-金免疫技术

免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓 度保存。稀释液通常是加入含稳定剂的缓 冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲 液。PEG和BSA是最常用的稳定剂。
稳定剂有两大作用：①为保护胶体金的稳 定性，使之便于长期保存；②为防止或减 少免疫金复合物的非特异性吸附反应。

第二节 金免疫测定

一、斑点金免疫渗滤试验 二、 斑点金免疫层析试验
一、斑点金免疫渗滤试验

原理: 斑点金免疫渗滤试验是将抗原或抗体 点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上（这种 固相载体具有过滤性能）制成抗原或抗体 包被的微孔滤膜贴置于吸水材料上，依次 滴加在膜上的标本、免疫金、及洗涤液等 液体很快渗入吸水材料中，最后阳性反应 在膜上呈现红色斑点。液体通过微孔滤膜 时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体 或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达 到快速检测的目的。
2.技术要点




胶体金溶液的pH值调整 用K2CO3或HCl溶液 调节胶体金溶液的pH至选定值。 蛋白质最适标记量的确定 标记过程 在电磁搅拌下将1/10体积的合适浓 度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，反应一定 时间后加入 BSA并调整pH至8.5，放置室温继 续反应数分钟。 离心分离
三、免疫金的保存

测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶，然后将 标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动， 若标本中有待测抗体存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体 复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处时，在F处加缓冲 液，合上测试卡，A处的强大吸水作用使膜上液体反向流动， 标本中非特异性IgG及无关物向E处反向层析，随后而来的金 标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色线条。无 棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗体。

根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色或吸收 峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。
3.胶体金的制备


（1）制备原理 向一定浓度的金溶液内加 入一定量的还原剂使金离子变成金原子， 形成金颗粒悬液。目前常用的还原剂有： 白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏 血酸、枸橼酸钠、鞣酸等。 （2）操作要点 最常用的制备方法为柠檬 酸盐还原法。
（2）胶体金的颜色和光吸收性：对同一种物质的水 溶胶金颗粒来说，粒子大小不同，颜色亦不同： 胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm， 呈葡萄酒红色。 胶体金颗粒20～40nm之间吸收波长530nm，液体 为深红色，60nm的金溶液主要吸收波长600nm， 金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶 胶呈红色。
方法类型

1．双抗体夹心法 2．间接法
技术要点
二、 斑点金免疫层析试验

(一) 原理：斑点金免疫层析试验中滴加在 膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用 向另一端移动，犹如层析一般，在移动过 程中被分析物与固定于载体膜上某一区域 的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则 越过该区域而被分离，然后通过胶体金的 呈色条带来判定实验结果。
三. 临床应用及评价



1.免疫金技术具有操作简便、快捷以及操作人员 不需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定， 便于保存等特点，因此特别符合“床边检验” (point of care test,POCT)项目要求。 2.本法灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法， 在临床应用中应引起高度重视。 3.该技术不能准确定量，只能作为定性或半定量 试验，目前主要应用于正常体液中不存在的物质 （如传染病抗原和抗体以及毒品类药物等）和正 常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如 HCG等）的检测。
四种粒径胶体金的制备及特性
胶体金粒径 （nm） 1％柠檬酸三 钠加入量 （ml）* 胶体金特性 呈色 λ max
16.00 24.50
41.00 71.50
2.00 1.50
1.00 0.70
橙色 橙红
红色 紫色
518nm 522nm
525nm 535nm
4.胶体金鉴定

制好高质量的胶体金却也并非易事。 可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的 粒径。制备的胶体金最好作电镜观察，并 选一些代表性的作显微摄影，可以比较精 确地测定胶体金的平均粒径。
金免疫技术
金免疫技术



金免疫技术（colloidal gold immunoassay technique）是一种以胶体金作为标记物的免 疫标记技术。 1970s由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫 电镜技术。 金免疫技术用于: 免疫组织化学染色; 金 免疫测定
第一节 胶体金与免疫金的制备

一、胶体金特性及其制备 二、免疫金的制备 三、免疫金的保存
一、胶体金特性及其制备




1.胶体金的结构 2.胶体金性状 3.胶体金的制备 4.胶体金鉴定 5.胶体金保存 6.注意事项
1.胶体金的结构


胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是由金盐被还原成原金后形成 的金颗粒悬液。 胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au） 及包围在外的双离子层构成，紧连在金核 表面的是内层负离子（AuC12－），外层离 子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶 体金游离于溶胶间的悬液状态。
(二) 方法类型

1.双抗体夹心法 2.竞争法 3.间接法
1.双抗体夹心法
免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原
2.竞争法
免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图
3．间接法

为了消除待测血清标本中大量的非特异性 IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG， 降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析 法测抗体常设计成反流免疫层析法(图22-4)。
二、免疫金的制备

免疫金 是指胶体金与抗原（抗体）的结合 物,在免疫组织化学技术中，习惯上要称之 为金探针。
1.制备原理


胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质的正 电荷基团间靠静电力相互吸引，达到范德 华引力范围内即形成牢固的结合,同时胶体 金颗粒的粗糙表面也是形成吸附的重要条 件。 因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要 因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质 的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质 的吸附
良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备 的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示 此次制备的胶பைடு நூலகம்金有较多的凝集颗粒。

5.胶体金保存

胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保 存，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可 有利于保存。
6.注意事项



（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 （4）用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。

胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较 小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金 颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在 电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。
2.胶体金性状

（1）胶体金一般性质： 胶体金颗粒大小多在1～100nm，微小金颗 粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮 在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而 具有胶体的多种特性，特别是对电解质的 敏感性。