生物化学-核酸适配体及其在检测领域中的应用

核酸适配体及其在检测领域中的应用（学号姓名）南京师范大学化学与材料科学学院摘要：核酸适配体是一段DNA或者RNA序列，是利用体外筛选技术——指数级富集配体系统进化技术从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，该片段能与目标分子作用产生特殊的构象形式，对目标分子具有高度亲和力和专一的识别能力。

核酸适配体通常由化学合成，不依靠生物；价格便宜；且易于保存；而且标记后的核酸适配体一般与目标分子的结合力不会改变。

因此基于核酸适配体的生化检测技术到人们极大的关注[1]。

本文基于对核酸适配体的基本了解，通过对SELEX技术及对核酸适配体在检测领域中的研究进展的了解做了简单的概述。

关键词：核酸适配体，检测0 引言核酸适配体是寡核苷酸DNA或RNA，长度一般为20-80个核苷酸，它对很广范围内的物质都具有极强的亲和性能和特异性能，这些物质如药物类、蛋白质类、碳水化合物、氨基酸、类脂、有机分子或者是无机分子类以及其它的小分子。

核酸适配体的出现，使抗原抗体的反应发生了革命性的变化，它大大弥补了现有抗体的不足，也为传统免疫传感器发展开辟了一条新的道路。

[2]SELEX技术即指数级富集配基系统进化技术。

利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。

自Tuerk 等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异寡核苷酸配基后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具。

1 发现核酸适配体的技术——SELEX技术核酸适配体，是指一小段能与相应配体专一性紧密结合的寡核苷酸序列，一般由几十个核苷酸组成，可以是DNA也可以是RNA，最早是由Tuerk和Gold 发现的。

1990年，Tuerk等提出了一种新的体外筛选和扩增核酸的方法，命名为SELEX(指数级富集配体系统进化)，利用该方法他们成功地筛选出能够特异性结合T4DNA聚合酶的RNA寡核苷酸。

但当时他们并没有对这种RNA寡核苷酸进行命名，只是称其为配基。

核酸适配体这一概念是由Ellington和Szostak提出的。

同年，Ellington等同样利用SELEX技术成功筛选出了能够与汽巴克隆蓝、活性蓝4发生特异性结合的RNA，命名为aptamer(适配体)，它来源于拉丁语aptus，意思为“合适”。

两年后，他们再次利用SELEX技术筛选到了一种单链DNA适配体。

从以上开创性的工作来看，核酸适配体的发现在于SELEX技术的提出。

[3]SELEX技术利用大容量的随机寡核苷酸文库与靶分子的相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸并结合体外PCR扩增技术，使其得到指数级富集。

如此循环数轮最终进化成为高亲和力和高特异性的寡核苷酸配体。

SELEX 技术大致可分为以下几步：建库；筛选、分离、扩增；适配子的修饰。

自1990年Tuerk和Gold首次利用该技术成功地从随机RNA文库中筛选出与噬菌体T4DNA 聚合酶高特异性和高亲和力结合的寡核苷酸配基以来，已成功应用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、核苷酸和多肽等。

[4]近年来，随着一些改良SELEX体外筛选技术的不断出现和应用，如切换SELEX，加尾SELEX、CE-SELEX、FluMag-SELEX、微流体SELEX等，使得适配子筛选效率大大提高，极大地拓展了适配子技术在有害物质检测、新药研发、药物传递系统的设计、生物成像、临床治疗等领域的应用空间。

其检测范围也由蛋白质、酶等大分子物质，扩展到毒素、金属离子、有机染料、农药等外源性小分子污染物。

[5]2 核酸适配体传感器2.1电化学传感器电化学传感器主要依靠氧化还原探针得失电子时产生的电信号来实现目标物的检测。

核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域。

当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化。

研究者把核酸适配体应用为探针，开发了很多基于核酸适配体的构型变化的电化学传感器，又称为E-AB（Electrochemical aptamer-based）传感器，与电化学检测方法的结合使之具备便携化、操作简单、成本低等特点，所以E-AB传感器提高了核酸适配体在传感器领域的应用。

将核酸适配体探针应用到E-DNA传感器的设想最早是在2003年的美国科学院院刊（PNAS）论文中提出，并于2005年在Plaxco 实验室实现。

该传感器将一段能够特异性和凝血酶结合的DNA序列（即凝血酶核酸适配体）两端分别修饰一个巯基和一个亚甲基蓝基团，利用巯基和金之间的共价结合,将凝血酶核酸适配体组装到金电极表面。

在待测样品中无凝血酶时，核酸适配体呈松散的单链状态，末端的亚甲基蓝基团处于一定程度的自由状态，有机会接触到金电极表面，继而发生有效的电子传递过程，此时可以检测到一定的法拉第电流信号；当有目标物质凝血酶存在的时候，核酸适配体和凝血酶特异性结合，核酸适配体构型发生变化，末端修饰的MB 基团和电极之间的距离发生变化，导致法拉第电流减小。

利用这种信号电流的减小，可以灵敏检测到6.4nmol/L凝血酶，而且通过实验证明该探针不但可以重复利用，而且可以应用于血清样品的实际检测。

这种传感策略有很多类似的应用，例如Radi等利用类似策略成功检测了0.1mmol/L K+；Lai 等使用E-AB策略成功检测了50pmol/L血小板源性生长因子。

[6]根据是否采用标记物（酶、纳米粒子和氧化还原分子）对适配体进行修饰以产生检测信号，电化学核酸适配体传感器可分为标记型和非标记型。

标记型核酸适配体传感器的标记过程复杂、费用高，而且会在一定程度上影响适配体与目标分子的结合亲和力。

因此，构建简单、价廉和灵敏的非标记型电化学核酸适配体传感器具有重要意义。

聚硫堇具有良好的氧化还原可逆性和稳定性，近年来被用于免疫传感器、酶传感器、DNA传感器和化学传感器中作为优异的电子介体。

Ahammad等利用聚硫堇对邻苯二酚和对苯二酚的催化氧化作用构建了简单、高灵敏度同时测定二者的化学传感器。

金纳米粒子(GNPs)具有比表面积大、吸附能力强和生物相容性好等优点，可将生物分子有效地固定在其表面，用于构建生物传感器可提高灵敏度和稳定性，已在电化学生物传感器中得到广泛的应用。

用电聚合法制备了聚硫堇氧化还原电化学探针，以金纳米粒子为固定核酸适配体的载体构建了非标记型核酸适配体传感器。

用电化学阻抗谱对传感器的组装过程进行了监测，用循环伏安法和差分脉冲伏安法考察了传感器的电化学行为。

结果表明，该传感器对凝血酶的检测在1.0pg/mL～500pg/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.998，检出限为0.38pg/mL。

该传感器制备简单、灵敏度高且抗干扰能力强。

[7]2.2 光学传感器2.2.1荧光传感器荧光检测方法的有效性已经被广泛证实。

量子点或者半导体纳米颗粒是荧光纳米材料的一种，具有集中独特的光学特性。

Levy等首次将适配体与量子点结合在一起，通过能量的转化对凝血酶进行监测。

在研究工作中，他们将标记了量子点的适配体与标记了猝灭物质的DNA进行杂交。

加入凝血酶，量子点接近猝灭物质，使能量由量子点向猝灭物传递，从而使得量子点的荧光信号被截断；当凝血酶存在时，凝血酶和适配体相互作用，导致带有猝灭物的互补链释放，使量子点恢复了荧光信号。

Strano等引研制了另外一种量子点适配体传感器，他们用量子点标记凝血酶的适配体，当凝血酶存在时，它与适配体相互作用并且靠近量子点，电荷由凝血酶转移到量子点，从而产生荧光。

这种传感器非常敏感，其检测限为1nmoL／L，并且有较高的选择性。

Liu等啪3用量子点和金纳米颗粒(Au nanoparticle，AuNP)对腺嘌呤核苷和可卡因进行了复合检测。

实验分为两组，一组将光吸收峰为525 am的量子点和标记AuNP的腺嘌呤核苷适配体结合；另一组将光吸收峰为585 nm的量子点和标记AuNP的可卡因适配体结合在一起。

结果显示：两组实验最初组装体上的荧光都是猝灭的，加入腺嘌呤核苷和可卡因，二者与适配体相互作用，量子点-纳米金颗粒聚合物会被拆装，能量就由各自的量子点向AuNP转移，以致于在525nm或585nm时荧光信号增强，并且能够在两种波长时观察到荧光的增强。

作为一种适配体传感器模型体系，适配体或者脱氧核酶还可以结合到微流控设备上，这种设备具有低流量输出的优点，而且检测材料的消耗也较少，有再生性能。

依赖于Pb2+的脱氧核酶结合了神经细胞黏着分子（neural cell adhesion molecule，NCAM)后，在微流体设备的基础上，每次检测Pb2+消耗4.2PL脱氧核酶，检测限为11nmoL/L。

Li等将AuNP固定在微流控芯片的管道中，将一端含巯基另一端标记荧光基团的适配体溶液通入管道中。

适配体上的巯基与AuNP 结合后，适配体成拱状结构，发生荧光猝灭，当通入互补适配体溶液后，双链互补，适配体成直链状结构，荧光基团与AuNP之间距离发生改变，从而恢复荧光。

AuNP的适配体荧光探针在微流控方面的交叉应用有很好的发展前景。

[8]2.2.2 比色传感器比色传感器的设计比较简单，不需要对适配体进行固载，其中最常用的比色探针为金纳米粒子，原因为金纳米的分散度容易受到环境的影响，进而产生颜色的转变。

Zheng等基于比色方法，利用纳米金和RNA核酸适配体对多巴胺进行检测，检测原理为：纳米金会在高浓度的氯化钠溶液中发生聚集，当溶液中存在单链的核酸适配体时，适配体会吸附在纳米金表面阻止纳米金的聚集。

然而当溶液中存在适配体的靶目标时，适配体会从纳米金的表面脱落下来与靶目标结合，而纳米金对适配体一靶目标复合物没有结合力。

这时纳米金发生聚集，颜色由红色变为蓝色，从而实现对多巴胺浓度的检测。

Song等同样利用比色方法实现了对药物卡那徽素的检测。

2.3共振传感器表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)是指在光波的作用下，在金属和电介质的交界面上形成的改变光波传输的谐振波。

当光以大于全反射的入射角射到交界面上时，有一部分光被反射，另一部分光被耦合进等离子体内，在表面等离子中存在光的消失波。

如果入射光的波矢量沿着平行于界面的分量和表面等离子波的波矢量相等，表面等离子在光的作用下发生谐振，光波在传输过程中发生能量的损失，表现为光波的强烈吸收，这种现象称为等离子体的谐振。

由此现象设计制作的SPR传感器通常将一种具有特异性识别功能的分子即配体固定于金属表面，监控溶液中的被分析物和该配体相结合的过程，在复合物形成或解离的过程中，观察金属膜表面溶液的折射率变化，从而达到检测靶物质的目的。