抗体库技术的应用
噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展
噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展王志文【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2015(040)001【总页数】3页(P131-133)【关键词】噬菌体;噬菌体抗体库;小分子抗体;免疫抗体库;综述【作者】王志文【作者单位】蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室,安徽蚌埠233030【正文语种】中文【中图分类】R373.9噬菌体抗体库技术是由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术。
通过噬菌体表面表达技术，将抗体分子Fab段基因或Fv基因通过与噬菌体外壳蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ基因连接以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面，从而形成噬菌体抗体。
继1988年Parmley等［1］首次阐明噬菌体表面表达技术以来，抗体分子是噬菌体表面表达的第一个具有天然蛋白质功能的蛋白质分子。
Hoogenboom等［2］将轻链基因插入噬菌体载体的左臂，重链基因插入噬菌体载体的右臂，连接后包装成噬菌体，建立了第一个噬菌体抗体文库。
随着噬菌体载体系统的改进，噬菌体抗体技术得到广泛的应用，为了提高抗体库的多样性，在CDR区随机引入核苷酸序列而构成人工合成噬菌体抗体库;在已获得的阳性克隆的基础上，在特异性抗体基因CDR区进行基因突变筛选［3］，以获得高亲和力的特异性抗体。
噬菌体表面展示技术的问世和噬菌体抗体表达筛选系统的逐渐完善，使人们可以完全跨越抗原免疫而直接获得丰富多样的特异性抗体。
本文就噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展作一综述。
1 噬菌体抗体库技术噬菌体属DNA单链病毒，长约7 000 bp。
噬菌体在细菌内滚环复制，被噬菌体感染的细菌不会裂解，但生长速度减慢，同时分泌出大量成熟的噬菌体颗粒。
噬菌体基因组共编码11种蛋白，噬菌体展示技术通常选择在信号序列和p蛋白第一结构域之间插入外源蛋白编码序列，经过噬菌体的包装加工，外源蛋白即可表达在病毒颗粒的表面［4］。
Ward等［5］采用PCR技术从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA中扩增出VH基因，测序证实了其多样性，并随后在大肠埃希菌中表达了该VH片段。
抗体制备技术的发展和医学应用
抗体制备技术的发展及其医学应用抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。
它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。
国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。
抗体的2条重链和2条轻链根据氨基酸序列变化程度分为V区和C区，其抗原结合特异性主要由V区中高度变异的超变区决定，3 个超变区共同形成1个抗原决定簇互补的表面，故又称为互补决定区( comp lementarity determining region，CDR)。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb），简称多抗。
多克隆抗体是由多克隆B细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的混合抗体。
因为天然抗原是由多种抗原分子组成的，每种抗原分子又含有许多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应的B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应的抗体。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1 抗体的发展抗体的研究过程经历了免疫血清学研究、单克隆抗体研究和基因工程抗体研究3个不同阶段。
1.1 免疫血清学研究阶段免疫动物产生的抗体是多种抗体的混合物，所以早期制备的抗体是多克隆抗体. 多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第1步，其在生物医学等方面的应用已有上百年的发展历史. 但多克隆抗体具有不均一性，特异性差且动物抗体注入人体会产生严重的过敏反应等特性，限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。
比较三代抗体在制备和应用方面的优缺点
比较三代抗体在制备和应用方面的优缺点摘要：抗体技术的发展主要经历了三个时期，相应产生了三代抗体：多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。
多克隆抗体技术即免疫血清制备技术较简便，但免疫血清特异性较低。
自从第一个单克隆抗体产生以来，单抗已广泛地应用于疾病的诊治上。
为了克服传统的鼠源性单抗存在的弊端，随着分子生物学和细胞生物学的快速发展，基因工程抗体技术取得了比较大的进展，包括对鼠源性单抗的改造、人源性单抗的研制及对抗体分子结构和功能的改造，尤其是以噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠技术为代表的人源性单抗制备技术的研制最为瞩目。
本文就三代抗体在制备及应用方面的优缺点作了简单的比较。
关键词：多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体抗体(antibody)是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。
抗体技术的发展主要分为三个时期，1890年Emil A. V. Behring等发现白喉抗毒素，并用于人工被动免疫，第一代抗体——多克隆抗体(Polyclonal antibody, PcAb)，继而产生。
第二代抗体于1975年，Köhler和Milstein创建杂交瘤技术制备出针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体(Moclonal antibody, McAb)，单克隆抗体是均质的异源抗体。
20世纪80年代采用基因工程的手段研制抗体及其与功能的关系，并对抗体基因进行改造和重组等，而制备出的抗体为基因工程抗体（Genetic engineering antibody, GEAb），即第三代抗体。
[1]一、多克隆抗体(Polyclonal antibody, PcAb)1、免疫血清的制备（1）抗原的制备制备多克隆抗体对抗原纯度要求十分严格。
抗原越纯，获得抗体的特异性越高，要求至少达到电泳纯或色谱纯。
（2）佐剂（Adjuvant）的应用对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。
抗体的研制及其在生物医学中的应用11208120杨文清
抗体的研制及其在生物医学中的应用11208120 杨文清抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点，在各种疾病治疗，特别是肿瘤治疗领域的应用前景备受关注。
当前，抗体药物的研究与开发已成为生物技术药物领域研究的热点，居近年来所有医药生物技术产品之首。
一、背景历史：1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。
1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。
20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。
病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，统称为免疫球蛋白。
1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。
单克隆抗体的研究一直是生物医药领域的重要研究内容。
白20世纪90年代中期以来，单克隆抗体和多克隆抗体的基础研究论文产出有所下降，而人源化抗体的研究则不断得到重视(参见图1)。
这说明，单克隆抗体相关生物医学理论的基础研究已经相对成熟，单克隆抗体应用研究则不断发展。
在这一研究发展历程中，人源化抗体和重组多克隆抗体技术的发展促进了抗体药物研究的深入(参见图2)。
其中，人源化抗体是在鼠源单抗应糖体展示技术、酵母展示技术、转基因鼠技术等的发展，使人源性基因工程抗体的获得不再是难题．这又激发了单抗药物的研究热情。
1994年．美国批准第二个抗体药物上市。
之后，抗体药物不断上市。
2006年利用能够产生人类抗体的转基因小鼠XenoMouse技术首个完全人源化单克隆抗体药物Panitumumab上市，标志着人源化抗体技术的发展达到了新的水平。
近年来，随着Symphoge公司的Symplex 和Sympress 等技术的发展．以及由此而生产、用于治疗原发性血小板减少性紫癜(ITP)和新生儿溶血症(HDN)的多克隆抗体药物Sym001(anti—RhD)进入II期临床试验重组多克隆抗体药物研究也呈现出良好的发展态势。
重组抗体文库技术及其应用
重组抗体文库技术及其应用抗体是一种在生命科学领域中非常有用的分子工具。
人们可以通过提取动物或人体内特异性抗体来对特定的物质进行检测和定量分析。
但是，传统的抗体制备方法需要提取动物或人体内的抗体，这个过程十分繁琐且涉及许多伦理和法律问题。
为了解决这些问题，人们开始尝试开发一种新的抗体制备和生产方法——重组抗体。
重组抗体技术是通过将人工合成的基因片段插入到真核细胞中，从而利用人工合成的方式来制造抗体。
这种方式既快速又可控，而且由于不需要动物参与，因此符合伦理和法律的要求。
在重组抗体技术的研究中，一个非常重要的进展是重组抗体文库技术。
重组抗体文库技术是一种通过基因重组来合成大量抗体的方法。
它利用人工合成的基因段和哺乳动物细胞进行结合，构建了一个可以用于生产大量抗体的文库。
这些抗体仍然具有高亲和力和高特异性，但是它们来自完全人工生成的基因，与动物或人体没有任何关系。
这种方法因为不需要动物参与，因此被认为是一种高度可持续的抗体生产方法。
随着生物技术的飞速发展，重组抗体文库技术得到了广泛应用。
它涵盖了很多应用领域，例如药物研制、疾病检测和治疗、医疗设备和生物安全等方面。
下面，我们将从这些方面分别探讨其应用。
一、药物研制重组抗体文库技术对药物研制有着非常重要的意义。
在过去的几十年中，许多制药公司都致力于生产抗体类药物。
因为这种药物可以对很多病毒、细菌和癌细胞进行特异性识别，因此在抗肿瘤和免疫治疗方面具有良好的应用前景。
但是，传统的抗体制备方法生产速度和成本都十分昂贵，这大大限制了抗体类药物的开发。
重组抗体文库技术便可以克服这些缺点，大幅度降低了制药成本并增加了药物开发的速度。
利用重组抗体文库技术，生物技术公司可以生成大量可供选择的抗体。
这些抗体可以用于药物筛选或疗效验证实验中。
在药物开发的早期阶段，科学家可以通过选择合适的抗体来进行药物筛选，以寻找最佳的作用机制。
在药物的临床试验和上市后，重组抗体还可以用来测试药物的质量、含量和稳定性等重要指标。
单克隆抗体在人体内应用
噬菌体抗体库技术 具有：能够得到完全人源性Ab、分离抗体速度快、简单易
行等优点。
单克隆抗体在人体内的应用
转基因小鼠技术
单克隆抗体在人体内的应用
几种已被批准上市的McAb药物
Rituxan ( Rituximab,Mabthera，利妥昔单抗 )，Genentech公司生产，商品 名为美罗华。是1997年第一个被美国FDA批准用于人肿瘤治疗的基因工程 1997年FDA批准Zenapax(daclizumab，PDL公司生产)上市。它是靶向为 抗体，最初被用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤， 总有效率达60%，现在正在探 CD25 抗原的人源化单抗，是第 个无严重不良反应的免疫抑制剂，能有 1986 年美国 FDA批准抗CD3鼠单抗1 OKT3 上市，改善了许多肾移植病人的存活。 索用于治疗抗体病相关淋巴瘤和中枢神经系统淋巴瘤。 效减缓器官移植所引起的免疫反应
HGPRT-
单克隆抗体在人体内的应用
HAT培养基
单克隆抗体在人体内的应用
单克隆抗体在人体内的应用
鼠源性单抗应用于人体时具有较强的免疫原性，
将诱发产生 人抗鼠抗体( human anti-mouse
antibody, HAMA ) 反应； 鼠源性单抗通常不能有效地激活人体的免疫反
应，如 补体依赖的细胞毒(CDC)作用 及 抗体依
鼠源单抗人源化 鼠源单抗人源化经历了如下历程：
恒定区人源化 可变区人源化 利用抗体库技术获得完全人源序列
单克隆抗体在人体内的应用
鼠源单抗人源化
1. 恒定区人源化——鼠/人 嵌合抗体 (chimeric antibody)
由于异源性McAb的免疫反应约有90%是针对 恒定区（C区），要降低McAb 的抗原性，必须对它的恒定区进行 人源化 。其原理是从分泌某McAb的杂交
抗体库技术
5.2.2.2 抗体库筛选技术
•1. 用于筛选的抗原 • 能够将结合与非结合形式的噬菌体分离开
的方法均可用于筛选 • a 可溶性抗原包被于酶标板（聚苯乙烯） • b 将抗原固定化到琼脂糖微珠上，亲和柱
层析
• C 生物素-抗原+ 抗体库→
• 基因工程抗体，极大地改善了抗体的性能 和扩展了抗体的应用范围
• 抗体库技术，通过DNA重组技术，克隆全 套抗体可变区基因，在原核系统表达有功 能的抗体分子片段（即抗体库），从中筛 选特异性抗体的基因。
• 两项关键技术：
• PCR：用一组引物，扩增出全套免疫球蛋 白的可变区基因
• 以大肠杆菌(或噬菌体)直接表达有功能活性 的抗体分子片段
• 噬粒做表达载体，来源于辅助病毒的野生 型蛋白Ⅷ和蛋白Ⅷ-抗体融合蛋白共同组装 到噬菌体表面，各自的表达数目取决于两 者的相对数量
• 每一个噬菌体表面可表达24个左右的抗体 分子
• 基因Ⅲ(蛋白Ⅲ )：
• 用噬菌体载体产生多价抗体分子
• 用噬粒表达，所产生的噬菌体抗体颗粒中 10%表达有抗体分子片段，单价
• 辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低 的突变型，但可为宿主细胞的质粒DNA提 供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白
• 用辅助病毒超感染，辅助病毒提供所有的 丝状噬菌体蛋白，将噬粒DNA 以单链的形 式包装在噬菌体外壳蛋白内，形成病毒颗
粒，可以感染大肠杆菌，但不产生（辅助 噬菌体）子代噬菌体。
• 噬粒载体中插入抗体分子片段与基因Ⅲ或 基因Ⅷ
• 基因工程抗体技术，是继杂交瘤单克隆抗 体技术以后抗体领域的又一次革命
• "噬菌体抗体库技术"又被誉为这次革命中 的革命
高通量抗体筛选技术及其生物医药应用
高通量抗体筛选技术及其生物医药应用随着人类对生命科学的研究不断加深，抗体药物已成为现代医药学领域的一颗耀眼明珠。
然而，传统的抗体生产方式极为费时费力，大大限制了抗体药物的应用和生产效率。
随着科技的不断进步，高通量抗体筛选技术应运而生，成为推动抗体医药发展的重要工具之一。
本文将分析高通量抗体筛选技术的发展趋势、研究进展及其在生物医药领域中的应用。
一、高通量抗体筛选技术高通量抗体筛选技术，又称高通量筛选法（High-throughput screening），是指利用高通量方法筛选出具有活性的抗体或其他生物分子的技术。
高通量抗体筛选技术的优势在于可以同时处理大量样本，快速筛选出具有较高药效和特异性的抗体前体，提高药物发现的效率和速度，使药物研究和开发更加高效。
高通量抗体筛选技术发展至今，已经广泛应用于各种科学研究和生物医药领域，尤其在癌症、自身免疫性疾病、感染疾病等领域中拥有广泛应用的前景。
二、高通量抗体筛选技术的研究进展1. 抗体库技术抗体库技术是高通量抗体筛选技术的一种重要方法，通过对大量的抗体库进行筛选，识别具有独特活性的抗体药物。
例如公司Lilly开发了利用嵌入式技术制备Phage显示的人源单抗库，并在此基础上发展了一种新型的抗体药物，用于治疗肿瘤和自身免疫性疾病。
2. 突变技术突变技术是指通过诱发抗体的突变，从而得到具有改良性能的抗体药物。
突变技术通常包括分子演化技术、DNA乱序技术、遗传突变技术等。
通过此类技术可以实现抗体药物在亲和力、特异性、稳定性等方面的优化，从而获得更为理想的抗体药物。
3. 体外和体内选择技术体外和体内选择技术是指通过体外/体内选择的方式筛选出具有特殊功能的抗体药物。
此类技术不仅可以识别出具有特殊生物活性的抗体药物，同时还可以评估和优化已经发现的抗体药物。
三、高通量抗体筛选技术的生物医药应用1. 抗体药物目前，抗体药物已成为生物医药领域最重要的药物之一。
抗体药物通过模拟人体免疫系统的作用机制，能够与病原体或癌细胞表面的分子结构结合，从而发挥诊断和治疗作用。
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①．随机突变： ：将带有亲本抗体基因 的质粒用氯化钙转化法转化到高突变菌株 XL1-Red感受态细胞进行随机突变。在 200 mL含有氨苄西林的SB培养液中26℃ 振荡培养24 h作为一轮，然后取出5 mL扩 大到200 mL体积进入下一轮．共进行16 轮培养；将最后一轮的菌液离心。收获沉 淀提取质粒并用电穿孔法转化到TG1菌株 ．扩大培养的细菌用辅助噬菌体VCSM13 诱导表达噬菌体抗体，回收突变抗体库以 备筛选用。
方法 ：以人表皮角蛋白为抗原，从噬菌
体抗体库中克隆特异性抗角蛋白抗体，采 用基因随机点突变和链替换(chain shuffling)技术对所获抗体进行亲和力成 熟，并对其生物学性能进行一系列鉴定。
1.抗角蛋白抗体的克隆
①.抗体库的筛选：对噬菌体抗体库进行 扩增，获得抗体库上清滴度为1～ 1.3×1014 cfu／mL；以人表皮角蛋白为 抗原，先后对半合成抗体库和天然抗体 库进行“亲和吸附一洗脱一扩增”筛选， 以克隆人源性抗角蛋白抗体。
②．链替换：将亲本克隆的重链与K轻链库 的多样性轻链组合形成轻链替换库，用解 离速率筛选法选取亲和力高于亲本的克隆 ；然后进行重链替换。将轻链替换后亲和 力提高的克隆与多样性Fd段基因随机组合 构建重链替换库．用同样的方法淘筛选取 亲和力进一步提高的克隆．最终得到高亲 和力抗角蛋白抗体。
③．亲和力测定：在筛选过程中用硫氰酸盐 洗脱法测定获得抗体的相对亲和力，从中 选出亲和力最佳者，再用非竞争酶免疫法 测定其亲和指数。
②.噬菌体抗体的ELISA鉴定： 选择以1．25 Ixg／mL浓度的人表皮角 蛋白包被酶标板，经1％BSA封闭后加 入待测噬菌体抗体上清液，以HRP一 羊抗M13为二抗，孵育、洗涤后OPD 底物显色。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2.提高抗体亲和力
为了获得高亲和力的抗角蛋白抗体， 我们从筛选到的抗体中选择活性最好的1株 作为亲本，用基因随机突变和链替换两种 手段对其亲和力进行改造。
3. 抗体鉴定
• 特异性：用ELISA方法鉴定抗体与抗原结
合的特异性，所用无关抗原有胃蛋白酶、 木瓜蛋白酶、铁蛋白等，实验操作按常规 方法进行。
• 抗体可变区基因测序：对所获高亲和力
抗体进行可变区基因序列测定，登录基因 库(GenBank)对测序结果进行分析。
• 结果：经过筛选半合成抗体库和天然抗体
（一） 操 作 方 法
从免疫后个体制备人
源抗体
<一>、概念
对于能进行体内免疫的抗原， 从被免疫者获取淋巴细胞构建抗体 库，可以较容易地得到高亲和力的 抗体，主要包括疫苗注射、微生物 感染、自身免疫疾病、肿瘤等。目 前已经有很多关于人源抗体制备的 报道。
但由于这些抗体库的构建取 材于体内免疫者的淋巴细胞，在体 内经过抗原选择和亲和力成熟，因 此从较小库容（105~107）的抗体 库就能较容易地筛选到特异性强的 高亲和力抗体。
<二>、高亲和力抗角蛋白人抗体 的基因工程制备
目的：制备亲和力高、性能良好的人源性 抗角蛋白抗体。
材料：半合成噬菌体抗体库和人源性 天然抗体库。库容分别为4×108和 1×109；大肠杆菌菌株TG1、辅助噬菌 体VCSM13；高突变菌株XL1-Red；各 种内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA 聚合酶；混合分子量人表皮角蛋白(5 mg／mL)和人血清IgG型抗角蛋白自身 抗体(IgG—AK auto Ab)