4型禽腺病毒抗体ELISA检测规程湖北标准2020版
禽流感的流行特点和检测技术
中国动物保健2021.06禽流感（avian influenza ，AI ）的潜伏期一般较短，通常为4～5d 。
发病时精神沉郁，食欲、饮欲降低甚至废绝，被毛散乱，体温升高，趴卧不动，偶有流泪。
头部、面部水肿，脚鳞发紫出血，肉垂和鸡冠呈干枯紫色，甚至坏死。
呼吸困难，咳嗽，听诊呈啰音；下痢，粪便呈淡黄或白色。
出现神经症状，共济失调，不能站立或行走。
并且该病为人畜共患病，处理不好不但会危害养禽业的经济发展，还会危害人类身体健康。
1禽流感的流行病学特点1.1传染源主要由感染或携带禽流感病毒的鸡、鸭、鹅等家禽，野外野生鸟类，特别是迁徙性水禽相互传染所致。
1.2传播途径主要通过病禽的分泌物、排泄物、尸体，污染的饮水、饲料和其他物体，直接或间接接触引发感染，主要感染途径为呼吸道和消化道，以及直接接触病毒毒株感染。
人工接种可通过气溶胶经口鼻内、气管内、眼结膜、腹腔、肌肉、静脉和泄殖腔内等途径使易感禽类感染。
1.3易感动物禽流感病毒在世界范围内广泛分布。
许多家禽、野禽、人类、特别是鸭等迁徙水禽，发生病毒感染的概率比其他禽类高，而家养的鸡和火鸡所发生的流感最为严重。
1.4特点多为大流行，世界范围流行。
过去呈三年小流行，五年大流行。
该病主要在寒流较多，气温变化大的秋冬、冬春交替季节流行。
2禽流感的检测技术2.1血清学诊断技术中和试验中和试验的操作步骤复杂，容易造成材料的浪费，临床上不常用，但其为最原始的病毒检测技术，常用来做标准与其他检测方法作比较。
本试验常用鸡胚或组织培养细胞作为样本鉴定禽流感病毒。
中和试验是具有高度的灵敏性和特异性的血清学方法，抗体只和病毒上表面抗原相对应，特别是已吸附的宿主细胞上的病毒颗粒表面的抗原相对应。
所以，在某种特定血清型的中和实验中，抗体只和组内的其他病原发生有限的交叉反应。
琼脂扩散试验琼脂扩散试验检测禽流感时，以具有血凝素活性的鸡胚尿囊液作为样品，采用已知的阳性血清和未知抗原进行病毒抗原型的特异性鉴定。
禽腺病毒Ⅰ群的研究现状
禽腺病毒Ⅰ群的研究现状王亚楠;韩涛;李纯玲;刘中奇;宋楠;刘瑞凿;雷娜;吴培星【摘要】近年来,全国各地相继暴发禽腺病毒I群疾病,给养殖业造成了很大的经济损失.本文将从病原学、流行病学、病毒的分离培养、诊断技术及预防等方面对该病的研究现状进行总结.【期刊名称】《中国动物保健》【年(卷),期】2017(019)001【总页数】4页(P61-64)【关键词】腺病毒;禽;研究现状【作者】王亚楠;韩涛;李纯玲;刘中奇;宋楠;刘瑞凿;雷娜;吴培星【作者单位】北京天之泰生物科技有限公司北京100194;北京天之泰生物科技有限公司北京100194;北京天之泰生物科技有限公司北京100194;北京天之泰生物科技有限公司北京100194;北京天之泰生物科技有限公司北京100194;北京天之泰生物科技有限公司北京100194;北京天之泰生物科技有限公司北京100194;北京天之泰生物科技有限公司北京100194;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃兰州730050【正文语种】中文禽腺病毒（Fowl adenovirus,FADV）属于腺病毒科，根据群特异性抗原的不同，分为三个群，分别是Ⅰ亚群、Ⅱ亚群和Ⅲ亚群。
禽腺病毒Ⅰ群(Fowl adenovirus group I,FADV-I)具有共同的群抗原，共12个血清型，普遍存在于鸡、鸭、鹅体内，一些血清型在肉鸡、野鸡、火鸡、鸽子、鹦鹉、长尾鸭、猎鹰中也有发现。
临床主要表现为包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis,IBH）、心包积液综合症(hydropericardium syndrome,HPS)和肌胃糜烂症(adenoviral gizzard erosion，AGH)。
禽腺病毒Ⅱ群可引起火鸡出血热和雉鸡大理石脾病，禽腺病毒Ⅲ群仅引起减蛋综合征。
在免疫学上，禽腺病毒I群能够诱导已感染的禽类产生高水平的中和循环抗体，并可在局部黏膜系统长期复制并持续少量排毒。
2020年主要动物疫病的检测方法及判定标准
采集扁桃体或颌下淋巴结，采 用猪瘟病毒 RT-NPCR、猪瘟病 毒荧光 RT-PCR 或猪瘟荧光抗 体检测方法进行检测。
猪瘟防治技术规 范
6 新城疫 采用血凝抑制试验方法，抗体效价≥25 的判为免疫合格
采集禽蛋咽喉/泄殖腔拭子，采 新城疫防治技术
用 RT-PCR 或荧光 RT-PCR 方 规范
法进行检测。
8
-
菌病
凝集试验或补体结合试验或采用 OIE 推荐的竞争酶联免疫吸附试验
（cELISA 试验）进行确诊。
按照国家标准（GB/T 18645-2002），用牛型结核分枝杆菌 PPD 皮内
变态反应试验或用外周血-干扰素体外释放检测法进行检测。对皮内
9 奶 牛 结 变态反应检测阳性结果疑似的动物，45 天后用牛型和禽型结核分枝
采集鼻腔/眼拭子或淋巴结、脾 4 小 反 刍 采用竞争 ELISA、阻断 ELISA 方法进行检测，结果判定参照试剂盒 脏等组织样品，采用 RT-PCR 小 反 刍 兽 疫 防 治
兽疫
说明书
或者荧光 RT-PCR 方法进行检 技术规范
测。
5 猪瘟
采用阻断 ELISA、间接 ELISA 或正向间接血凝试验；猪瘟抗体阻断 ELISA 和猪瘟抗体间接 ELISA 检测，抗体阳性即判定为合格，正向 间接血凝试验抗体效价≥25 为免疫合格
高致病性禽流感
2 性 禽 流 集血清样品，采用血凝抑制试验（HI）方法，H5 亚型（Re-11 株、 采用 RT-PCR 或荧光 RT-PCR
防治技术规范
感
Re-12 株）抗体效价≥24 为免疫合格，H7N9 流感抗体≥24 为阳性。 方法进行检测。
3 口蹄疫
O 型口蹄疫抗体检测采用液相阻断 ELISA 方法或正向间接血凝试 验，合成肽疫苗采用 VP1 结构蛋白 ELISA 进行检测，其中液相阻 断 ELISA 抗体效价≥26，正向间接血凝抗体效价≥25， VP1 结构蛋 白抗体效价≥25 为免疫合格；亚洲 I 型和 A 型口蹄疫抗体检测采用 液相阻断 ELISA 方法，抗体效价≥26 为免疫合格。
禽腺病毒的结构及其血清4型检测方法研究进展
禽腺病毒的结构及其血清4型检测方法研究进展
王凯莉;刘成;楚肖冉;司振书;路建彪;李玉保;曹胜亮
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2023(44)1
【摘要】近年来,由血清4型禽腺病毒引起的肝炎-心包积液综合征给养禽业带来严重的经济损失,该病毒的主要结构蛋白有六邻体、纤突和五邻体,可通过琼脂胶聚免疫扩散试验(AGIDT)、聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等进行诊断,其中聚合酶链反应是最常用的分子生物学诊断方法;血清学检测方法中将禽腺病毒重组蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法最为常用。
论文对禽腺病毒基因组和蛋白结构及FAdV-4检测方法进行了综述,以期为该病的快速检测及科学防控提供理论和技术支持。
【总页数】6页(P111-116)
【作者】王凯莉;刘成;楚肖冉;司振书;路建彪;李玉保;曹胜亮
【作者单位】聊城大学农学院
【正文语种】中文
【中图分类】S852.659.1;S852.657
【相关文献】
1.Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
2.禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用
3.禽腺病毒血清4型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用
4.血清4型禽腺病毒POCT荧光微
球免疫层析检测方法的建立5.禽腺病毒血清4型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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《禽流感病毒ELISA抗体检测技术规范》标准文本
禽流感病毒ELISA抗体检测技术规范前言本标准按GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。
本标准的附录A为规范性附录。
本标准起草单位：贵州省动物疫病预防控制中心。
本标准由贵州省动物疫病预防控制中心提出并归口。
本标准主要起草人：刘霞、王慧、李照伟、孙鹃、倪兴维、张霞、蒲同灿、汪忠荣。
禽流感病毒ELISA抗体检测技术规范1 范围本标准规定了禽流感病毒H5亚型、H7亚型抗体的竞争ELISA检测方法。
本标准适用于检测免疫的鸡、鸭、鹅等禽类血清中H5亚型或H7亚型禽流感病毒的抗体水平。
2 缩略语下列缩略语适用于本文件。
ELISA 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent test）OD4500nm值 450纳米波长处的吸光值3实验原理本标准采用竞争酶联免疫吸附法（竞争ELISA），该方法利用抗原抗体反应具有特异性的特点，将特异性的H7亚型（或H5亚型）禽流感病毒血凝抑制试验抗原吸附到固相载体的表面，将待检血清和特异性酶标单抗同时加入包被板孔。
待检血清中的抗体与酶标单抗竞争与包被抗原结合，因此，待检血清中抗体越多结合在包被抗原上的酶标单抗就越少，阳性血清反应呈色浅于阴性血清。
4 材料准备4.1 试剂见附录A。
4.2 仪器与器材酶标检测仪、台式低温高速离心机、37℃恒温培养箱、冰箱、微量移液器及配套洗头等。
4.3 样品动物血清或动物全血（待血液充分凝固后，4000r/min离心10分钟，收集上清），要求血清清亮，无溶血。
5 实验方法5.1 包被用包被液将包被抗原稀释至工作浓度（2μg/ml）加至抗原包被板中100μl/孔，置37℃下温育45分钟（或2℃～8℃包被15小时）。
5.2 封闭弃去包被液，每孔加入封闭液200μl，置37℃ 2小时；拍干，再置37℃干燥2小时。
5.3 1×洗涤液的配制使用前，将20倍浓缩洗涤液恢复至室温（15℃～25℃）并摇动使沉淀溶解（最好在37℃水浴锅中加热5～10分钟），然后用去离子水作20倍稀释（例如30ml 20倍浓缩洗涤液加上570ml去离子水），混匀，稀释好的洗涤液在2℃～8℃下存放7日。
Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立
Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立张启龙;孙丹;韦海涛;宋彦军;周德刚;冯小宇;王林【摘要】利用纯化的Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1％牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2019(053)008【总页数】7页(P1-7)【关键词】Ⅰ群禽腺病毒4型;Hexon蛋白;间接ELISA;检测【作者】张启龙;孙丹;韦海涛;宋彦军;周德刚;冯小宇;王林【作者单位】北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629;北京市兽药监察所,北京102629;北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629;北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629;北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629;北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629;北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629【正文语种】中文【中图分类】S852.65肝炎-心包积液综合征(Hepatitis and hydropericardium syndrome，HHS)是由禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)新基因型引起的以禽心包积液、肝脏黄染、肿大和出血为特征的传染病[1]。
HHS首次于1987年在巴基斯坦的安卡拉地区发生，又名安卡拉病，随后在亚洲、欧洲和南美洲等地区流行[2-4]。
2013年以来该病在我国河南、山东、江苏、河北、陕西等地大面积流行，给家禽养殖业造成了巨大经济损失[5-7]。
腺病毒
生活周期
腺病毒的生活周期可以分为两个截然不同却又不能割裂开来的两个阶段。第一阶段包括腺病毒颗粒粘附和进 入宿主细胞，将基因组释放到宿主细胞核中，以及有选择性地转录和翻译早期基因。在这个阶段，细胞为病毒基 因组复制和腺病毒晚期基因表达并最终释放成熟的感染颗粒，即第二阶段，作好了准备。第一阶段将在6~8个小 时内完成，第二阶段则更快，只需4~6个小时。
分类
分类及自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有52种， 分为A、B、C、D、E和F六个亚群（subgroup）。基因治疗常用的人的2型及5型腺病毒在血清学分类上均属C亚群， 在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常强，滴度通常可以达到109pfu (plaque forming unit)/ml， 其在单个细胞中的基因组拷贝数可达104（约占细胞总DNA的10%）。病毒颗粒比较稳定，通过CsCl梯度离心可以 达到1010~1011pfu/ml，满足动物实验的要求。
防治原则
腺病毒的甲醛灭活疫苗已被用于某些人群的预防，而且将来有被用人二倍体细胞培养的减毒活疫苗所替代的 可能。但因腺病毒对动物具有致癌作用，人们对全病毒疫苗的作用与安全性存有疑虑。此外加强游泳池和浴池水 的消毒，可使水传播性结膜炎爆发的危险性降至最小，在作眼的检查时应严格无菌操作，对所用设备充分灭菌， 也可控制流行性结膜炎的发生。对腺病毒感染的治疗仍无有效药物。
许多腺病毒在肠道细胞中复制，随粪便排出，但大多血清型与胃肠道疾病无关。而40型和41型腺病毒可引起 婴幼儿与年少（4岁以下）儿童的胃肠炎，致腹痛、腹泻。C组腺病毒能引起某些婴幼儿肠套叠。
腺病毒11、12型能引起儿童急性出血性膀胱炎，尿中出现病毒。37型可引起女性宫颈炎和男性尿道炎，常由 性传播感染。在免疫功能低下者可引起偶发或严重的病毒感染，尤其在器官移植病人中发生严重呼吸道感染和病 毒性肝炎，多由1、5和7型腺病毒引起。艾滋病患者可感染多种血清型腺病毒，并能出现抗原性介于中间的杂合 型毒株，而且常为致死性腺病毒感染。主要原因是腺病毒的E1A蛋白可反式激活HIV的转录，加速HIV的复制。临 床发现37%的艾滋病患者病毒性腹泻是由腺病毒所致。
标准操作规程(SOP)——流感禽流感微量中和抗体检测
标准操作规程（SOP）——一、目的微量中和试验是一种敏感性高、特异性强的血清学方法，用于测定血清中的病毒特异性中和抗体水平。
中国国家流感中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程，进行流感/禽流感微量中和抗体检测实验，以确保实验的准确性。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感/禽流感微量中和抗体检测。
三、责任进行流感/禽流感微量中和抗体检测的技术人员需严格按照规定进行操作。
四、程序（一）生物安全要求H5，H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在生物安全3级（BSL-3）实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在生物安全2级（BSL-2级）实验室中进行。
操作人员必须严格按照相应实验室的要求做好个人防护。
（二）材料1．中和反应实验材料（1）病毒：一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液，在-70℃中保存，并且注意避免反复冻融。
进行中和试验之前，需先进行病毒滴度（TCID50）的滴定。
具体步骤如下，1）病毒的稀释：可采取对数或者半对数稀释的方法。
以下介绍半对数稀释法。
取1管冻存病毒尿囊液，用病毒培养液进行1:100稀释。
第一列4个孔每孔加入146μL 1:100稀释过的病毒液，其它各列每孔加入100 μL 病毒培养液。
然后用多道加样器从第一孔吸46μL 至第二孔，做系列半对数稀释，使之成为10－2、10－2.5、10－3、10－3.5……10－7。
每孔含有100μL 病毒液。
2）每孔加入100μL MDCK 细胞悬液（1.5×104细胞/孔），37℃，5%CO 2培养箱孵育18～22h 。
每一滴度作平行4孔。
3）细胞固定、ELISA 操作如下述。
4）OD 值 〉2倍MDCK 细胞对照OD 值判定为阳性5）病毒滴度计算见组织细胞半数感染量滴定SOP 。
（2）血清样品：包括待检血清、阳性及阴性血清对照。
如果待检血清有可能需要多次检测，则需将待检血清进行小量分装，-20℃至-70℃保存均可，避免多次反复冻融。
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DB42/T—2020 4型禽腺病毒抗体ELISA检测规程
1范围
本文件规定了4型禽腺病毒抗体ELISA检测的术语和定义、实验原理、检测条件、检测方法、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施。
本文件适用于4型禽腺病毒鸡血清抗体的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法。
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4实验原理
本文件采用酶联免疫吸附法（ELISA），该方法利用抗原抗体反应具有特异性，将特异性的4型禽腺病毒五邻体蛋白（penton）吸附到固相载体的表面后，待测物中若含有相应的4型禽腺病毒抗体，则可与所包被的五邻体蛋白（penton）相结合，并能继续和相应的辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体结合形成复合物。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与待测物中4型禽腺病毒抗体的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
5检测条件
5.1试剂及耗材
5.1.1试剂
纯化的4型禽腺病毒五邻体蛋白（penton）、酶标记物（辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体）、底物液显色液、终止液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、包被液、封闭液。
试剂配方及4型禽腺病毒五邻体蛋白、阳性对照、阴性对照的制备见附录A。
5.1.2耗材
酶标板（96孔）。
5.2设备
1
DB42/T—2020
2酶标检测仪（配备450nm滤光片）、单道移液器（10μL）、8道移液器（300μL）、微量振荡器、恒
温箱（37℃）。
6检测方法
6.1抗原包被板的制备
6.1.1包被
将纯化的4型禽腺病毒五邻体蛋白（penton）用包被液稀释到0.625ng/μL，加入酶标板中，每孔加100μL，2℃～8℃包被12-15h。
6.1.2封闭
弃去包被液，每孔加入封闭液200μL，置37℃恒温箱中温育2h；弃去孔中液体，再置37℃恒温箱中干燥2h，密封2℃～8℃保存。
6.2洗涤液的配制
使用前，将20倍浓缩洗涤液恢复至室温22℃～25℃，并摇动使沉淀溶解，按照50mL20倍浓缩洗涤液加入950mL去离子水的比例稀释，稀释好的洗涤液在2℃～8℃保存，有效期为7日。
6.3待检血清的稀释
将5μL血清加入到95μL样品稀释液中，微量振荡器混匀，再取5μL混匀后的血清加入到120μL样品稀释液中，微量振荡器混匀备用。
6.4检测步骤
6.4.1待检样品温育
从冷藏环境中取出包被板，平衡至室温22℃～25℃后打开使用。
先用洗涤液洗涤抗原包被板1次，弃去孔中洗涤液，将稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照各取100μL，加至抗原包被板中，阴、阳性对照各设2孔，置37℃恒温箱中温育45min。
阴性对照血清和阳性对照血清无需稀释。
6.4.2洗涤
弃去孔中液体，每孔加入洗涤液300μL/孔，重复洗涤4次，最后一次拍干。
6.4.3酶标记物的温育
将辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体用封闭液作1:20000倍稀释，每孔加入100μL，置37℃恒温箱中温育45min。
6.4.4洗涤
重复步骤5.4.2。
6.4.5底物显色
每个反应孔加入底物显色液100μL，置22℃～28℃下避光显色15min。
DB42/T —2020
36.4.6终止
每孔加终止液50μL，10min内用酶标仪在波长450nm处测定各孔的OD值结果。
7
结果判定7.1试验成立条件
两个阳性对照孔的OD 450nm 值均＞1.0，且相差＜0.2；阴性对照孔OD 450nm 值均＜0.3时试验成立。
7.2结果计算Cut-off值按式（1）确定：
N P N S CO off Cut --=
-）值（ (1)
式中：
CO ——阴阳性判定临界值；
S ——样品测定孔OD 450nm 值；
P ——阳性对照孔平均OD 450nm 值；
N ——阴性对照孔平均OD 450nm 值。
7.3结果判定CO＞0.15判定为阳性；CO≤0.15判定为阴性。
8废弃物处理和防止污染的措施
实验过程中注意做好个人的安全防护工作，废弃物应做好无害化处理。