固定化酶资料
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酶的固定化
3.扩散限制效应
酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产 生了扩散阻力：
●
外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过
程中的一种扩散限制效应，发生在固定化颗粒周围的液膜
层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅 拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。
●
内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到
缺点：
● ● ●
固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，工厂初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物， 与完整的菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅 胞内酶必须经过酶的分离手续。
对大分子底物不适宜；
●
助因子的反应；
●
三、影响固定化酶性质的因素
分配效应 空间障碍效应 扩散抑制效应
在具体选择时，一般应遵循以下几个原则：
（1）必须注意维持酶的构象, 特别是活性中心的构象。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。 （6）固定化酶的成本适中。
1.吸附法
吸附法（Adsorption） 是通过载体表面和酶分子 表面间的次级键相互作用 而达到固定目的，是固定 化中最简单的方法。只需 将酶液与具有活泼表面的 吸附剂接触，再经洗涤除 去未吸附的酶便能制得固 定化酶。
●
●
●
1.分配效应
由于载体和底物的性质 差异引起了微环境和宏观 环境之间的性质不同。微 环境是在固定化酶附近的 局部环境，而将主体溶液 称为宏观环境。由这种不 同造成的底物、产物和各 种效应物在两个环境之间 的不同分配，被称为分配 效应。
2.空间障碍效应
第九章 固定化酶
(2)整个系统各方同性。
在上述条件下，固定化对反应体系的影响，可以概括为三种类型：
1、构象改变和屏蔽效应
构象改变：酶在固定化的过程中，出于酶与载体相互作用使
酶的活性中心或变构中心的构象发生变化从而导致酶活性下 降。这种效应难以定量描写也难以预测。通常出现在吸附法 和共价键结合法。
立体屏蔽效应：由于载体对酶的活性中心或变构中心造成
3、偶联反应
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分 子上的非必需侧链基团，必需在温和的pH、中等离子强度 和较低温的缓冲液中进行。
（三）交联法
定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间， 或酶与惰性蛋白间进行交联反应，制备固定化酶的力法。 可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常用的交联试剂：戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮 联苯胺-2，2’二磺酸、 双重氮联苯胺等。
（四） 包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的 方法称为包埋法。 分类：根据载体与方法不同，分为： 网格型（凝胶包埋法） 微囊型（半透膜包埋法）
1、网格型： 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定 形状的固定化酶，称为网格型包埋法，也称为凝胶包埋法。
聚丙烯酰胺凝胶包埋法：
搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意图
什么是固定化酶？ 水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
定义：通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束
缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用； 曾称其为水不溶酶或固相酶。
第一节 概述
固定化酶的优点
3、pH的变化
PH对酶活性的影响：
（1）改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离
在上述条件下，固定化对反应体系的影响，可以概括为三种类型：
1、构象改变和屏蔽效应
构象改变：酶在固定化的过程中，出于酶与载体相互作用使
酶的活性中心或变构中心的构象发生变化从而导致酶活性下 降。这种效应难以定量描写也难以预测。通常出现在吸附法 和共价键结合法。
立体屏蔽效应：由于载体对酶的活性中心或变构中心造成
3、偶联反应
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分 子上的非必需侧链基团，必需在温和的pH、中等离子强度 和较低温的缓冲液中进行。
（三）交联法
定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间， 或酶与惰性蛋白间进行交联反应，制备固定化酶的力法。 可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常用的交联试剂：戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮 联苯胺-2，2’二磺酸、 双重氮联苯胺等。
（四） 包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的 方法称为包埋法。 分类：根据载体与方法不同，分为： 网格型（凝胶包埋法） 微囊型（半透膜包埋法）
1、网格型： 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定 形状的固定化酶，称为网格型包埋法，也称为凝胶包埋法。
聚丙烯酰胺凝胶包埋法：
搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意图
什么是固定化酶？ 水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
定义：通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束
缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用； 曾称其为水不溶酶或固相酶。
第一节 概述
固定化酶的优点
3、pH的变化
PH对酶活性的影响：
（1）改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离
第四章固定化酶.
第四章固定化酶固定化酶的是指是具有催化活性蛋白质的固定化，因此固定化酶一般为具有各种性状的颗粒，其反应过程必须在颗粒水平上进行描述和表达。
它的显著特征是：在描述其反应过程动力学时，必须包含有反应物系从液相主体扩散到颗粒内、外表面的传递速率的影响。
第一节固定化酶概论酶的催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点，但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入催化产物等物质，纯化困难，不能重复使用。
为了克服这些问题，20世纪60年代酶固定化技术应运而生。
它是模拟体内酶的作用方式（体内酶多与膜类物质相结合并进行特有的催化反应），通过化学或物理的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及长时间重复使用的一种交叉学科技术。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971年酶工程会议上被推荐使用的。
Trevan在1980年给出了固定化酶的定义：酶的固定化就是通过某些方法将酶与载体相结合后使其不溶于含有底物的相中，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应。
其实，固定化酶并不是新的物质，例如，胞内酶是在细胞内起作用的，类似于用包埋方法制成的固定化酶。
因此，固定化酶研究一定程度上可以认为是为了使酶在更接近其原始状态下进行的反应。
对各种酶的固定化技术进行积极的研究与开发始于20世纪50年代，通过重氮化共价结合法将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶等固定在聚氨基苯乙烯树脂上；1963年，利用聚丙烯酰胺包埋法固定了多种酶；1969年，日本的一家制药公司首次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。
通常的生物催化剂，如酶或细胞同其它溶质一样，分散在溶剂或溶液中，可以自由移动，称为游离酶或游离细胞。
若通过固定化技术将酶固定于载体表面或其内部，则与液相主体相分离，形成了固定化生物催化剂，即固定化酶。
固定化酶
⑵ 醚化，先把SESA以1：2的水浸泡，在 40℃时用1M Na2CO3调pH为6.5，除去渣， 以SESA：纤维素=1：1（干重）在pH13， 85℃，醚化30min，即得到ABSE-纤维素。
A．重氮法
⑶ 去除多余的苯胺基(用0.5 M NaOH洗三次，水洗至无 色）
⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及1MHCl在10℃以下反应 15min，然后用预先冷却的0.05M HCl及H2O洗涤抽干即 成。
举例：
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和 马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%； 用溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存 活50%。
用DEAE -纤维素通过离子结合固定化转化酶在 40℃下加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一 条件下存在100%。
固定化酶（细胞）热稳定性变化(延胡索酸酶，千烟一郎)
1） 分配效应 2） 空间障碍效应 3） 扩散限制效应
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液 称为宏观环境。
二．固定化后酶性质的变化-酶活性的影响
活力变化的原因：
1、酶分子在固定化过程中，空间构像可能发生了变化 有时活性中心的氨基酸也会参加反应。
2、固定化后的空间障碍效应的影响。 3、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受
⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应 20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶
(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸 缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时， 过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白 酶（冻干保存）
5． 底物特异性变化
A．重氮法
⑶ 去除多余的苯胺基(用0.5 M NaOH洗三次，水洗至无 色）
⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及1MHCl在10℃以下反应 15min，然后用预先冷却的0.05M HCl及H2O洗涤抽干即 成。
举例：
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和 马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%； 用溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存 活50%。
用DEAE -纤维素通过离子结合固定化转化酶在 40℃下加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一 条件下存在100%。
固定化酶（细胞）热稳定性变化(延胡索酸酶，千烟一郎)
1） 分配效应 2） 空间障碍效应 3） 扩散限制效应
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液 称为宏观环境。
二．固定化后酶性质的变化-酶活性的影响
活力变化的原因：
1、酶分子在固定化过程中，空间构像可能发生了变化 有时活性中心的氨基酸也会参加反应。
2、固定化后的空间障碍效应的影响。 3、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受
⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应 20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶
(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸 缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时， 过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白 酶（冻干保存）
5． 底物特异性变化
固定化酶
⑧充分考虑到固定化酶制备过程 和应用过程中的安全因素。
固定化载体的选择标准
① 载体的形式 ② 载体的结构 ③ 载体的性质
④ 酶偶联量或装载量和实效系数
二、固定化酶的制备方法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法 网格法
非化学结合法
包埋法
微囊法 交 联 法
化学结合法
共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
第一节
第二节
酶的固定化
辅酶的固定方法
第三节
第四节
固定化细胞
固定化酶的性质及其影响因素 Nhomakorabea
第五节
固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
解决办法??
第一节
酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点
固定化酶优点：
(1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应
固定化酶缺点：
①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物， 对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需 要辅助因子的催化反应 不适宜于多酶反应
法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基 丙烯酸甲酯等。
界面聚合法
化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合， 形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微 囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中 发生化学反应而失活。
第九章固定化酶
酶分子:侧链非必需基团
（游离α--氨基，lys—ζ—NH2, Arg胍基，-COOH, Asp—γ--羧基Glu--羧基， 酚羧基，巯基，咪唑基) 但是，载体、酶分子上的基团是不能直
接反应，功能基团要活化，
第九章 固定化酶
1)重氮化
芳香氨基载体
方法特点：
载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物， 在温和条件和酶分子上相应基团直接偶联。
现有多孔物质包络法，超过滤法 等。实际上用包埋法最多
第九章 固定化酶
各种固定化方法的优、缺点比较
吸附法
固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 包埋法 共价键结合法 交联法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收 高,酶易流失 高
高
低
中等
再生
可能
可能 不能 不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
第九章 固定化酶
2)微囊型包埋 常用微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、
醋酸纤维素等。
用半透膜将酶包埋在里面， 半透膜容许底物和产物自由出入膜囊，
囊的表面积相对体积的比值大， 底物和产物的交换进行迅速。
第九章 固定化酶
例子：尼龙膜界面聚合包埋
(酶+己二胺水溶液)+庚二酰氯有机溶剂(氯仿)
混合
乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有机相交界处聚合
芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入分子 中Tyr等集中的疏水区偶联而导致失效。
a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向 性越大。
b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区 的特性就大大减小了。
（游离α--氨基，lys—ζ—NH2, Arg胍基，-COOH, Asp—γ--羧基Glu--羧基， 酚羧基，巯基，咪唑基) 但是，载体、酶分子上的基团是不能直
接反应，功能基团要活化，
第九章 固定化酶
1)重氮化
芳香氨基载体
方法特点：
载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物， 在温和条件和酶分子上相应基团直接偶联。
现有多孔物质包络法，超过滤法 等。实际上用包埋法最多
第九章 固定化酶
各种固定化方法的优、缺点比较
吸附法
固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 包埋法 共价键结合法 交联法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收 高,酶易流失 高
高
低
中等
再生
可能
可能 不能 不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
第九章 固定化酶
2)微囊型包埋 常用微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、
醋酸纤维素等。
用半透膜将酶包埋在里面， 半透膜容许底物和产物自由出入膜囊，
囊的表面积相对体积的比值大， 底物和产物的交换进行迅速。
第九章 固定化酶
例子：尼龙膜界面聚合包埋
(酶+己二胺水溶液)+庚二酰氯有机溶剂(氯仿)
混合
乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有机相交界处聚合
芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入分子 中Tyr等集中的疏水区偶联而导致失效。
a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向 性越大。
b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区 的特性就大大减小了。
第五章 固定化酶讲解
• 缺点：酶与载体相互作用力弱、酶易脱落 等。
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
固定化酶的相关知识
固定化酶的相关知识固定化酶的定义：固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上, 进行催化生产,因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。
固定化酶的特点：优点:1.易于将固定化酶与底物产物分高,便于后续的分离和纯化;2.可以在较长时间内连续生产;3.酶的稳定性和最适温度提高;4.酶反应条件容易控制;5.可以增加产物的收率,提高产物质量;6.酶的使用效率高,使用成本低;7.适于产业化连续化自动化生产缺点:1.在固定化过程中,酶活力会损失;2.生产成本提高,工厂初期投资大;3.只能用于水溶性底物,适合于小分子;4.不适宜于多酶反应,还需要需要辅助因子的协助才可以有效反应固定化酶的方法：酶的固定化方法主要有四类：吸附法、包埋法、共价键法、交联法。
吸附法：吸附法是最简单的固定化方法，包括物理吸附和离子交换吸附。
物理吸附法常用的吸附剂有活性炭、硅藻土、多空玻璃、多孔陶器、硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等；离子吸附法是酶与载体通过范德华力、离子键和氢键等作用力固定。
包埋法：包埋法即酶在载体(如聚丙烯酰胺凝胶、矽酸盐凝胶、藻酸盐、角叉菜聚糖等)中发生聚合、沉淀或凝胶化而被固定的方法。
包埋法常用的载体主要有：明胶、聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。
共价键法：共价键法是利用化学方法将载体活化，再与酶分子上的某些基团反应，形成共价的化学键，从而使酶分子结合到载体上。
该方法使用广泛，固定化酶与载体连接牢固，不易脱落，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。
共价键结合法常用的载体有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物等。
交联法：使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体，交联形成的固定化酶称为交联酶。
与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使酶固定化，二者的区别在于交联法使用了交联剂。
常用的交联剂有戊二醛、蹂酸。
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24
五、固定化后酶性质的变化
• 1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下 降，反应速度下降
• 原因：酶结构的变化
• 空间位阻
25
2． 固定化对酶稳定性的影响
• （1） 操作稳定性提高。 • （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 • （3） 对热稳定性，大多数升高，有些 反而降低。 • （4） 对分解酶的稳定性提高。 • （5） 对变性剂的耐受力升高。
26
17
1．网格型
• 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格 中，制成一定形状的固定化酶的方法。 也称为凝胶包埋法。
18
2．微囊型包埋法
• 将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制 成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般 只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
19
各类固定化方法的特点比较:
比较项目 吸附法 物理吸附 制备难易 固定化程度 活力回收率 载体再生 费用 底物专一性 适用性 易 弱 较高 可能 低 不变 酶源多 结合法 .共价键结合 难 强 低 不可能 高 可变 较广 离子键结合 易 中等 高 可能 低 不变 广泛 较难 强 中等 不可能 中等 可变 较广 较难 强 高 不可能 低 不变 小分子底 物、药用 酶 交联法 包埋法
双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为
壳状固定化酶。
15
（2）交联包埋法
• 把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细 的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包 埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得 的固定化酶稳定性好。
16
（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔 载体中使酶固定化的方法。 分为：网格型和微囊型
酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过 程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个"载 体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血 红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白 质共交联。
14
双重固定法：
（1） 吸附交联法
• 先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树 脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等
8
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团
• • • 然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
9
（4）载体活化的方法
• • • • • A．重氮法(需载体具有芳香族氨基) B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法
10
（三）交联法
• 交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交
• • • •
（一） （二） （三） （四）
吸附法 结合法 交联法 包埋法
3
（一） 吸附法
• 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或 含酶菌体吸附在其表面上。 选择载体的原则: - 要有巨大的比表面积 - 要有活泼的表面 - 便于装柱进行连续反应 物理吸附法: -静止法 -电沉积法 -反应器上直接吸附法 -混合浴或振荡浴吸附法
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固定化后酶的考察项目：
• （1） 测定固定化酶的活力，以确定固 定化过程的活力回收率。
• （2） 考察固定化酶稳定性。
• （3） 考察固定化酶最适反应条件。
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评价固定化酶的指标:
• 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具
有的酶活力单位。
• 或：单位面积（cm2）的酶活力单 位表示（酶膜、酶管、酶板）。
4
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。 载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
5
（二）结合法
• 1 离子键结合法 • 2 共价键结合法
6
1 离子键结合法
• 酶分子 含有离子交换基团的固相载体 • 第一个离子结合法固定化酶： • DEAE — Cellulose • 固定化过氧化氢酶 • 第一个工业化的固定化酶： • DEAE-Sephadex A-50 • 固定化氨基酰化酶
联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
• 常用试剂:戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马
来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是
戊二醛。
11
双功能试剂：
常用的是戊二醛 O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛的两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱 (shiff)。
第二章 固定化酶
一、什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
易于与产物分离； – 可反复使用； – 可装塔连续化生产； – 稳定性好。 缺点： -固定化过程中往往会引起酶的失活 -首次投入成本高 -大分子底物较困难
2
三、固定化酶的方法
• 常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶 • 使用注意：pH、离子强度、温度
7
2 共价键结合法
• （1）概念 • （2）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 • （3）常用载体：天然高分子、人工合成的高 聚物、无机载体
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一 半所需要的时间（t1/2）
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• 3.
• 4.
• 或称偶联效率，活力保留百分数。
• 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定
化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。
•
23
四、影响固定化酶性质的因素
1．酶本身的变化，主要是由于活性中心 的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等 发生了变化。 2．载体的影响 • （1） 分配效应 • （2） 空间障碍效应 • （3） 扩散限制效应 3. 固定化方法的影响
第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间 交联的固定化酶
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• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成
图 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶 性的固定化酶。
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• 交联法有2种形式：
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂， 使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的 浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
五、固定化后酶性质的变化
• 1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下 降，反应速度下降
• 原因：酶结构的变化
• 空间位阻
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2． 固定化对酶稳定性的影响
• （1） 操作稳定性提高。 • （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 • （3） 对热稳定性，大多数升高，有些 反而降低。 • （4） 对分解酶的稳定性提高。 • （5） 对变性剂的耐受力升高。
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1．网格型
• 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格 中，制成一定形状的固定化酶的方法。 也称为凝胶包埋法。
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2．微囊型包埋法
• 将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制 成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般 只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
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各类固定化方法的特点比较:
比较项目 吸附法 物理吸附 制备难易 固定化程度 活力回收率 载体再生 费用 底物专一性 适用性 易 弱 较高 可能 低 不变 酶源多 结合法 .共价键结合 难 强 低 不可能 高 可变 较广 离子键结合 易 中等 高 可能 低 不变 广泛 较难 强 中等 不可能 中等 可变 较广 较难 强 高 不可能 低 不变 小分子底 物、药用 酶 交联法 包埋法
双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为
壳状固定化酶。
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（2）交联包埋法
• 把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细 的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包 埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得 的固定化酶稳定性好。
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（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔 载体中使酶固定化的方法。 分为：网格型和微囊型
酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过 程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个"载 体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血 红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白 质共交联。
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双重固定法：
（1） 吸附交联法
• 先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树 脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等
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共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团
• • • 然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
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（4）载体活化的方法
• • • • • A．重氮法(需载体具有芳香族氨基) B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法
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（三）交联法
• 交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交
• • • •
（一） （二） （三） （四）
吸附法 结合法 交联法 包埋法
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（一） 吸附法
• 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或 含酶菌体吸附在其表面上。 选择载体的原则: - 要有巨大的比表面积 - 要有活泼的表面 - 便于装柱进行连续反应 物理吸附法: -静止法 -电沉积法 -反应器上直接吸附法 -混合浴或振荡浴吸附法
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固定化后酶的考察项目：
• （1） 测定固定化酶的活力，以确定固 定化过程的活力回收率。
• （2） 考察固定化酶稳定性。
• （3） 考察固定化酶最适反应条件。
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评价固定化酶的指标:
• 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具
有的酶活力单位。
• 或：单位面积（cm2）的酶活力单 位表示（酶膜、酶管、酶板）。
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优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。 载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
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（二）结合法
• 1 离子键结合法 • 2 共价键结合法
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1 离子键结合法
• 酶分子 含有离子交换基团的固相载体 • 第一个离子结合法固定化酶： • DEAE — Cellulose • 固定化过氧化氢酶 • 第一个工业化的固定化酶： • DEAE-Sephadex A-50 • 固定化氨基酰化酶
联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
• 常用试剂:戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马
来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是
戊二醛。
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双功能试剂：
常用的是戊二醛 O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛的两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱 (shiff)。
第二章 固定化酶
一、什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
易于与产物分离； – 可反复使用； – 可装塔连续化生产； – 稳定性好。 缺点： -固定化过程中往往会引起酶的失活 -首次投入成本高 -大分子底物较困难
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三、固定化酶的方法
• 常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶 • 使用注意：pH、离子强度、温度
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2 共价键结合法
• （1）概念 • （2）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 • （3）常用载体：天然高分子、人工合成的高 聚物、无机载体
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一 半所需要的时间（t1/2）
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• 3.
• 4.
• 或称偶联效率，活力保留百分数。
• 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定
化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。
•
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四、影响固定化酶性质的因素
1．酶本身的变化，主要是由于活性中心 的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等 发生了变化。 2．载体的影响 • （1） 分配效应 • （2） 空间障碍效应 • （3） 扩散限制效应 3. 固定化方法的影响
第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间 交联的固定化酶
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• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成
图 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶 性的固定化酶。
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• 交联法有2种形式：
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂， 使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的 浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。