金免疫测定技术
第5章 常见免疫学检测技术-胶体金免疫层析
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
LA T E R A L FLO W T E S T S T R IP O F V E D A LA B
30
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©①双抗体夹心法
• 固定于膜上的抗 体1＋标本中待测 抗原＋金标记的 抗体2显色
• 用于测抗原
原 • 是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术 理 • 将结合各的种以反应微试孔剂滤分膜点为固载定体在的测快试速版的相固应相
• 通区膜域过免，毛疫检细分测析管标作技用术本加使在样试品纸溶条 液的 在一 层端析材料 上泳动，样本中的待测物与层析材料中 的反应试剂发生特异性结合反应，形成 的复合物被富集或固定在层析条上的特 定区域（检测线），通过标记抗体显色
§ 最初应用于免疫组化染色，随后发展到以膜为 载体的免疫测定技术
一、胶体金标记免疫检测应用现状
§ 胶体金标记技术具有简单、快速、灵敏等特 点，得到了广泛应用
§ 20世纪90年代兴起的胶体金免疫层析技术，特 别是试纸条的发展，使操作更加方便快捷
§ 胶体金标记免疫检测技术在临床医学检测、激 素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速 检测，以及抗原抗体分析等诸多领域迅速发展
食品 食品安全检测中心, 农兽药残留（磺胺类、瘦肉精
安全 各监管部门
等）,大肠杆菌,黄曲霉素
--
瘦 肉 精
沙 丁 胺 醇
--
瘦 肉 精
沙 丁 胺 醇
—
瘦 肉 精
克 伦 特 罗
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
—
兽 药
恩 诺 沙 星
致病菌--大肠杆菌O157
胶体金免疫层析技术
胶体金免疫层析技术胶体金免疫层析技术是一种重要的生物分析技术，它在医学诊断、生物学研究、环境监测等领域有着广泛的应用。
本文将介绍胶体金免疫层析技术的原理、方法、应用及发展前景等方面，以帮助读者深入了解这一技术的重要性和特点。
一、胶体金免疫层析技术的原理胶体金免疫层析技术是一种基于抗原与抗体特异性结合原理的生物分析技术。
其原理基于胶体金颗粒的特殊性质，当胶体金颗粒与特定的抗体或抗原结合时，会产生颜色变化。
这种颜色变化可以通过裸眼观察或仪器测定来定量分析目标物质的含量，从而实现对目标分子的快速、灵敏、特异性检测。
二、胶体金免疫层析技术的方法1. 样品预处理在进行胶体金免疫层析技术前，需要对样品进行一定的预处理工作，以获得高纯度的检测目标。
这包括样品的收集、提取、稀释、清洁等操作，以确保样品的纯度和稳定性。
2. 抗原抗体结合在胶体金免疫层析技术中，首先将抗原或抗体与胶体金颗粒结合，形成胶体金-抗原或胶体金-抗体复合物。
这一步是整个技术的关键，其特异性结合决定了最终结果的准确性和可靠性。
3. 层析纸制备将样品和复合物应用于层析纸上，经过升温、冷却和其他特殊处理，使复合物在层析纸上呈现出清晰的条带，以便进行后续的观察和分析。
4. 结果分析通过裸眼观察或仪器测定，分析样品中的目标分子的含量，从而得出最终的检测结果。
三、胶体金免疫层析技术的应用1. 医学诊断胶体金免疫层析技术在临床医学中被广泛应用，例如对传染病、肿瘤标志物、生化指标等的快速检测，为疾病的早期诊断和治疗提供了重要的支持。
2. 食品安全该技术可以用于食品中有害物质的检测，如农药残留、重金属污染等，确保食品的安全和健康。
3. 环境监测胶体金免疫层析技术也可以用于环境监测领域，检测水质、土壤质量等环境参数，为环境保护和生态平衡提供数据支持。
四、胶体金免疫层析技术的发展前景随着生物技术和纳米技术的不断发展，胶体金免疫层析技术将得到更广泛的应用和改进。
未来，可以预见该技术在药物筛选、基因检测、个性化医疗等领域将发挥越来越重要的作用。
免疫检验考试辅导：金免疫测定技术
金免疫测定技术是指用胶体金颗粒作为标记物进行抗原抗体反应的一类免疫学测定技术，其主要技术类型有斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验。
1）斑点金免疫渗滤试验：在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上，故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的，阳性反应在膜上呈现红色斑点。
2）斑点金免疫层析试验：是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相合的以硝酸纤维素膜为载体的固相膜免疫分析技术，滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判读实验结果。
第5章 常见免疫学检测技术-胶体金免疫层析
夹心法反应演示
阳性
阴性
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©②间接法检测抗体
间接法反应演示
阳性
阴性
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©③间接竞争法
竞争抑制法反应演示
阴性
弱阳性
阳性
检测线颜色强度与样品浓度负相关
竞争法结果判断
（三）胶体金免疫测定技术
ª 2.胶体金免疫层析试纸条制作 § （1）试剂、耗材准备 § （2）金标抗体的制备 § （3）试纸条的组装 § （4）试纸条的优化 § （5）样品检测及分析
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （1）试剂、耗材准备
• 硝酸纤维素膜的参数：孔径、对称性、层析速度、表面 活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均 一性等
• um 指的是膜孔径，但膜在生产过程中，由于干燥成型 等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的，不同厂 家膜孔径标准无法统一衡量
（三）胶体金免疫测定技术
ª 1.主要形式（基本原理） § 斑点金免疫渗滤/dot immunogold filtration
assay, DIGFA § 胶体金免疫层析/immunochromatography assay,
ICA--试纸条
（三）胶体金免疫测定技术
§ （1）斑点金免疫渗滤
原 • 以硝酸纤维素膜作为固相载体、包被抗 理 原或抗体
（二）胶体金的制备
® 一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣 酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等
ª 以柠檬酸三钠还原法为例 § 取0.01% HAuCl4 溶液100 mL 搅拌、加热、回
流，沸腾2 min, 迅速一次加入一定量的 1% 柠 檬酸三钠水溶液（现配），保持低沸，经由蓝、 灰、至呈现透明的橙红色停止加热。回流冷却至 室温（应为原体积，否则应用蒸馏水恢复体积） § 加入柠檬酸钠的量不同，胶体金颗粒大小不同
第十一章金免疫技术【52页】
三、临床应用与评价
1. 应用 （1）细胞的膜表面抗原 （2）细胞胞/组织内抗原 （3）组织中或亚薄切片中抗原 (4) 病毒检测或病毒分型
2.评价
（1）优点：标本用量少,敏感性高，特异性好, 标本用量少,可进行双标或多标检测。
原理：
免疫反应
胶体金颗粒(CG)沉积在Ag位置
CG 催化，对苯二酚还原剂
银离子(Ag+) 还原成 银原子(Ag)
银原子围绕金颗粒形成一个“银壳”
子
“银壳”催化，还原更多银离
“银壳”越长越大,抗原位置得到清楚放大
（二）操作技术要点
1.试剂：免疫金、配制新鲜配制银染液。 2.检测：多用于抗原检测。
目前得以广泛应用。
第一节 胶体金与免疫金的制备
1. 胶体金的制备 2. 免疫金的制备 3. 免疫金的保存
1.1胶体金的结构
胶体金是由金盐被还原成 原金后形成的金颗粒悬液。
胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au） 及包围在外的双离子层构成(内层AuCl2－， 外层H+）。
金颗粒间静电相互排斥而悬浮形成一种稳定 的胶体状态。
DIGFA
穿流（flow through）
DICA
横流（lateral flow）
(二) 方法类型
1.双抗体夹心法 2.竞争法/抑制法 3.间接法
1.双抗体夹心法
？
免疫层析试验双抗体夹心法测
双抗体夹心法
标本
Gold
test
control
结果观察
Gold
阳性
test control
金免疫分析技术
斑点金免疫渗滤试验
斑点金免疫渗滤试验
技术类型
DIGFA—双抗体夹心 法测抗原
抗体结合在微孔滤膜 的中央>>> 加待测标 本> >>加金标抗体 >>>洁洗涤剂后，阳 性结果，膜中央呈现 红色斑点
DIGFA--间接法测抗体
抗原包被在微孔滤膜 上》》滴加待测标本》 》加洗涤剂后》》滴加 金标抗抗体》》加洗涤 剂后，阳性结果，膜中 央呈红色斑点
斑点金层析试验 DICA
（ dot immunogold chromatographic assay）
斑点金免疫渗滤试验
DIJFA
原理
①将抗原抗体点加在③固相载体硝酸纤维素薄膜上，制 成抗原抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上
②标本中的抗原抗体被膜上的抗体抗原捕获，无关蛋 白随液体滤出
③加入胶体金标记物在渗滤中与相应的抗原抗体结合。
胶体金的制备
制备方法
氯金酸水溶液加热沸腾》》搅拌着加入枸橼 酸钠水溶液 》》 金黄色的氯金酸水溶液在 2min内变为紫红色》》 再煮沸15min冷却后以 蒸馏水恢复到原体积
胶体金的制备
注意 事项
1）、玻璃容器的清洁容器使用前必须酸洗和硅化
硅化的一般过程 用5%的二氯二甲硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器 1min，室温干燥后，用蒸馏水冲洗，在干燥备用。
穿流（flow through）
DICA
横流（lateral flow）
斑点金层析试验
方法分类
双抗体夹心法测抗原 间接法测抗体 竞争法测抗原
斑点金层析试验
DICA--双抗体夹心斑点金层析试验
DICA--间接法测抗体
金免疫层析试验双抗体夹心法测b抗原
金免疫层析试验双抗体夹心法测b抗原在当今社会，人类对健康的重视程度越来越高，对于疾病的预防和治疗也变得越来越重要。
在疾病的预防和治疗过程中，快速、准确的诊断方法显得尤为关键。
金免疫层析试验是一种常用的免疫分析技术，其双抗体夹心法也被广泛应用于检测b抗原。
本文将对金免疫层析试验双抗体夹心法测b抗原的原理、方法和应用进行探讨，以期为读者深入了解该技术提供一定的参考。
一、原理金免疫层析试验双抗体夹心法是一种免疫层析技术，利用金颗粒和特异性抗原-抗体反应进行检测。
在双抗体夹心法中，样品中的b抗原首先与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，然后将金颗粒标记的抗b抗体加入样品中，与未结合的b抗原结合，形成抗原-抗体-抗体复合物，最终在试纸上形成可见的条带。
二、方法1. 样品处理：将待测样品与特异性抗体充分混合，反应一定时间后离心，取上清液备用。
2. 移液：将上清液滴于条带上，待完全渗透后，加入金颗粒标记的抗b抗体溶液。
3. 测定结果：观察试纸上是否出现双条带，若出现双条带则为正样品，表示样品中含b抗原；若只出现负对照线，则为负样品，表示样品中不含b抗原。
三、应用金免疫层析试验双抗体夹心法测b抗原在临床诊断中具有较广泛的应用。
它具有操作简便、结果快速、准确性高等特点，大大方便了临床医生的诊断工作。
尤其是在疫情防控期间，该技术可快速筛查出患者是否感染b病毒，对于疫情的防控和诊断具有重要意义。
金免疫层析试验双抗体夹心法测b抗原是一种重要的免疫分析技术，其原理简单，方法操作便捷，应用范围广泛。
相信随着科技的不断发展，该技术在临床诊断中的应用将会更加深入，为人类的健康事业做出更大的贡献。
金免疫层析试验双抗体夹心法测b抗原在临床诊断中的应用金免疫层析试验双抗体夹心法测b抗原作为一种快速、敏感和高效的免疫分析技术，其在临床诊断领域具有广泛的应用价值。
下面将就其在不同领域的应用进行进一步探讨。
一、传染病诊断金免疫层析试验双抗体夹心法测b抗原在传染病的诊断中扮演着重要的角色。
金免疫技术(免疫学检验课件)
优质
胶体金
劣质
二、胶体金的制备
胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还 原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏 血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶 液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原 子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。
• 免疫渗滤试验（IFA）始创于1985年，最初以酶作为 标记物。
• 20世纪90年代初金免疫渗滤技术得到了快速发展，用 于检测各种传染病的抗体和肿瘤标志物等。
• 目前临床中用于检测尿液HCG的“金标”早孕诊断试 剂就是应用这种方法。
一、检测原理
• 将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素膜上， 制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上 ，依次在膜上滴加标本、金标试剂及洗涤液等，液体 很快渗入吸水材料中，阳性反应即在膜上呈现红色斑 点。
第一节 胶体金与免疫金的制备
一、胶体金的特性
• 胶体金也称金溶胶，是由金盐被还原成原金后形成 的金颗粒悬液。核心为原子金（Au），外围双离子 层（内层Cl-，外层H+）。
• 胶体金颗粒大小多在1nm～100nm，微小金颗粒稳定 、均匀、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体 金溶液。
呈色性：不同大小的胶体金呈色有一定差别 微小-呈红色； 最小（2-5nm）—橙黄色； 中等大小（10-20nm）—酒红色； 较大（30-80nm）—紫红色。
待测标本 金标抗体
A
B
。
第三节 胶体金免疫层析技术
• 免疫层析技术（ICA）的原理与渗滤技术相同，不同 点在于液体的移动是基于层析作用的横流，而不是通 过直向的穿流。
• 该方法的试剂为试纸条形式，结构简单。 • 测定项目包括HCG等激素、肿瘤标志物、心血管病标
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（2）于小孔内滴加免疫金试剂3滴，待完全渗入。
（3）于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入。 （4）目测观察结果
结果判断
在膜中央有清晰的红色斑点者判为阳性反应，说
明标本HCG阳性；反之则为阴性反应，说明标本 HCG阴性。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。
结果书写
例如：1号标本醋酸纤维膜中央出现红色斑点，该
抗体、毒品类药物及HCG等检测。
金免疫测定技术灵敏度不及酶标法和酶发光免疫
测定法，在临床应用中意事项
（1）打开层析条包装后应在1h内应用。
（2）将层析条插入样品中，样品的液面不 能超过试剂条的标记线。
应用与评价
这两种方法具有操作简便、快捷以及操作人员不
需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定、便 于保存等特点，因此特别符合POCT项目的要求。
只作为定性或半定量试验，常用于传染病抗原和
滤出膜片。其后加入的免疫金在渗滤过程中与已
结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，
阳性反应即在膜中央显示红色斑点（胶体金聚
集）。
免疫金
HCG 抗HCG抗体 醋酸纤维素膜
主要材料
试剂盒：渗滤装置、免疫金、洗涤液
器材：一次性滴管
标本：尿液
操作步骤
（1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加尿 液5滴，待完全渗入。
标本为HCG阳性
注意事项
注意试剂的保存及使用温度。
正确操作，注意加入尿液样品量和免疫金 试剂量。
斑点金免疫层析试验
原理
主要材料
层析条
标本：尿液
操作步骤
（1）将试剂条的加样端浸入尿液中2-5s，取
出，平放于桌面上。
（2）5-15min内，目测观察结果。
结果判断
T C
金免疫测定技术
斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试
验均以硝酸纤维素膜为固相载体，以免疫
金为结合物，其最大特点是简便快速。
以下均以双抗体夹心法测定尿中HCG（人绒
毛膜促性腺激素）为例。
斑点金免疫渗滤试验
原理
在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为
膜所吸附。当滴加在膜上的液体标本渗滤过膜时， 标本中待测抗原被膜上抗体捕获，其余无关物质