% H2O2 0.5 ml 9.3 ml 0.2 ml
将染液倒入盛有凝胶条的试管中（ 将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过 胶条）。约10min后用自来水冲洗。 胶条）。约 后用自来水冲洗。 ）。 后用自来水冲洗
【实验步骤】 实验步骤】
（一）过氧化物酶的提取：取8~12粒发芽 过氧化物酶的提取： 粒发芽 的麦粒，加入1ml H2O 或0.5mol/L Tris的麦粒，加入 HCl缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。 缓冲液（ ），冰浴上研成匀浆。 缓冲液 ），冰浴上研成匀浆 转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵 转入离心管，再用 上述溶液冲洗研钵 壁并全部转入离心管，4000r/min离心 壁并全部转入离心管， 离心10 离心 min，上清液供电泳分析用。 ，上清液供电泳分析用。
CKMB
肌酸激酶同工酶MB（CKMB）的检测一、项目名称、检验方法名称1. 项目名称：肌酸激酶同工酶MB（CKMB）的检测2. 检验方法名称：化学发光法二、方法学原理：肌酸激酶同工酶MB测定采用双位点夹心化学发光免疫分析法，其采用的技术原理如下：第一步：将样本与包被着CK-MB单克隆抗体的超顺磁性磁微粒（磁珠）以及CK-MB单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物添加到反应管中，经过孵育，样本中的CK-MB和包被在磁珠上的CK-MB单克隆抗体结合，同时CK-MB单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物与样本中CK-MB另一位点结合。
反应完成后，磁场吸住磁珠，洗去未结合的物质。
第二步：将化学发光底物（3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，AMPPD）添加到反应管内，发光底物AMPPD能有效地被碱性磷酸酶所分解, 脱去一个磷酸根基团，生成不稳定的中间产物，该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态返回基态时，产生化学发光，由光电倍增管对反应所产生的光子数进行测量，所产生的光子数与样本内CK-MB的浓度成正比。
样本内分析物的量由定标曲线来确定。
三、试剂品牌、代号、包装规格、内含物1、试剂品牌：深圳迈瑞2、包装规格：2*503、内含物：Ra试剂：包被着抗CK-MB抗体的超顺磁性微粒，0.2 g/L；Tris缓冲液，50 mmol/L；ProClin 300，0.5 g/L；叠氮钠，0.9 g/L；Rb试剂：抗CK-MB抗体-碱性磷酸酶标记物，3 mg/L；MES缓冲液，50 mmol/L；ProClin 300，0.5 g/L；叠氮钠，0.9 g/L4、储存条件及有效期：2~8℃保存，有效期365天。
上机使用后，在2~8℃的贮存环境下有效期为28天四、仪器品牌、型号：迈瑞CL1000i五、具体操作步骤（包括主要的仪器测定参数）5.1校准：5.1.1校准品来源：试剂厂家的标准液。
血清肌酸激酶MB同工酶DGKC推荐方法测定
血清肌酸激酶MB 同工酶DGKC 推荐方法测定1. 实验原理使用多克隆抗体抑制CK 的CK-M 同工酶活性后，按照德国临床化学学会(DGKC)和国际临床化学学会(IFCC)推荐的连续监测法检测余下的肌酸激酶活力。
CK-MB 由CK-M 和CK-B 亚单位组成。
抗CK-M 抗体完全抑制了CK-MM （肌酸激酶的主要活性部分）和CK-MB 中的CK-M 亚单位的活性。
再检测CK 的活力为余下的CK-B 的活力，相当于一半CK-MB 活力。
所以将结果乘以2，为CK-MB 的活力。
ADP + 磷酸肌酸 肌酸 + ATPATP + 葡萄糖 ADP + 葡萄糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸+ 6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H +2. 标本：2.1 病人准备：无特殊。
2.2 类型：血清，肝素或EDTA 血浆。
3. 标本存放：稳定性：-20℃保存稳定4周（避光保存）。
活性损失：2～8℃保存24小时或18～22℃保存1小时至少损失10%。
4. 标本运输：常温条件下保存运输。
5. 标本拒收标准：细菌污染的标本。
6. 实验材料6.1 试剂 利德曼CK 测定试剂盒（试剂1 6×64ml 试剂2 6×16ml ）6.1.1 试剂组成试剂1（R1）+ 试剂2（R2）：咪唑缓冲液 pH6.7 100mmol/L磷酸肌酸 30mmol/L葡萄糖 20mmol/LN-乙酰半胱氨酸（NAC ） 20mmol/L乙酸镁 10mmol/LEDTA-Na2 2mmol/LADP 2mmol/LNADP 2mmol/LAMP 5mmol/L CK 己糖激酶(HK) (G6P-DH)二腺苷-5'-磷酸10μmol/L6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6P-DH）≥1500U/L已糖激酶（HK）≥2500U/L抑制人CK-MM的人抗体≥2000U/L6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3 试剂稳定性与贮存：试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
3-POD同工酶的提取及电泳检测
实验三 POD同工酶的提取及电泳检测摘要：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，进行了POD同工酶的提取及检测实验。
为蛋白质的分离、鉴定提供科学依据。
关键词：POD同工酶，聚丙烯酰胺凝胶电泳引言：过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。
这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。
此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。
同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如POD在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
1 材料1.1 材料：小麦、玉米幼苗1.2 仪器：（1）分光光度计；（2）移液管（3）离心机（4 000r/min）；（4）研钵(5)垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (6)稳流稳压电泳仪；（7）高速冷冻离心机；（8）电子天平；（9）电冰箱；（10）瓷盘、微量进样器；（11）电热恒温水浴锅；（12） S-22pC可见分光光度计；（13）电炉等1.3 试剂：（1）1N HCl：用12N的浓盐酸来配制；（2）分离胶缓冲液（pH8.9的Tris-HCl缓冲液）；（3）浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl缓冲液）：（4）分离胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液Ⅰ）；（5）浓缩胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液Ⅱ）：（6）过硫酸铵溶液（NH4）2S2O8简写Ap：（当天配制）；（7）核黄素溶液；（8）电极缓冲液：（pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液）；（9）40%蔗糖；（10）pH4.7乙酸缓冲液；（11）样品提取液；（12）0.5%的溴酚蓝：0.5g 溶于100ml无离子水；（13）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：1g联苯胺加9ml冰醋酸，溶解后加36ml水用时加160ml水加Vc140.8mg加几滴30%过氧化氢原液。
实验十 同工酶分析
实验四同工酶分析同工酶概述酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。
在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。
它们对底物的浓度、pH、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。
把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme）。
同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。
大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。
在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。
现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。
可以进行同工酶分析的酶已有100多种。
不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。
从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因：（一）亚单位结构学说亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为透彻的学说之一。
该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。
这个学说有广泛的实验证据。
如已经证明乳酸脱氢酶（LDH）是由A、B两个亚基，按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH1（A4）、LDH2（A3B1）、LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。
（二）不同基因编码由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个别氨基酸残基不同的多肽链。
因而产生同工酶。
由不同基因引起的同工酶存在于同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族中。
（三）单一亚单位聚合程度不同有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同工酶。
经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体（26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。
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同工酶测定技术
一、电泳测定技术
在研究同工酶的方法中，电泳法的使用最广泛。
大致分为显微电泳、自由界面电泳和区带电泳3大类。
以区带电泳最为常用，因其简便、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态。
区带电泳法分离的原理与其他蛋白电泳相似。
可选支持物虽多，但目前多用醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。
自动化电泳分析系统多采用分辨率较高的琼脂糖凝胶作为支持介质，采用高压或常压电泳。
电泳后同工酶各组分的检测常用以下方法。
（一）活性显色
电泳分离得到的同工酶区带用酶反应染色法进行显色，不能直接显色者可加入工具酶经偶联反应显色。
由于活性显色需依赖其催化活性，因此，电泳后不能进行固定，并且呈色产物要求非水溶性。
常用活性显色系统有：
1.重氮试剂染料
人工合成的萘酚或萘胺衍生物在酶促反应后产生的萘酚或萘胺，与偶氮染料如固蓝B等生成难溶于水的有色重氮化合物。
如ALP、GGT 同工酶的测定。
2.电子传递染料
氧化还原酶类催化反应产生的H+经PMS传递给四唑盐染料，生
成不溶性紫红色的甲臜化合物或蓝色的双甲臜。
这类染料适用于氧化还原酶类同工酶检测，如LD同工酶的测定。
3.脱氢酶偶联的指示反应
检测波长340nm处NAD （P）H吸光度变化推算同工酶各组分活性，如AST、CK等同工酶测定。
（二）光密度计扫描
这是最常用的同工酶质量相对定量方法。
电泳分离同工酶后，经染色、洗脱、固定（滤纸、醋酸纤维素薄膜尚需透明）制成同工酶谱，再用光密度计扫描作相对定量测定。
若显示的区带数与同工酶数不一致时，要考虑巨分子酶的存在。
（三）洗脱法
将染色后的各同工酶区带从支持物上切下溶于洗脱剂中，测定各自的吸光度。
以总吸光度为100%，求出各区带百分含量。
若已知总活性，则可求得各同工酶组分活性的绝对值。
二、免疫化学测定技术
由于同工酶一级结构不同，因而抗原性也不同，可用特异免疫反应识别。
免疫化学法生物学特异性、灵敏度较高，即使低浓度的酶也能测定，操作简单。
也是研究同工酶的结构、各同工酶的亲缘关系和鉴定同工酶的重要方法。
（一）免疫抑制法
利用同工酶的一种亚基与相应的抗体结合后，该亚基的酶活性受到抑制，测定加抗体前后样品中酶活性的变化，可以计算出该亚基型同工酶活性。
本法无需分离抗原抗体复合物，测定快速，操作简单，适合于急诊及大批样品的自动化测定。
血清中CK-MB同工酶即用此法测定。
但该方法易受样本中存在的巨酶及其他同样不受所用抗体抑制的非待测同工酶影响，准确性欠佳。
（二）免疫沉淀法
制备相应同工酶的抗体，将该抗体与待测样品混合，在一定条件下形成抗原抗体免疫复合物沉淀，离心后即可测定上清液中其他同工酶活性。
将加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性，即可求出被沉淀的同工酶活性。
这类方法可用于检测前列腺ACP（PAP）和胎盘ALP。
（三）其他免疫学方法测定酶蛋白
包括免疫电泳、RIA、EIA和CLIA等灵敏度较高的方法。
这类方法最大特点是与酶活性无关，已用于检测CKMB、LD1、PAP、骨-ALP、P-AMY等。
三、层析分离测定技术
用于同工酶分析的常用层析法是柱层析，包括吸附柱层析、离子交换柱层析、凝胶过滤和亲和层析等。
柱层析技术较繁琐，未尚用于临床常规检测。
四、动力学分析测定技术
尽管酶促反应动力学参数并不能直接提供不均一性程度信息，但是对于提示存在多种同工酶仍然有价值。
测定动力学参数亦是同工酶研究不可缺少的步骤，并且有些动力学分析法因其简便易行而可用于临床实验室。
（一）Km分析
米氏常数（Km）是酶的特征性常数。
常用1/Km粗略估计酶对底物的亲和力大小。
对于同一底物，不同的同工酶组分有不同的亲和力，即Km值不同。
如LD除了催化乳酸与丙酮酸互变外，还能催化其他α-羟酸与α-酮酸互变。
各LD同工酶对这些底物的Km不同。
人LD1对α-羟丁酸的亲和力较大（Km=0.84mmol/L），而LD5对它的亲和力较小（Km= 10mmol/L），据此可鉴别LD同工酶。
但该法用于同工酶活性测定不准确，只能用于已分离的同工酶鉴定，难以临床推广。
（二）抑制剂分析
同一抑制剂对同工酶各组分抑制作用不同。
以酸性磷酸酶（ACP）为例，0.01mol/L的L-酒石酸可以使前列腺ACP完全丧失活性，但对红细胞ACP则无抑制作用。
借此可以测定这两种ACP的活性。
（三）pH分析
同工酶可有不同的最适pH。
还原丙酮酸的最适pH，人LD5为7.25，LD1则为8.0。
同样该法用于同工酶活性测定不准确，只能用于已分
离的同工酶鉴定。
（四）热失活分析
温度升高引起的酶蛋白的变性失活程度因同工酶各组分而不同。
如60℃加热30分钟LD5活性全部丧失，而LD1活性仅轻度下降。
五、同工酶的其他测定技术
可根据各同工酶对蛋白水解酶的敏感度不同，选择合适蛋白酶浓度和反应时间，将某些同工酶特异水解失活，而对其进行测定，此即同工酶的蛋白酶水解测定技术。
此外，尚可用免疫学方法和电泳法结合进行鉴定。
血清中一些同工酶酶与免疫球蛋白结合在一起，影响了它们的电泳迁移率。
观察与Ig反应前后电泳区带变化，可判断该类同工酶的存在。
这些技术尚未在临床广泛应用。