抗体筛选和鉴定
抗体筛选操作步骤
红细胞血型抗体筛选、鉴定操作规程(SOP)目的:规范红细胞血型抗体筛选、鉴定操作，保证临床用血的安全性及有效性。
职责: 输血科技术人员负责红细胞血型抗体筛选、鉴定。
适用范围: 适用于输血科抗体筛选血标本、疑难血型标本及疑难配血标本。
所需材料和设备:抗球蛋白试剂、筛选细胞、谱细胞、患者血标本、生理盐水、小试管、滴管、普通离心机、血型血清学专用离心机、电热恒温水浴箱、显微镜。
抗体筛选操作步骤1.取试管三支，分别标记Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；各加入患者血清2滴，再分别加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号筛选细胞2滴。
2.混匀，37ºC孵育1h。
离心15s。
4.轻轻悬浮细胞，肉眼观察凝集结果并记录。
若肉眼不见凝集，以显微镜检查。
5.对没有凝集的试管，用盐水充分洗涤3次。
6.最后一次洗涤后，离心去上清，将试管边缘盐水用滤纸吸干。
7.按试剂说明书加最适稀释度抗球蛋白试剂1滴，充分混合。
离心15s。
轻轻悬浮细胞，肉眼观察凝集反应，记录结果。
抗体鉴定操作步骤1.抗体筛选阳性，应作抗体鉴定试验已确定其特异性。
2依据谱细胞数量的多少(一般由8—16个单人份的已知血型表型的0型红细胞组成)取相应数目的试管，分别标记序号，各加入患者血清2滴，再分别加入谱细胞2滴。
3.混匀，37ºC孵育1h。
离心15s。
5.轻轻悬浮细胞，肉眼观察凝集结果并记录。
若肉眼不见凝集，以显微镜检查。
6.对没有凝集的试管，用盐水充分洗涤3次。
7.最后一次洗涤后，离心去上清，将试管边缘盐水用滤纸吸干。
8.按试剂说明书加最适稀释度球蛋白试剂1滴，充分混合。
离心15s。
轻轻悬浮细胞，肉眼观察凝集反应，记录结果。
凝胶凝集技术筛选和鉴定抗体
凝胶凝集技术
1 原理
在微柱凝胶试验中，用特制的微柱代替普通试管，微柱内注入葡聚糖、蛋白G或玻璃微珠等物质，并可在这些物质上预先分别结合上抗球蛋白抗体。
由于凝胶颗粒具有分子筛作用，抗原抗体反应后的红细胞通过离心经过微柱，无IgG结合的红细胞穿过凝胶到达底部，而红细胞上若有IgG抗体结合则会被凝胶中的抗IgG拉住，红细胞被阻止在凝胶柱上层或中间。
2 标本与试剂
2.1 如果待测的血清和血浆是冰冻保存的，血样在使用前需离心，确保没有颗粒物质；2.2 挑选抗IgG凝胶卡：检查每1个凝胶卡是否干涸是否完整，做好试验标记，若是抗体筛选可选择2～3个微量管，抗体鉴定则需与多个微量管(根据试剂红细胞谱的细胞品种选择微量管数，并注意留有自身与阳性对照)；
2.3 使用适用于微柱凝胶的试剂红细胞组，或参照试剂的要求制备红细胞悬液。
通常配制0.8%红细胞悬液。
3 方法
3.1 揭开凝胶卡的铝封,在不同的微量管中，根据试剂使用说明书的要求分别加入一定量的(通常50μl)不同的筛选或鉴定试剂红细胞；
3.2 根据试剂使用说明书的要求在这些微量管中加入一定量的(通常25μl)血清或血浆；
3.3 将凝胶卡置37℃凝胶孵育箱15分钟；用凝胶试验离心机，离心观察结果。
4 结果判读与解释
4.1 细胞完全沉积在微量管底部为阴性结果；
4.2 所有细胞仍留在微量管顶部为强阳性结果；
4.3 凝集的强弱判断请参见图。
凝胶检测反应级数图。
三聚氰胺人源scFv抗体筛选与鉴定
ｃｏ ｅ ， ｓｎ ｎ ｙ ｑｉｋ ｄｉ ｌｎ ｓ ｕ ｉｇｅｚ ｍｅ ｎ ｅ ｍｍｕ ｏ ｏ ｂ ｎ ｓａ ｔ ｏ （ Ｓ ，ｃｏ ｓｒａ ｔ ｅａ ｄｃ ｍｐ ｔｔ ｅｉ ｉｉｏ ｘ ｅ ｉ ｎ ｓ ｎ ｓ ｒ ｅ ｔａ ｓｙｍｅｈ ｄ ＥＩ Ａ） ｒｓ—ｅ ｃｉ ｎ ｏ ｅｉｉ ｈｂｔ ｎｅ ｐ ｒｍｅ ｔ ， Ｉ ｖ ｖ ｎ ｉ
关键 词 ： 体 ； 菌体表 面展 示技 术 ； 抗 噬 三聚氰 胺 中图分 类号 ： ３ ２ １ 文献 标 志码 ： 文 章编号 ：６ １７ １ （ ０ ２ ０ —１ —４ Ｒ ９． １ Ａ １ ７ —４ ４ ２ １ ） ３０ ００
ｄ ｉ１ ． ９ ９ｊ ｉ ｎ １ ７— ４ ４ ２ １ ． ３ ０ ３ ｏ ： ０ ３ ６ ／． ｓ ． ６ １ ７ １ ． ０ ２ ０ ． ０ ｓ
康体生命纳米抗体制备及验证方法
纳米抗体制备及验证方法抗体是由免疫B细胞受到抗原刺激产生的能够特异性的和抗原结合的生物蛋白质分子。
由于其能够高特异性，高亲和的结合抗原，抗体广泛应用在学术研究、疾病诊断以及医学药物各个方面。
传统抗体和纳米抗体的区别:传统抗体分子(IgG)是一种结构相当保守的由两条相同的重链和两条相同的轻链组成的蛋白分子。
抗体的轻链包含1个VL区和1个CL区，而重链则拥有1个VH区和3个CH 区(CH1、CH2和CH3)。
VH区和VL区共同组成传统抗体识别抗原的最小单位，抗体可变区的序列差异决定了抗体能够特异地识别不同的抗原。
而CL区和CH区则相对保守，被称为抗体的恒定区，其中CH区的CH2和CH3两个区域对于抗体招募免疫细胞发挥ADCC和CDC功能有着重要的作用。
重链抗体为驼类和软骨鱼类中天然存在的除传统抗体之外的仅由两条重链组成的特殊抗体，只包含一个重链可变区（VHH, Variable Domain of Heavy Chain Antibody）和两个常规的CH2与CH3区，CH1区缺失。
重链抗体通过重链上的一个可变区（VHH）结合抗原，该可变区可以单独稳定地在体外存在，被称为驼类单域抗体(SdAb)或者纳米抗体（nanobody）。
纳米抗体晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量仅为传统完整抗体的1/10（约15kD）但依然具有完整的抗原识别能力，一般通过噬菌体筛选得到VHH序列。
得益于纳米抗体微小的结构、完整的抗原识别能力以及噬菌体筛选技术，可以获得VHH完整序列，纳米抗体可以通过体外重组表达进行大量生产，有效避免传统抗体的批次间差异问题。
纳米抗体相对传统抗体的优势：和传统抗体相比，纳米抗体分子量小，结构简单。
而得益于分子量小的优势，纳米抗体更进一步具有多个特征，使得纳米抗体在新药物发现方面表现出巨大的潜力：（1）和靶点结合特异性更强，可以结合传统抗体结合不到的的位点；（2）更高的组织穿透力；（3）更高的稳定性如耐高温；（4）适合工业化大规模生产；（5）更容易改造和优化；（6）更容易人源化由于纳米抗体的这些特征，越来越多的研究机构和药物生产企业在不同的场景中关注、尝试使用纳米抗体。
EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选
分类号：单位代码：10019密级：学号：TS040322硕士学位论文EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选与鉴定研究Screening and Characterization of Monoclonal Antibody Specific to EV71 Virus研究生：李静指导教师：王宾教授申请学位门类级别：理学硕士专业名称：生理学研究方向：分子免疫学所在学院：生物学院二零零九年六月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要手足口病（Hand foot mouth disease， HFMD）是由多种肠道病毒引起的一种常见急性传染病，多发生于5岁以下的婴幼儿，可引起发热和手足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症。
该病是全球性传染病，传染性强，易引起暴发或流行。
1997年以来，肠道病毒71型（Enterovirus 71， EV71）感染为主的手足口病在马来西亚、台湾、新加坡等地大规模爆发流行，引起世界各国关注和警惕。
EV71病毒为小RNA病毒科、肠道病毒属，分为A、B、C三基因型；VP1作为主要的衣壳蛋白，具有最多的型特异性中和位点，是主要的病毒中和决定因子，直接决定病毒的抗原性。
医院间接抗人球蛋白试验(IAT)标准操作规程
间接抗人球蛋白试验（IAT）标准操作规程
1.目的用于检测红细胞在体外是否被致敏
2.适用范围常用于交叉配血、血型鉴定、抗体筛选和鉴定。
3.所需仪器和材料离心机、水浴箱、抗球蛋白试剂等。
4.执行标准《临床检验操作规程》。
5.原理红细胞在体外与相应的抗体和(或)补体致敏后，将抗人球蛋白血清加入已致敏的红细胞盐水悬液中，红细胞表面被结合的抗体球蛋白与抗球蛋白试剂发生特异性反应，使红细胞发生凝集而判断出红细胞表面是否含有被致敏的抗体或补体。
6.操作程序
⑴取小试管2支，分别标明主侧和次侧，主侧管加受血者血清0.1ml 和供血者5%红细胞悬液0.1ml，次侧管加供血者血清0.1ml和受血者5%红细胞悬液0.1ml.
⑵混匀后，置37℃孵育45-60分钟（致敏），取出后，两管用生理盐水洗涤红细胞3-4次，每次离心后倾干上清液。
⑶加最适稀释度抗球蛋白血清1滴，混匀，1000r/min,离心1分钟，观察结果。
⑷阳性对照:2%抗-D抗体致敏的Rh阳性红细胞悬液0.05ml加抗球蛋白血清0.05ml,阴性对照：5% O型红细胞悬液0.05ml加抗球蛋白血清0.05ml,盐水对照（2管）:供血者5%红细胞盐水悬液0.05ml 加等渗0.05ml；受血者5%红细胞盐水悬液0.05ml加等渗盐水
0.05ml.
⑸结果判断：阳性对照管凝集，阴性、盐水对照管不凝集，主侧、次侧配血管都不凝集也无溶血，表示无输血禁忌，可以输血。
主、次测有一测有凝集或溶血，表示有输血禁忌，不能输血。
7.注意事项配血标本必须用EDTA抗凝，避免血液离体后被补体致敏导致假阳性；孵育后受血者和献血者的红细胞应用足量生理盐水洗
涤3-4次，每次倾倒盐水应沥干。
抗体库的构建过程
抗体库的构建过程1. 引言抗体库（antibody library）是一种用于存储和筛选抗体的资源库。
通过构建抗体库，研究人员可以收集并保留大量的抗体样本，以便在需要时进行筛选和鉴定。
本文将详细介绍构建抗体库的过程，包括样本采集、抗体生产、抗体纯化和抗体标记等关键步骤。
2. 样本采集样本采集是构建抗体库的第一步，其目的是收集来源广泛、种类丰富的抗体样本。
常用的样本来源包括动物、人体和细胞培养物等。
2.1 动物样本采集动物样本采集是最常见的样本来源之一。
常用的动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
采集动物样本时，需要注意以下几点：1.选择健康的动物，确保其免疫系统正常；2.选择合适的采集方式，如血液采集、脾脏切片等；3.根据实验需要，选择不同时间点的样本，以获得不同抗体的变化情况。
2.2 人体样本采集人体样本采集是研究人员获取人体抗体的重要途径。
常用的人体样本包括血液、血清和组织等。
在采集人体样本时，需要遵守伦理法规，并征得被试者的知情同意。
2.3 细胞培养物样本采集细胞培养物可用于获得特定抗体。
在样本采集过程中，需要注意以下几点：1.选择适当的细胞类型，确保其具有抗体的表达能力；2.采用合适的培养条件，如温度、培养基组成等；3.选择合适的收获时间点，以获得丰富的抗体产量。
3. 抗体生产抗体生产是构建抗体库的关键步骤之一。
抗体可以通过多种方法进行生产，包括动物免疫、细胞培养和重组技术等。
3.1 动物免疫法动物免疫法是最传统的抗体生产方法之一。
它通过将目标抗原注射到动物体内，刺激其免疫系统产生相应的抗体。
具体步骤如下：1.选择适当的动物，如兔子、小鼠等；2.设计合适的免疫方案，包括抗原的剂量、注射次数等；3.在免疫完成后，采集动物血液，获得免疫血清。
3.2 细胞培养法细胞培养法是一种常用的抗体生产方法。
通过将抗原加入细胞培养物中，刺激细胞产生抗体。
具体步骤如下：1.选择适当的细胞类型，如B细胞、淋巴细胞等；2.将抗原加入细胞培养物中，培养一定时间以促进抗体产生；3.收集培养物，分离和纯化抗体。
不规则抗体筛选和鉴定标准操作规程
不规则抗体筛选和鉴定标准操作规程1.检验目的不规则抗体筛选和鉴定可在交叉配合之前进行或一起进行,这样有利于患者抗体的早期确认及鉴定，发现临床上有意义的抗体，避免一些可能的情况而造成病情的延误。
2.检验方法分盐水介质法、抗球蛋白法和微柱凝胶法。
3.检验原理让待检者的血清与已知血型的试剂红细胞即筛选红细胞(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套）起反应,以发现在37℃中有反应活性的抗体。
这种抗体可引起新生儿溶血病、溶血性输血反应、或使输入的红细胞存活期缩短等.当不规则抗体筛选试验阳性后，再进行不规则抗体鉴定，即利用谱红细胞（11套鉴定细胞）与待检者的血清反应，根据反应结果判断机体所产生的同种抗体类别。
4.标本要求受检者不抗凝静脉血4.0ml，分离血清,48小时内使用5。
试剂5。
1.筛选红细胞：由2或3人份的O型红细胞组成为一套试剂，每套试剂筛选红细胞中至少有以下常见的抗原：D、C、E、c、e、M、N、S、s、P、Le a、Le b、K、k、Fy a、Fy b、Jk a、Jk b等。
每次用3套试剂（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）进行抗体筛选,见表1005—1。
5.2.鉴定谱细胞：除包括常见的抗原以外还有：C w、Kp a、Kp b、Js a、Js b、Lu a、Lu b、Xr/min a等。
每次用11套试剂进行抗体鉴定，见表1005—2。
5。
3。
抗球蛋白试剂：多特异性抗球蛋白血清（IgG、C3d）。
5.4。
致敏红细胞（质控细胞）。
5。
5。
0.9％生理盐水。
5.6。
Coombs微柱凝胶卡。
6.器材试管、吸管、37℃水浴箱、台式离心机、滤纸、微量加样器等。
7。
操作程序7。
1。
盐水介质法7.1。
1．取受检者血清2滴于标记有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的3支小试管中。
7。
1。
2．对应加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套2％~5%筛选红细胞生理盐水悬液1滴，37℃孵育30分钟。
7。
1.3。
以3000r/min离心10秒，观察凝集和溶血情况，并记录反应情况于表1005—1中。
如果抗体筛选试验阳性，继续做以下试验。
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输血前检查的主要程序
患者的病史和标本等的检查核对及处理 ABO和Rh(D)定型 抗体筛选和鉴定 交叉配血试验 已配合血液的标签与发出
一、 病人的病史和标本等的检查核对及处理
1．病史资料和信息 输血前检查强调输血科 (血库)工作人员应仔细 阅读输血申请单 。 检查前应尽可能了解，核对病人的有关资料， 包括病人的姓名，年龄，床号、住院号及唯一 性标识码，性别，种族，临床诊断，输血史， 药物史，妊娠史。 凡资料填写不全的输血申请单要退回临床科室 补充，不得迁就，也不能通过电话修改。
一、 病人的病史和标本等的检查核对及处理
2．标本的要求: 标本必须有正确的标签。如果标本标签上的内 容与血液申请单上的内容不一致或对病人身份 确认有疑问的话，必须重抽一份新的血液标本， 任何人不得对错误的标前检查的各项试验必须使用3天内采集的血 标本，反复输血的患者更应注意抽取新的标本 作配血试验，避免因回忆反应而产生的抗体漏 检。 输血后所有的标本均应妥善保存于2~8℃冰箱 中，至少一周。
三、抗体筛选和鉴定
目的是发现有临床意义的不规则抗体，献血者血 清最好也作不规则抗体筛选，如发现有不规则抗 体就将它排除，不可用于输血，特别是大量输血 时，为了避免输入血液相互间的反应，对献血者 进行抗体筛选具有重大价值。
三、抗体筛选和鉴定
抗体筛选试验意义：欧美等发达国家的血库已将 抗体筛选试验列为输血前检验的常规项目，在交 叉配血试验前完成或同时进行。当抗体筛选试验 为阴性，且以往的记录未检出有临床意义的抗体 时，可用盐水法快速配血，确认ABO血型相容即 可输血。如抗体筛选试验阳性，应进一步作抗体 鉴定，根据所鉴定出的抗体特异性事先选择缺乏 对应抗原的献血者血液配血，以缩短寻找合适血 源及配血时间。
一、 病人的病史和标本等的检查核对及处理 1．病史资料和信息 如果病人以前有过试验，则要注意核查病人以前 检查的血清学试验记录及以往输血反应的记录等。 把以前的ABO、Rh血型和抗体检测的解释同现在 的解释及任何异常情况的解答进行比较。 如既往曾经检出某种血型抗体，即使目前该抗体 检测阴性，也应选择无相关抗原的血液输注。
配血试验的内容包括：
（1）病人血清对供者红细胞 检测对供者红细胞起 反应的抗体，一般称为“主侧”配血。 （2）病人红细胞对供者血清 检测对受者红细胞起 反应的抗体，一般称为“次侧”配血。 （3）病人血清对病人红细胞 称为“自身对照” 试验。目的是显示或排除自身抗体，直接抗球蛋 白试验阳性及红细胞串钱状假阳性的存在。
4．患者当前检出或既往曾检出某种血型特异性 抗体，则需选择该抗体对应抗原阴性的血液配 血，例如：患者检出抗E，则需选择ABO血型 与患者同型或相容且Rh血型E抗原阴性之血液 配血。 又例如：患者既往曾检出有抗Jka抗体，尽 管随着时间的延长该抗体水平下降，当前已不 能检出该抗体，但为患者选择血液时仍需选择 ABO血型与患者同型或相容且Kidd血型Jka抗原 阴性之血液配血，只有这样才能避免因回忆反 应产生的抗Jka导致迟发性溶血性输血反应。
交叉配血的主要作用
（1）大多数情况下能证实献血者的红细胞与 病人的ABO血型是配合的。 （2）能检查出存在于病人血清中的针对献血 者红细胞的大多数抗体。 （3）有无工作上的差错事故（如认错病人， 拿错血袋等）。
交叉配血的作用仍有许多局限性，还不能 解决如下几个问题： （1）保证输入的红细胞有正常存活率。 （2）防止病人的免疫作用。 （3）从病人的血清中检出所有红细胞抗体。 （4）防止由于针对献血者抗原而发生的记忆性抗体 应答引起的迟延性溶血性反应。病人以前就有此 种抗体但未能查出这种免疫作用。
患者用血选择
用血申请单一定要注明输血的理由， 以便血库技术人员能选择最合适的血液进行 配合性试验，患者输注的血液必须认真地加 以选择，以适应每个不同患者的要求（原则 是ABO、Rh(D)同型或相容性输血）。按照 库存血“先入先出”的管理原则，一般来说， 首先用较陈的血，但有以下情况属于例外：
1．患者接受大量的血液（超过其自身的总血量） 需要供给最新鲜的血液。 2．患者本身血容量小，但又需接受大量的血液， 如新生儿换血或任何不到5岁的患者输血，都 应当给予尽量新鲜的血液。 3．超过5岁的患者为了纠正贫血要求输血，可以 给予浓缩红细胞。接受定期输血的患者，如镰 状细胞性贫血、地中海贫血等患者，需选择不 超过7天的相对新鲜的血液，这样做会使输血 间隔期延长一些。
二、ABO和Rh(D)定型
各血型系中，以A、B抗原性最强，Rh（D） 抗原次之，当受者接受了所缺少的A、B抗 原后，几乎每个人都 会产生特异性同种 抗体。 大约有2/3的Rh(D)阴性的人，接受Rh(D) 阳性血液后可产生抗D抗体。 经 一次 妊娠Rh(+)的胎儿后，大约7%的 Rh(-)妇女在6个月内血清学可测到抗D。
输血前实验室检查与质量控制
广州血液中心临床输血研究所 罗广平
输血前检查的目的
选择用于患者的血液或血液制品，使 输入的成分能在受者体内有效存活，无不 良反应。要求输入的红细胞在受者体内必 须不凝集和不溶血，输入的血浆不导致患 者自身红细胞显著破坏。
输血前的血型血清学试验包括:
ABO血型正反定型 Rh（D）定型 抗体筛检和鉴定 交叉配合试验
三、抗体筛选和鉴定
常使的试验方法有盐水介质试验法、低离 子强度介质法（LISS）、酶技术、抗球蛋 白试验、Polybrene及其改良法、微柱凝胶 技术等等，可按抗体的血清学行为和试验 的具体条件选择，但必须做抗球蛋白试验 确证。
四、交叉配血试验
交叉配血试验也称配合性试验，实际上是 检查不配合性，使病人，献血者血液之间 没有可测到的不相配合的抗原，抗体成份。 交叉配血应在37℃孵育，除作盐水介质法 配血外，还应选用酶法、抗球蛋白试验法、 Polybrene 或其改良法等能有效检出不完 全抗体的配血方法。