血型血清学试验技术
鉴定血型的三种方法
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鉴定血型的基本方法因不同血型而异，大致可分三类：
1、血清学方法
大部分血型使用此法验出。
根据抗原、抗体相互作用的原理，如被检细胞与某种特异性抗体起反应，说明该细胞有相应抗原;如不反应，表示无该抗原。
因此血清学方法，只能检出能产生抗体的血型抗原。
抗原抗体在体外作用的形式有许多种，故不同血型有不同的鉴定方法。
检查红细胞血型用凝集反应(包括盐水凝集试验、酶处理红细胞凝集试验、抗球蛋白凝集试 验);检查白细胞血型用细胞毒性试验;检查血小板血型用补体结合和抗球蛋白消耗试验;检查可溶性血型物质和免疫球蛋白的同种异型用凝集抑制试验;检查血清 型用免疫扩散和免疫电泳。
天然抗体(抗A 、抗B)可用已知A 、B 型红细胞检测。
2、生物化学方法
鉴定红细胞酶型和某些血清型常使用电泳技术。
由于各种蛋白质或酶蛋白分子大小不同，所带电荷有差异，可由电荷泳分离，然后经过特异性染色，显示出不同的带或线条。
根据这些带的位置和染色深浅不同，区分出各种型。
3、细胞培养方法
如果两个人的白细胞抗原(主要是HLA-D 和DP 抗原)不同，他们的淋巴细胞在混合培养时会发生增殖反应。
据此原理，使用混合淋巴细胞培养方法检查HLA-D 抗原;使用预处理淋巴细胞分型方法检查HLA-DP 抗原。
血型鉴定标准操作规程
血型鉴定标准操作规程1.目的为规范各血型系统血型鉴定的技术操作，保证鉴定结果准确及临床输血安全有效，特制定本规程。
2.适用范围适用于输血科（血库）进行各血型系统血型鉴定。
3.职责输血科（血库）技术人员负责各血型系统血型鉴定。
4.所需设备和试剂设备普通离心机，血型血清学专用离心机，普通显微镜。
试剂各血型系统单克隆血型试剂，3%-5%的A、B、O型试剂红细胞。
5.检测环境条件室温应控制在18-27℃，湿度应保持30%-70%。
6.项目及方法ABO血型鉴定ABO血型鉴定原理红细胞上具有A抗原，而血清中含有抗B抗体者为A型；红细胞上有B抗原，而血清中含有抗A抗体者为B型；红细胞上没有A和B抗原，而血清中含有抗A、B抗体者为O 型；红细胞上有A和B抗原，而血清中没有相应抗体者为AB型，见表1。
表1.试剂血清、红细胞鉴定血型（一）玻板法实验操作（1）洁静的玻板，用记号笔在正定型一侧注明抗A、抗B、抗A（B）,反定型一侧孔中注明A细胞、B细胞、O细胞。
（2）在正定型一侧孔中先加入相应试剂血清1滴,再加入待检者20%红细胞悬液1滴；在反定型一侧先加入待检者血清2滴,再加入相应20%试剂红细胞(为3-5人份的混合红细胞)1滴。
（3）摇动玻板数次,5min后观察凝集现象，判断并报告检测结果。
如有怀疑者,须做试管法对照。
（4）报告方式:通过计算机信息系统发布正式血型结果。
注意事项（1）操作者必须认真细致,严格查对,准确报告血型结果。
（2）鉴定血型时,室内温度宜在18-27℃,以免产生假阳性。
遇有可疑冷凝集时 (1)先将玻板放在日光灯处加热3-5分钟后观察 (2)将待检者红细胞用37℃生理盐水洗涤2-3次后，再做血型鉴定。
（3）抗A、抗B、抗A(B)试剂血清，效价不低于256，亲和力在15s以内出现凝集，3min 时凝块不小于1mm2，冷凝集等效价在1:4以下。
（4）应另备有一套合格的试剂的血清作对照。
（5）所有待检者的血型均应做正、反定型，防止误定血型。
新生儿溶血性疾病产前血型血清学检测标准操作规程
新生儿溶血性疾病产前血型血清学检测标准操作规程一、目的为规范新生儿溶血性疾病（HDN）产前血型血清学检测的技术操作，准确评估胎儿发生HDN 的危险程度，从而辅助临床正确的诊断和治疗。
二、适用范围输血科进行新生儿HDN产前血型血清学检测。
三、原理通过鉴定孕妇及其胎儿父亲的血型，推测胎儿可能的血型，进一步检测孕妇体内是否有针对胎儿红细胞血型抗原的抗体及其效价来评估胎儿发生HDN的危险程度。
四、步骤和方法1、检测孕妇ABO、RhD血型，红细胞不规则抗体及其丈夫ABO、RhD血型。
根据夫妇ABO 血型组合来推测母婴ABO血型是否相合：如果母婴血型配合则不需检测孕妇ABO血型IgG 抗体效价；如果母婴血型不配合（可能不配合）则需检测孕妇可能致敏胎儿红细胞的ABO 血型IgG抗体效价。
2、由于抗-A或者抗-B主要为IgM类，ABO血型不合极少发生胎儿HDN，故除有死胎史或者新生儿黄疸史的孕妇外，不需检测IgG抗-B及抗-A的效价。
3、如果孕妇为RhD阴性，丈夫RhD为阳性，孕妇不规则抗体阴性，建议孕妇以后每个月复检不规则抗体直至分娩。
4、如果孕妇不规则抗体为阳性，则需鉴定其特异性、Ig类型、37℃反应情况及其效价和丈夫红细胞是否表达对应的抗原，来评估抗体引起的HDN危险程度。
5、结果判定：效价>143有临床意义。
五、质量控制1、用于试验的试剂都在有效期内使用。
2、严格试验操作，设置阴、阳对照，结果符合预期才可判定试验结果。
六、注意事项1、HDN产前血型血清学检测结果只能为评估胎儿发生HDN的风险提供依据，并不能确定HDN 。
母婴ABO血型不合且孕妇IgG类ABO血型抗体效价在妊娠期持续升高或者检出了IgG类红细胞不规则抗体都是HDN的风险因素。
2、传统认为ABO血型系统IgG抗体效价高于64具有临床意义。
随着检测水平得的提高，其作为临床参考意义不大。
3、抗体效价与HDN的发生有一定的相关性，但是抗体效价的高低与HDN的严重程度并不完全一致，可能与IgG抗体亚类不同有关。
输血科新生儿溶血病血型血清学检查标准操作规程
输血科新生儿溶血病血型血清学检查标准操作规程1、目的：规范血液免疫学产前检查操作，确保试验过程及结果的准确性与可靠性。
2、范围：本规程适用于实验室血液免疫学产前检查试验操作。
3、职责：经授权的血型实验室试验人员负责血液免疫学产前检查试验过程及报告的发出。
4、原理孕妇和丈夫ABO血型不合（O/A、O/B、O/AB、A/B、A/AB、B/A、B/AB）时，孕妇体内的IgG抗A（B）可能会引起新生儿溶血病的发生。
本试验通过检测孕妇血清中有无IgG性质的抗A（B）抗体及其效价（应用巯基试剂破坏IgM抗体，检测IgG抗体效价）即可预测ABO系HDN发生的可能性。
应用筛选红细胞可检测孕妇血清中是否存在不规则抗体，如果存在，应用谱细胞进行抗体鉴定，确定抗体的特异性，进一步检测非ABO系新生儿溶血病。
5、所需设备、材料或试剂：37℃恒温水浴箱、细胞洗涤离心机、抗-A抗-B血型定型试剂（单克隆抗体）、抗-D RH血型定型试剂（单克隆抗体）、凝聚胺介质试剂、抗人球蛋白试剂（抗-IgG、C3d）、（A、B、O）型标准红细胞悬液（2—5%）、商品化筛选细胞、谱细胞、2—ME试剂、12×75mm试管、塑料滴管。
6、检测环境条件：温度：18—25℃；湿度：30—70%7、标本要求7.1标本接收在接收标本时，应尽可能的了解、核对、记录患者的相关资料，包括受血者姓名、年龄、性别、临床诊断、输血史、用药史、妊娠史、标本编码等；7.2检验人员收到被检者产前检查申请按照申请单内容在试管上做标记(用记号笔在试管上标明被检者姓名、性别)，保留申请记录。
7.3按照要求进行血液采集。
将采好的血液沿试管壁注入已标识的抗凝试管中，反复颠倒混匀，放入2-8℃冰箱待用。
并填写《外来标本交接记录》及相关记录。
7.4标本的种类与数量：产前检查需送夫妇血样，血样均需抗凝（EDTA抗凝），女（母）5ml，男3ml。
7.5标本的保存与处理：完成所有试验内容后，要仔细核对实验结果，发出实验报告后，将实验所用的标本原始送检管存于2-8℃冰箱内至少7天以便进行查找和核对，之后交由单位相关部门统一处理。
实验__人体ABO血型的测定
实验人体ABO血型的测定〔目的与要求〕1、学习辨别血型的方法。
2、观察红细胞凝集现象，掌握ABO血型测定的原理。
〔基本原理〕一、ABO血型系统的分型依据：1、抗原（凝集原）：存在于红细胞膜上。
抗原有两种： A、 B。
2、抗体（凝集素）：存在于血清（血浆）中。
抗体有两种：抗A、抗B。
（解释血清与血浆的区别）。
相对应的一对抗原与抗体相遇时会发生凝集反应。
正常人体内无凝集反应发生，因此可以断定：在正常人体内绝不存在相对应的一对抗原与抗体。
3、分型依据：根据红细胞膜上是否有抗原及抗原的种类划分。
分为A型、B型、AB二、判断方法：已知A型标准血清（抗B）、B型标准血清（抗A），根据是否发生凝集反应判断血型。
有以下几种情况：〔实验器材〕凹槽、一次性刺血针、消毒牙签、A型与B型标准血清、生理盐水、酒精棉球、一次性采血管、记号笔、试管架、小试管、消毒镊子。
〔方法与步骤〕1、清洗所用器材：首先用清水把要用的凹槽、小试管冲洗干净，然后用生理盐水再冲洗几遍，防止发生溶血。
这一步是保证实验成功的关键。
2、取凹槽，用记号笔作好标记。
3、在凹槽内分别加入A型与B型标准血清。
4、取小试管，向内加入生理盐水约2ml，放在试管架上备用。
5、采血：用酒精棉球消毒左手无名指指尖，另一名同学用手捏紧已消毒的手指，用一次性刺血针刺破手指取血。
注意：进针速度要快，力度适中，采血时要挤松交替。
当手指尖出现小血滴时，用一次性采血管吸取少许血液放入小试管中制成混悬液，然后再吸取混悬液分别加入A型和B型标准血清中各一滴，用牙签搅动，使每侧的血液与血清混匀。
注意每侧用一支牙签搅动，切勿混用。
6、静置，观察结果：在室温下静置10-15分钟，观察有无凝集现象发生，并判断结果。
注意：这种凝集反应的强度因人而异，如果15分钟后没有出现结果，可以再延长一段时间。
〔注意事项〕1、一定要严格消毒。
2、区别血液的凝集与凝固。
〔作业〕记录你的血型，说明你能接受和输血给何种血型的人，为什么？。
一例B(A)血型的血清学及分子生物学鉴定
ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．１０．０９㊃临床实验研究㊃一例Ｂ（Ａ）血型的血清学及分子生物学鉴定㊀㊀㊀㊀作者简介：张钰，１９９２年生，女，技师，硕士，主要从事输血免疫学研究；李炜华，１９７６年生，女，副主任技师，大学本科，主要从事血站质量管理；二者对该文具有同等贡献，同为第一作者㊂㊀㊀㊀㊀通信作者：何成涛，硕士，副主任技师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｅｃｈｅｎｇｔａｏ４１３＠１２６．ｃｏｍ㊂张钰１，李炜华２，蔡杰１，杜海林１，何晓露１，傅强１，戴宇东１，何成涛１（１．南京红十字血液中心研究室，南京２１００００；２．宿迁市中心血站质管科，宿迁２２３８００）摘要：目的㊀对１例血型血清学正反定型不符的标本进行ＡＢＯ血型鉴定㊂方法㊀运用血型血清学方法鉴定标本ＡＢＯ血型；用ＰＣＲ⁃序列特异性引物（ＳＳＰ）基因定型和ＡＢＯ基因直接测序的方法确定该标本的基因型㊂结果㊀血型血清学检测结果表现为Ｂ（Ａ）亚型的特点；ＰＣＲ⁃ＳＳＰ分型结果定为Ｂ（Ａ）０４／Ｏ１型；测序发现标本ＡＢＯ基因的第６和第７外显子存在变异：第６外显子存在２６１ｄｅｌＧ㊁２９７Ａ＞Ｇ；第７外显子存在５２６Ｃ＞Ｇ㊁６４０Ａ＞Ｇ㊁６５７Ｃ＞Ｔ㊁７０３Ｇ＞Ａ㊁７９６Ｃ＞Ａ㊁８０３Ｇ＞Ｃ㊁９３０Ｇ＞Ａ，判断该样本血型为Ｂ（Ａ）０４／Ｏ０１血型㊂结论㊀该血型血清学初步鉴定为Ｂ（Ａ）的标本用ＰＣＲ⁃ＳＳＰ法和ＡＢＯ基因直接测序法确认为Ｂ（Ａ）０４／Ｏ０１型㊂关键词：Ｂ（Ａ）；血型血清学；ＰＣＲ⁃序列特异性引物；ＤＮＡ测序中图分类号：Ｒ４４６㊀㊀㊀㊀文献标志码：Ａ㊀㊀ＡＢＯ血型系统是人类最主要的血型系统之一［１］，ＡＢＯ血型不合的输血会导致严重的输血反应及其他并发症㊂因此，ＡＢＯ血型的准确分型对于安全输血至关重要［２］㊂除了Ａ㊁Ｂ㊁ＡＢ㊁Ｏ等正常的ＡＢＯ表型外，还有一些罕见的亚型［３］㊂Ｂ（Ａ）是一种较为罕见的ＡＢＯ亚型，其可能是由于底物特异性的酶转变所导致［４］㊂其血清学的特点主要是正定型红细胞与抗Ｂ出现强凝集反应，与抗Ａ出现弱凝集反应，反定型血清能够凝集Ａ１和Ａ２细胞［５⁃６］㊂在血清学分型中，Ｂ（Ａ）常与ＣｉｓＡＢ㊁ＡｘＢ等发生混淆，分子生物学技术则可以帮助区分各种亚型㊂本研究使用血型血清学和分子生物学的方法检测了１例正反定型不符的标本，最后鉴定其为Ｂ（Ａ）０４／Ｏ０１，报道如下㊂１㊀材料与方法１．１㊀样本来源㊀２０２０年１月１９日１例自愿无偿献血的２１岁男性血液标本㊂１．２㊀试剂与仪器㊀单克隆抗Ａ㊁抗Ｂ㊁抗Ｈ㊁抗Ａ１㊁Ａ１细胞㊁Ａ２细胞㊁Ｂ细胞㊁Ｏ细胞㊁抗筛细胞（Ｏ１㊁Ｏ２㊁Ｏ３）试剂（上海血液生物医药公司），抗ＡＢ（ＲａｐｉｄＬａｂｓ公司），凝聚胺试剂盒（合肥天一生物技术研究所公司），抗人球蛋白检测卡（长春博迅生物技术公司），血液基因组ＤＮＡ提取试剂盒（德国ＱＩＡＧＥＮ公司），人类红细胞ＡＢＯ血型基因分型试剂盒（天津秀鹏公司），实验所有试剂均检验合格，按要求保存并在有效期内使用㊂免疫微柱孵育器㊁血型血清学离心机（长春博研科学仪器公司），低速全自动离心机（日本Ｋｕｂｏｔａ公司），离心机（德国ＳＩＧＭＡ公司），核酸蛋白定量检测仪（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司），基因扩增仪（美国ＡＢＩ公司），凝胶成像仪（上海复日科技公司）㊂１．３㊀方法１．３．１㊀血型血清学试验㊀参照‘全国临床检验操作规程“第４版及各试剂说明书用试管法进行血型血清学试验㊂１．３．２㊀分子生物学试验１．３．２．１㊀基因组ＤＮＡ的提取㊀采用商品试剂盒并严格按照试剂盒说明书快速提取ＤＮＡ，ＤＮＡ浓度调为３０ １００ｎｇ／μＬ，ＤＮＡ纯度Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ值为１．６ ２．０，２５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳显示无ＤＮＡ降解现象㊂１．３．２．２㊀ＰＣＲ⁃ＳＳＰ基因分型㊀严格按照人类红细胞ＡＢＯ血型基因分型试剂盒进行操作㊂按照以下循环参数进行ＰＣＲ扩增：９６ħ２ｍｉｎ，１个循环；９６ħ２０ｓ，６８ħ６０ｓ，５个循环；９６ħ２０ｓ，６５ħ４５ｓ，７２ħ３０ｓ，１０个循环；９６ħ２０ｓ，６２ħ４５ｓ，７２ħ３０ｓ，１５个循环；７２ħ３ｍｉｎ，１个循环㊂凝胶电泳：ＰＣＲ产物经２５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶㊁１４０ １５０Ｖ电泳１０ １５ｍｉｎ，凝胶成像仪拍照并观察结果㊂１．３．２．３㊀标本ＡＢＯ基因测序㊀采用直接测序法对标本ＡＢＯ血型基因１ ７外显子进行测序，由天津秀鹏公司完成㊂ＰＣＲ产物纯化：在每个反应管每孔中加入３μＬＥｘｏＳＡＰ⁃ＩＴ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅⅠ和ＳｈｒｉｍｐＡｌ⁃ｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ的混合溶液），以去除多余的ＰＣＲ㊃８５７㊃临床检验杂志２０２０年１０月第３８卷第１０期㊀ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉ，Ｏｃｔ．２０２０，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．１０引物和底物ｄＮＴＰｓ㊂低速离心混合溶液后，运行以下热循环程序：３７ħ３ｍｉｎ，８０ħ１５ｍｉｎ，１个循环㊂测序反应：纯化的ＰＣＲ产物用作测序反应ＤＮＡ模板㊂采用２０μＬ反应体系，内含：１６μＬＢｉｇＤｙｅｔｅｒ⁃ｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ提供的测序反应混合液和４μＬ经ＥｘｏＳＡＰ⁃ＩＴ处理的ＰＣＲ产物㊂测序反应扩增条件：９６ħ２０ｓ，５０ħ３０ｓ，６０ħ２ｍｉｎ，２５个循环㊂２㊀结果２．１㊀血型血清学结果㊀血型血清学反应格局见表１㊁２㊂正定型中红细胞与抗Ａ发生较弱凝集（ʃ），与抗Ｂ发生强凝集（４＋），反定型血清能够凝集Ａ１细胞（１＋）和Ａ２细胞（１＋ｗ）；血清中无不规则抗体的存在；红细胞与抗Ｈ的反应强度（３＋）接近正常的Ｏ型红细胞（３＋ｓ）而高于正常的Ｂ型红细胞（２＋）㊂表１㊀血型血清学检测反应条件ＡＢＯ正定型抗Ａ抗Ｂ抗Ａ１抗ＡＢＡＢＯ反定型Ａ１细胞Ａ２细胞Ｂ细胞Ｏ细胞自身细胞立即离心ʃ４＋０４＋１＋１＋ｗ０００多次离心ʃ４＋０４＋１＋１＋ｗ０００表２㊀抗Ｈ与Ｐ细胞㊁ＤＯ细胞㊁ＤＢ细胞反应结果反应条件抗ＨＰ细胞ＤＯ细胞ＤＢ细胞立即离心３＋３＋ｓ２＋㊀㊀注：Ｐ细胞为被检标本红细胞；ＤＯ细胞为相同采血时间５个Ｏ型献血者的混合红细胞；ＤＢ细胞为相同采血时间５个Ｂ型献血者的混合红细胞㊂２．２㊀ＰＣＲ⁃ＳＳＰ结果㊀见图１㊂第７㊁１０㊁１１㊁１２孔位呈阳性反应，其余孔位呈阴性反应㊂㊀㊀注：１ １４泳道分别为Ｃｉｓ⁃ＡＢ０１㊁Ｃｉｓ⁃ＡＢ０１／Ｂ（Ａ）０１㊁Ｂ（Ａ）０１／Ｂ（Ａ）０３㊁Ｃｉｓ⁃ＡＢ０２㊁Ｂ（Ａ）０２㊁Ｃｉｓ⁃ＡＢ０３㊁Ｂ（Ａ）０４㊁Ｂ（Ａ）０６㊁Ｃｉｓ⁃ＡＢ０４㊁Ｂ１㊁Ｂ２㊁Ｏ１㊁Ｏ２㊁阴性对照㊂图１㊀标本ＰＣＲ电泳结果２．３㊀ＡＢＯ基因测序结果㊀见图２㊁３㊂根据ＮＣＢＩ网站血型抗原基因突变数据库（以Ａ１０１为参考序列），结果发现第６外显子２６１处缺失Ｇ，２９７处出现Ａ／Ｇ突变㊂外显子７的突变有５２６Ｃ＞Ｇ㊁６４０Ａ＞Ｇ㊁６５７Ｃ＞Ｔ㊁７０３Ｇ＞Ａ㊁７９６Ｃ＞Ａ㊁８０３Ｇ＞Ｃ㊁９３０Ｇ＞Ａ㊂３㊀讨论㊀㊀Ｂ（Ａ）血型最早是１９５６年由Ｙａｍａｍｏｔｏ等［７］发现，是一种较为罕见的ＡＢＯ亚型㊂迄今为止，已发现６种Ｂ（Ａ）等位基因，分别为Ｂ（Ａ）０１㊁Ｂ（Ａ）０２㊁Ｂ（Ａ）０３㊁Ｂ（Ａ）０４㊁Ｂ（Ａ）０５㊁Ｂ（Ａ）０６，其中Ｂ（Ａ）０２和Ｂ（Ａ）０４在我国最为常见［８］㊂Ｂ（Ａ）血型的形成主要是由于Ｂ基因的特定突变，变异的Ｂ基因具有编码双功能活性酶的能力，使血清学中有正常Ｂ抗原和较弱Ａ抗原的特征，因为关键位点的突变及其引起的单个氨基酸的改变，从而改变了糖基转移酶的酶学特点和催化活性，使相同的底物被催化形成不同的产物［９］㊂本研究分析了１例正反定型不符的献血者标本，血型血清学结果发现其红细胞可以凝集抗Ａ和抗Ｂ（与抗Ｂ的凝集强度强于抗Ａ），与抗Ｈ反应的凝集强度接近Ｏ细胞而强于Ｂ细胞，反定型血清能凝集Ａ１细胞和Ａ２细胞㊂因此根据血清学的结果，我们初步判定其为Ｂ（Ａ）型㊂目前，血型血清学的检测是血型鉴定的主要方法，但是其只能对ＡＢＯ亚型进行初步定型，还需借助分子生物学的方法对ＡＢＯ亚型进行基因分型㊂因此我们使用了ＰＣＲ⁃ＳＳＰ方法进行检测，检测结果与分型表相比对，发现该样本为Ｂ（Ａ）０４／Ｏ１杂合㊂为进一步证实ＰＣＲ⁃ＳＳＰ的结果，我们对标本ＤＮＡ进行测序，ＡＢＯ基因由７个外显子和６个内含子组成，其功能区域分别位于第６外显子和第７外显子中，而ＡＢＯ等位基因和所有的亚型基因也主要分布在这个区域［１０］㊂本研究测序结果显示，第６外显子中有１个单核苷酸缺失，即２６１ｄｅｌＧ，这与Ｏ０１等位基因相一致［１１］，第７外显子存在５２６Ｃ＞Ｇ㊁６４０Ａ＞Ｇ㊁６５７Ｃ＞Ｔ㊁７０３Ｇ＞Ａ㊁７９６Ｃ＞Ａ㊁８０３Ｇ＞Ｃ㊁９３０Ｇ＞Ａ的突变，第６㊁７外显子的突变导致了５个氨基酸发生变化（Ａｒｇ１７６Ｇｌｙ㊁Ｍｅｔ２１４Ｖａｌ㊁Ｇｌｙ２３５Ｓｅｒ㊁Ｌｅｕ２６６Ｍｅｔ㊁Ｇｌｙ２６８Ａｌａ），从而形成了Ｂ（Ａ）０４等位基因㊂图２㊀外显子６测序结果图３㊀外显子７测序结果㊀㊀综上所述，本研究结合血型血清学和分子生物学的结果，判定该献血者的血型为Ｂ（Ａ）０４／Ｏ０１㊂在临床实践中，当出现正反定型不符的情况时，除进行必要的血清学检测外，可结合分子生物学的方法进一步检测，正确分析血型，避免出现误检或漏检，以确保临床输血的安全性㊂４ 参考文献［１］ＭｏｌｌｅｒＭ，ＪｏｕｄＭ，ＳｔｏｒｒｙＪＲ，ｅｔａｌ．Ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎｅ：ａｄａｔａｂａｓｅｆｏｒｉｎ⁃ｄｅｐｔｈａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｘｔｅｎｓｉｖｅｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎ３６ｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐｓｙｓｔｅｍｓｉｎｔｈｅ１０００ＧｅｎｏｍｅｓＰｒｏｊｅｃｔ［Ｊ］．ＢｌｏｏｄＡｄｖ，２０１６，１（３）：２４０⁃２４９．［２］ＪｉａｏＬＸ，ＹｕＪＨ，ＹｕＸＬ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｗｏｃａｓｅｓｗｉｔｈＣｉｓ⁃ＡＢ／Ｂｂｌｏｏｄｓｕｂｇｒｏｕｐ［Ｊ］．ＴｒａｎｓｆｕｓＡｐｈｅｒＳｃｉ，２０１７，５６（２）：２２３⁃２２５．［３］ＮａｉｒＲ，ＧｏｇｒｉＨ，ＫｕｌｋａｒｎｉＳ，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｒａｒｅｓｕｂｇｒｏｕｐｏｆａｐｈｅｎｏｔｙｐｅｗｈｉｌｅｒｅｓｏｌｖｉｎｇＡＢＯｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙ［Ｊ］．ＡｓｉａｎＪＴｒａｎｓｆｕｓＳｃｉ，２０１９，１３（２）：１２９⁃１３１．［４］郭忠慧，向东，朱自严，等．中国汉族人群检出新的Ｂ（Ａ）６４１Ｔ＞Ｃ等位基因［Ｊ］．中国输血杂志，２００６，１９（１）：１７⁃２０．［５］ＪａｉｎＡ，ＧｕｐｔａＡ，ＭａｌｈｏｔｒａＳ，ｅｔａｌ．ＡｎＡＢＯｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐｉｎｇｄｉｓ⁃ｃｒｅｐａｎｃｙ：ＰｒｏｂａｂｌｅＢ（Ａ）ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ［Ｊ］．ＴｒａｎｓｆｕｓＡｐｈｅｒＳｃｉ，２０１７，５６（３）：４５９⁃４６０．［６］熊莉，周小英，吴红，等．罕见Ｂ（Ａ）血型的鉴定［Ｊ］．临床检验杂志，２０１８，３６（６）：４２６⁃４２８．［７］ＹａｍａｍｏｔｏＦ，ＭｃＮｅｉｌｌＰＤ，ＹａｍａｍｏｔｏＭ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃａ⁃ｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＡＢＯｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＶｏｘＳａｎｇ，１９９３，６４（３）：１７５⁃１７８．［８］刘乐霞，梁俊杰，肖玮，等．罕见Ｂ（Ａ）０４血型家系遗传规律调查［Ｊ］．临床输血与检验，２０１４，１６（２）：１７３⁃１７５．［９］ＧｕｏＺＨ，ＸｉａｎｇＤ，ＺｈｕＺＹ，ｅｔａｌ．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃ⁃ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＢ（Ａ）ｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐｉｎｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００７，２３（２）：６９⁃７４．［１０］宋艳艳，周雪莹，欧阳旭，等．Ｂ（Ａ）０２亚型分子生物学鉴定１例［Ｊ］．临床输血与检验，２０１６，１８（４）：３３８⁃３４０．［１１］ＤｅｎｇＺＨ，ＹｕＱ，ＬｉａｎｇＹＬ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌＢ（Ａ）ａｌｌｅｌｅｗｉｔｈＢＢＢＡｔｙｐｅａｔｔｈｅＡＢＯｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐ［Ｊ］．ＪＨｕｍＧｅｎｅｔ，２００６，５１（８）：７３２⁃７３６．（收稿日期：２０２０⁃０７⁃２９）（本文编辑：王海燕）。
红细胞血型血清学技术
2．红细胞标本 一般试验用的在4℃冰箱保存下的凝血标本 要在5天内使用，以不溶血为准。 ACD保存液或其它特制的保存液可保存红细 胞3周。 盐水配制的红细胞悬液只能当天使用，不 宜保存。 应注意的问题： 用作交叉配血的供血者、病人标本（血清、 细胞）要放4℃冰箱保存1周，以便在出 现输血反应时可备查。 各种保存的红细胞在使用前都要用盐 水洗一次以上。
红细胞血型血清学技术
标本 盐水介质凝集试验 酶处理细胞的凝集试验 抗球蛋白试验 聚凝胺的应用
标本
（一）标本采集 1．红细胞标本
采集方法：
针刺耳垂或指尖，直接用生理盐水配成红 细胞悬液待用。 静脉采血，用抗凝剂（ACD、CPD、Na-EDTA 等）抗凝。 直接从血凝块（血柱）中洗脱游离的红细 胞。
盐水介质凝集试验
原 理
盐水介质中红细胞上的抗原决定簇与 相应抗体分子上的抗原结合部位结合，交 叉连结形成肉眼可见的凝集块。
★用 途：
盐水介质凝集试验用于IgM抗体 的检出、鉴定、盐水配血试验。 盐水抗体鉴定的血型抗原，如 ABO、MN、P等血型系统的抗原。
例外情况：
在盐水介质中，凝集是IgM抗体的行 为。ABO血型系统中的A、B抗原位点多， 当IgG抗A、抗B的浓度足够大时，在盐水 介质里也能与相应的红细胞发生凝集反 应。
★缗钱状凝集的解决方法：
实验中遇到缗钱状凝集时，可将血清适当稀释 后进行实验。 在显微镜下观察到缗钱状凝集时，加1滴生理 盐水到反应物并混匀，通常可以消除这种假凝 集。 做试管法实验时如发现缗钱状凝集，可将试管 离心，去上清液，沥干，再加2滴生理盐水重 新悬浮红细胞观察结果（这种方法称为盐水置 换法），假凝集会消失，真凝集不 会消失， 严重的可重复一次。 缗钱状形成不影响间接抗球蛋白试验。
输血实验室血型血清学质量控制
输血实验室血型血清学质量控制随着输血医学的发展，输血安全问题已日益受到各方面的高度关注，通常输血有两方面：其一是经血液传播疾病问题，其二是实验室血型血清方面的问题。
而血型血清学方面的的检测是非常重要的，它是安全输血的根本保证。
下面就血型血清学实验室质量控制有关问题作一探讨。
一、血型血清学实验室目标输血的原则是安全、有效、及时，其中安全最为重要，这就要求在实验室作出的结果必须正确无误，否则将引起严重后果。
输血过程中可能出现各式各样的疑难问题。
它们存在于供血者的检查、血液采集、血型鉴定、抗体检出和鉴定、交叉配血试验、输血和成份措施、成份单采和置换、输血反应、输血传染病，各类自身抗体检出、新生儿溶血性贫血、新生儿血小板减少性紫癜、亲子鉴定、骨髓移植等等。
有理论、技术上的问题，也有责任心的问题。
正确的结果是输血的安全保证。
血型血清学实验室质量控制室内质控（IQC）、室间质控（EQA）。
二、室内质控1、样本：准确无误的标本是输血工作最关键的一步，这就要求临床在采集样本时严格遵守查对制度，每次只能采集一个人的样本，样本的交接应双方鉴收，样本用完后最少保留在规定的时间内。
2、人员：一个人的能力有大小，但在输血工作中出现问题最多的是责任性差错事故。
人是关键。
血库应选责任心强、经验丰富的同志，在核对时应细心、认真、负责（凝集的判断有无、强弱、真假），正确的判读结果报告是输血工作的关键。
3、技术方法：精湛的技术是输血工作的保证。
开展的项目应齐全，血型鉴定（低板、96孔板、试管法）、交叉配血试验（盐水、PEG、凝聚胺IAT）、抗体筛选和鉴定、产前检查、HDN、服效药等等试验。
4、试剂：试剂是输血安全的根本。
试剂必须是通过国家批批检、认可的试剂，一般情况下应是在有效期内，外观无污染、无沉淀、无溶血、无凝块，特异性、亲和力、效价在规定的范围内。
常用试剂备用有：（1）、试剂抗血清：抗-A、-AI、-B、-AB、-H、-D、-C、-c、-E、-e、抗-IgG+C3等等。
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IgБайду номын сангаас型抗体
• 血液中最主要的免疫球蛋白。 • 以单体形式存在，与红细胞上相应抗原结
合后，通常不能形成肉眼可见的凝集。 • 能通过胎盘。
盐水介质试验技术
• 在盐水介质中，IgM类抗体可直接与含有相 应抗原的红细胞结合，形成肉眼可见的凝 集。
• 通常用于血型的鉴定。 • 玻片法、试管法、微孔板法。
后，自身冷抗体发生作用，激活补体，补体成 分结合在红细胞上，用多特异性抗球蛋白试剂 发生假阳性。
• 离心过度，红细胞压积过紧，不易充分摇散。
• 致敏后的红细胞洗涤不充分,残留的球蛋白中和了 试剂中的抗球蛋白，造成假阴性。
• 操作过程不连续，时间过长，结合在红细胞上的 抗体解离。
• 红细胞、血清和抗球蛋白试剂保存不当都可能发 生活性减弱或丧失。
胶柱，柱的上端有一个加样反应室。抗原 抗体反应后离心，凝胶柱起过筛作用，红 细胞凝集块不能通过凝胶的间隙留在凝胶 的上断，未凝集的红细胞通过凝胶的间隙， 沉积到底部。
吸收放散试验
• 红细胞上的抗原可吸收血清中的相应抗体，在 适当条件下发生凝集或致敏，观察吸收前后抗 体效价可证明红细胞上有无相应的抗原及其强 度。
+ + + 凝聚胺
+
+
- - - - - 枸橼酸纳- - - - -
无凝集
有凝集反应
注意事项
• 不能使用含柠檬酸钠和肝素抗凝的标本。 • 严格按照试剂说明书操作。 • 凝聚胺只能使正常红细胞发生凝集，对缺
乏唾液酸的细胞（T及Tn细胞）无作用。 • 对Kell系统不敏感。
5.凝胶技术
• 原理 • 凝胶技术是用特定的化学物质做成微型凝
DAT 意义
• DAT阳性可以是体外形成，也可以是体内形 成，以体内为主。
• 单抗-C3d阳性 • 自身抗体 • 同种抗体 • 药物抗体
• 用于测定在体外能引起红细胞致敏的抗体 • 用IgG抗体试剂测定红细胞血型，如Rh阴性
确证试验。
• 交叉配血。
• 假阳性 • 1.用免疫兔或羊制备的抗球蛋白含有种间抗体。 • 2.红细胞在用盐水洗涤时已有凝集 • 3.IAT试验中所用红细胞本身直抗阳性 • 4.不抗凝标本在冷环境里经过一段时间的保存
• 抗原抗体反应具有可逆性，改变某些物理条件， 抗体可以从红细胞上放散出来，通过检测放散 出来的抗体，以诊断抗体的种类和性质。也可 用于检测吸收抗体的红细胞抗原。
• 将血清适当稀释。
2.酶处理细胞的凝集实验
• 原理：红细胞表面有丰富的唾液酸，带有负电荷，是红
细胞相互排斥的原理。蛋白水解酶能消化破坏这种唾液酸， 减少红细胞表面的负电荷以及红细胞之间的排斥力，缩短 了红细胞之间的距离，使IgG分子能与有相应抗原的红细 胞产生凝集。 • 常用的酶：菠萝酶、木瓜酶、胰酶、无花果酶 • 酶法能显著增强Rh和Kidd系统的抗原抗体反应，但蛋白酶 能破坏M、N、S、s、Fya和Fyb抗原，对它们不能用酶处理 的方法。
• 优点：可以增强一些抗原抗体系统的反应 活性，Rh和Kidd系统最明显。
• 缺点： • 会破坏一些抗原的结构（M、N、Fya、Fyb） • 酶液批次不同，都需标化最适孵育时间 • 操作繁复，少数人对酶液过敏。
• 抗球蛋白试验是1945年由Coombs等人建立 的，又称Coombs试验。抗球蛋白试验的建 立在血型血清学上有着非常重要的意义
盐水介质试验技术
• 观察结果后立即记录试验结果。 • 溶血和凝集都是阳性结果，要先观察溶血，
再观察凝集。 • 注意血液抗凝不好形成血凝块的影响。 • 严格按试剂说明书操作。 • 注意温度对试验的影响。
试验记录
• 4+（++++）：一个大凝集块，背景透明，无游离细胞 • 3+（+++）：数个一个大凝集块，背景透明，无游离细
血型血清学试验技术
四川大学华西医院输血科 黄春妍
常见血型抗体类型
• IgM型抗体。 • 五聚体，五个单体之间由J链链接，巯基试
剂（DTT、2-ME）可破坏J链，从而破坏IgM 型抗体。与红细胞上相应抗原结合后，能 形成肉眼可见的凝集。
• 主要存在于ABO、MN、P1和Lewis系统中。 • 不能通过胎盘。
• 分为直接抗球蛋白试验（DAT）和间接抗球 蛋白试验
• IgG类血型抗体（主要是免疫抗体，如Rh血型 抗体）分子量小，与红细胞相应抗原结合后， 在盐水介质中不出现肉眼可见的凝集反应， 称之为不完全抗体，但在加入抗-IgG后，以其 搭桥则可出现凝集反应。
• 人补体成分在人体内被红细胞抗原抗体复合 物激活以后，结合在红细胞表面，在体外含 补体的多克隆抗体，或抗C3b、抗C3d等单特 异性抗体与补体致敏的红细胞反应，使之凝 集也称为抗球蛋白试验。
• 多特异性抗球蛋白试剂：应含有抗IgG和抗C3d
• 单特异性抗球蛋白试剂：抗IgG、抗IgM、 抗IgA、抗C3、C4的片段。
• DAT是用来检测红细胞是否已经被抗 体或补体致敏。
• 用于： • HDN和自身免疫溶血性贫血的诊断 • 红细胞被药物抗体致敏的检查 • 急性和迟发性溶血性输血反应的检查
• 红细胞过多，反应减弱，红细胞过少，看结果不 准确，都影响结果。
• 试剂中抗球蛋白浓度过大，有前带现象 • 孵育时间和温度不当，会使反应结果减弱或变为
假阴性。
4.凝聚胺法
• 原理
凝聚胺是一种多价阳离子聚合物，在溶液中有多个阳 离子基团，能中和红细胞表面的负电荷，并籍助正负 电荷的作用，引起红细胞的非特异性凝聚，这种凝聚 是非特异性的。 当红细胞与血清在低离子介质中孵育，IgG抗体与红细 胞上相应的抗原结合后在凝聚胺的作用下发生凝集， 凝集和凝聚在表面上不能区分，再加入枸橼酸钠重悬 液，枸橼酸根的负电荷与凝聚胺上的正电荷中和，凝 聚现象消失，而真正的凝集不消失
胞
• 2+（++）：许多小凝集块，背景基本透明，有游离细 胞
• 1+（+）：很小的凝集块，背景浑浊，要用显微镜观察 • 0（-）：无凝集，无溶血，全是游离细胞 • PH：部分溶血 • H：完全溶血
缗钱状凝集
• 也称串钱状凝集，是一种假凝集，红细胞 象许多钱币堆积在一起。
• 血浆球蛋白异常，如高球蛋白血症、巨球 蛋白血症。使用大分子右旋糖酐或羟乙基 淀粉扩容。