细胞色素氧化酶染色液(对苯二铵法)
临床血液学检验：实验四 过氧化物酶染色(POX)
正常血细胞PAS染色特点
粒系统
PAS反应 （+）
沉淀颗粒特点
细颗粒状或均匀红色
淋巴系统 少数（+）（<20％）
单核系统 （+）
红系
（-）
巨核系 （+）
粗颗粒状或块状 细颗粒状
颗粒状或块状
• 临床意义
1.鉴别淋巴系统增生的性质 恶性增生时多呈强阳性---ALL、CLL、淋 巴瘤（红色颗粒或块状）
2.鉴别红系增生的性质
A: APL B: AMML C: AMOL D: ALL
过碘酸－雪夫反应（糖原染色) Periodic Acid-Schiff (PAS) reaction
• 过碘酸是一种氧化剂，能使细胞内含有乙二醇的糖 类氧化产生双醛基，醛基与schiff试剂中的品红结合， 形成紫红色化合物，定位于含有多糖成分的部位。
实验三
过氧化物酶染色（POX） 过碘酸-雪夫反应（PAS）
细胞化学染色
Cytochemical Staining
实质是原位显示细胞成分结构，常为不移
动的有机化学物。
细胞化学染色包括三个步骤：
固定
化学染色 （包括复染）
化学定量
过氧化物酶染色 Peroxidase Staining （POX）
1.原理： 传统方法----联苯胺法
CLL
ALL
ALL
ALL中粗 粗粒散在分布
A:红白血病
B:巨幼贫
M6 PAS 染色
•
POX
新鲜ห้องสมุดไป่ตู้片
PAS
涂片滴加A液3滴固定60秒 （DW冲洗，待干）
滴加A液3滴（覆盖标本即可）滴加B液（高碘酸） 3滴氧化10 min， DW冲洗，待干 然后
细胞内过氧化酶的显示
实验九细胞内过氧化酶的显示【目的要求】1、了解显示细胞内过氧化酶的方法的原理。
2、熟悉过氧化物酶在细胞中的一般分布。
【实验原理】细胞中存在的过氧化物酶系能将许多胺类氧化成有色化合物。
例如联苯胺便可被细胞中的过氧化酶氧化成蓝色或棕色的物质（蓝色物质为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙），从而显示出细胞内过氧化物酶的存在和分布。
另外，细胞的代谢过程中会产生对机体有害的过氧化氢（H2O2），可被细胞中存在的过氧化氢酶分解成氧气和水。
通过植物块茎与过氧化氢相遇后所发生的反应可间接证实该酶的存在。
【器材与试剂】1、器材：光学显微镜、剪刀、镊子、刀片、染色缸、牙签、载玻片、盖玻片。
2、材料：大白鼠（或豚鼠）、马铃薯。
3、试剂：3%过氧化氢溶液、0.5%硫酸铜溶液、联苯胺混合液、1%番红水溶液。
4、试剂的配制：（1）3%的过氧化氢溶液：量取H2O21.5ml加入到48.5ml蒸馏水中。
（2）0.5%硫酸铜溶液：称取硫酸铜0.5g溶于100ml蒸馏水中，再加3%的过氧化氢溶液2滴。
（3）1%番红水溶液：称取番红O（Safranine O）染料粉1.0g溶于100ml蒸馏水中。
【内容与方法】一、大白鼠（或豚鼠）骨髓细胞过氧化物酶的显示1、将大白鼠置于装有乙醚棉球的标本缸中，使其麻醉后断颈处死，剪开其大腿上的皮肤和肌肉，取出股骨，用剪刀剪断或折断，再用牙签挑取骨髓制备骨髓涂片，晾干。
注意：涂片时要薄而均匀，否则无法观察结果。
2、将涂片放入盛有0.5%硫酸铜的染色缸中固定30秒钟。
3、取出涂片直接转入盛有联苯胺混合液的染色缸中处理3分钟。
4、清水冲洗。
5、放入1%番红溶液中处理1分钟。
6、清水冲洗，室温下晾干。
7、观察。
光镜下可见骨髓细胞中存在一些被染成蓝色或棕色的颗粒，便是过氧化氢酶存在的部位。
注：该项实验也可用小鼠的血液为材料，观察血液中巨噬细胞所呈现出的蓝棕色颗粒。
二、植物细胞中过氧化氢酶的间接显示取马铃薯块茎一个，用徒手切片法切取一小薄片放于载玻片上，滴加3%的过氧化氢溶液，稍等片刻，可见组织四周出现大量的气泡，提示植物细胞中有过氧化氢酶的存在，用煮熟的马铃薯重复上述过程，结果应该如何？【作业与思考】1、绘图表示细胞内过氧化物酶的分布。
实验：细胞化学染色POX(共69张PPT)
▪ 下面介绍几种常用的细胞化学染色方法
▪ 这些方法学在白血病的鉴别诊断上具 有重要意义。
一、过氧化物酶染色（POX）
（一）四甲基联苯胺法(TMB) ▪ 【原理】 粒细胞和单核细胞的胞浆内的髓过
氧化物酶（POX orMPO）分解过氧化氢， 释放新生态氧，使无色联苯胺氧化成蓝色联 苯胺，后者进一步变成棕色化合物沉着于细胞 质内。
型反应最强，MI和M5型反应较弱， ▪ 故有助于区别M3和M5型。 ▪ 急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，故为
急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标
。
注意事项
1. 涂片应新鲜制作、厚薄适宜。 2. TMB 配制在85％～88％的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90％～
95％乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而
▪ 细胞化学染色，是一种以形态为基础，结合运 用化学或生物化学技术对血细胞内各种化学 成分作定位、定性及半定量分析的方法。
▪ 用于研究血细胞生理、病理和化学结构； ▪ 临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗
效观察、预后监测和发病机制的探讨，提供 重要依据。
▪ 血细胞化学染色的基本要求是在原位显 示细胞成分和结构，反应产物应是有色 沉淀物，具有一定的稳定性。
色，胞核不清晰。
中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)
偶氮偶联法
NAP积分法
计数100个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各级百分率
与其级数乘积的总和，即为积分。
例如： NAP反应结果（%） （-） （+） （++） （+++） （++++）
GUS染色液配制
GUS染色液配制2篇【文章一】GUS染色液配制原理及方法GUS染色液是一种用于检测植物细胞中β-葡萄糖苷酸酯酶（GUS）活性的染色液。
本篇将介绍GUS染色液配制的原理及方法。
一、原理GUS染色液配制的原理是基于GUS酶催化水合酶活性，使含有1-甲基-β-吡喃糖苷（X-Gluc）的染色底物在酶的作用下发生蓝色沉淀反应。
该底物被GUS酶水解后可产生自由的5,5’-二溴-4,4’-二氯-3’-靛酚（X）和5-溴-4-氯-3-（2,6-二甲基-4-氧代酰基苯氨基）苯甲醇（Gal）。
这两种产物在碱性条件下进行聚合反应，生成可见的蓝色沉淀。
二、方法1. 准备所需材料：pH 5.0缓冲液、10% Triton X-100、X-Gluc染色底物（20mg/ml），甲醇，硫酸铵，硼酸，氢氧化钠，孵育液。
2. 配制pH 5.0的缓冲液：取适量的硼酸和氢氧化钠，配制一定浓度的缓冲液，并将溶液调至pH值为5.0。
3. 配制10%的Triton X-100：取适量的Triton X-100，加入适量蒸馏水溶解，使其浓度为10%。
4. 配制X-Gluc染色底物溶液：取适量X-Gluc，加入适量甲醇溶解，制成浓度为20mg/ml的X-Gluc溶液。
5. 配制孵育液：将硫酸铵和甲醇按一定比例混合，制成适量的孵育液。
配制步骤：1. 取适量的pH 5.0缓冲液，加入10% Triton X-100，并充分混合。
2. 加入适量的X-Gluc染色底物溶液，再次充分混合。
3. 加入适量的甲醇和孵育液，并充分混合。
4. 将配制好的GUS染色液过滤，以去除杂质颗粒，得到高纯度的染色液。
5. 将GUS染色液储存于4℃的冰箱中，避光保存。
三、注意事项1. 在配制GUS染色液时，应注意避免阳光直射和长时间的暴露。
2. 染色底物X-Gluc是一种易燃物质，使用时应注意安全操作。
3. 配制过程中的工具和容器应干净无杂质，以防止污染。
4. 孵育液的制备要按照所需配比进行，过量或不足都会影响染色效果。
实验室常用染色液配方
实验室常用染色液配方1. Giemsa染色液配方：- Giemsa染色液用于染色细胞核和染色体，常用于血液细胞计数、病原体观察等实验。
- 配方：Giemsa染色液的配方一般会根据不同的实验需求进行调整，但基本原料一般包括甲基蓝、伊苏琉斯蓝G、亚甲基蓝、酒精、非紫外吸收的甘油、磷酸盐缓冲液等。
2.范式染色液配方：-范式染色液常用于细胞和组织的常规染色，如荧光染色、光学显微镜下的染色观察等。
-配方：范式染色液的主要成分包括染料、溶剂、pH缓冲溶液、增稠剂等。
常用的染料有荧光素、伊红、伊博蓝等；常用的溶剂有酒精、乙醚、显微镜油等；常用的增稠剂有明胶粉、琼脂等。
3.原位杂交染色液配方：-原位杂交染色液主要用于检测细胞和组织中的特定核酸序列，常用于分子生物学研究、基因定位等实验。
- 配方：原位杂交染色液的配方会根据实验的具体目的进行调整，但一般包括核酸探针、碱性缓冲液、蛋白酶K、DNase I等。
4.细胞活力染色液配方：-细胞活力染色液用于评估细胞的活力和生理状态，常用于细胞培养实验、细胞毒性测试等。
- 配方：细胞活力染色液的配方一般包括活细胞染料、死细胞染料、背景抑制剂等。
常用的活细胞染料有乙酰红、卤化丙啶（Propidium Iodide，PI）等；常用的死细胞染料有丙酮溴化物（7-AAD）、EthD-1等；常用的背景抑制剂有苯甲缩醛（Sodium Azide，NaN3）等。
以上是实验室常用染色液的一些基本配方和介绍，实验者在进行实验前需要根据具体实验目的和需求进行配方选择和调整。
同时，注意染色液的稳定性、pH值的控制、操作的规范等因素也是成功进行染色实验的关键。
细胞染色方法大全
Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst 有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。
但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。
但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。
Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。
JC-1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。
浆细胞染色方法
浆细胞染色方法
1.苏木精伊红染色法（H&E染色法）：
这是一种常规的组织切片染色方法，对于检测浆细胞的分布
和形态特征非常有效。
步骤如下：
1）将组织标本固定并嵌入石蜡中，然后切割成薄片。
2）将薄片置于苏木精溶液中染色，可以染出细胞核为深蓝色，胞质为红色。
3）用伊红溶液处理薄片，可使核仁染成深蓝色，细胞质和胶原纤维染成粉红色。
4）最后用透明剂处理薄片，然后覆盖玻璃片，观察和分析浆细胞的形态和分布。
2.伊红/橙G染色法：
这种染色方法也可用于浆细胞的染色，它可以使细胞质染成
橙色、胞核染成淡红色。
步骤如下：
1）将组织标本固定并嵌入石蜡中，然后切割成薄片。
2）将薄片置于5%的酸性酒红溶液中，用浓盐酸处理23秒钟，使浆细胞细胞浆呈现橙色。
3）用伊红溶液处理薄片，胞核呈现淡红色。
4）最后用透明剂处理薄片，然后覆盖玻璃片，观察和分析浆细胞的形态和分布。
3.免疫组化染色法：
这种方法使用特异性抗体标记目标蛋白，可用于检测浆细胞中特定抗体的表达。
步骤如下：
1）将组织标本固定并嵌入石蜡中，然后切割成薄片。
2）将薄片进行抗原修复处理，以恢复蛋白质的免疫反应性。
3）在薄片上加上特异性的抗体，与目标抗体结合形成免疫复合物。
4）用酶标记的二抗结合免疫复合物，生成可视化信号。
5）最后用染色剂染色，观察和分析浆细胞中目标抗体的表达情况。
细胞生物学线粒体的超活染色与观察
细胞生物学实验线粒体的超活染色与观察一、实验目的1. 观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
2. 学习一些细胞器的超活染色技术。
二、实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织某些结构能着色但又不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化以致引起细胞的死亡的一种染色方法。
因此活染技术通常可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。
体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。
体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
詹纳斯绿B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。
三、实验用品（一）材料肝细胞、人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞（二）器材显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
（三）试剂1．Ringer 溶液氯化钠 0.85g氯化钾 0.25g氯化钙 0.03g蒸馏水 100ml2. 1%詹纳斯绿B 溶液（原液）称取50mg 詹纳斯绿B 溶于5ml Ringer，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。
3. 詹纳斯绿B 溶液（应用液）取1%原液1ml 加入49ml Ringer 溶液, 混匀即可。
现用现配。
四、实验操作1. 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察(1) 取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2 滴詹纳斯绿B 应用染液。
(2) 实验者用牙签宽头在自己口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10～15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。
细胞染色方法总结
Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合 (主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst有hoechest33342和hoechst33258两种 hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测. 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。
但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI 单一染色也可以。
但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。
Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。
JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。
实验十二常用血细胞化学染色
实验十二常用血细胞化学染色Cytochemistry stain for blood cells一、过氧化物酶染色染色原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO),能将底物H202分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。
联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺，后者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，沉淀于细胞质内酶所在的部位。
试剂器材1．1%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中，置棕色瓶内，冰箱保存。
2．亚硝基铁氧化锅饱和溶液在少量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体，至不再溶解为止，置棕色瓶内，冰箱保存。
3．1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。
4．稀过氧化氢溶液1%H2021滴，加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。
5．瑞氏(Wright)染色液。
6．新鲜涂片(骨髓或血片)、染色架、洗耳球、光学显微镜等。
操作步骤1．取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μL，溶液呈淡棕黄色，染色液应临用前配制。
2．在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁氰化钠饱和溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹匀，染色6min。
3．自来水冲洗，待干，用瑞氏染液复染15~20 min。
4．自来水冲洗，待干，用油镜镜检。
注意事顶1．血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。
2．TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90%~95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。
3．H202需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。
涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示H202过浓。
若H202加于血片上不产生气泡，则示无效。
4．染色液pH应为5.5。
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染色结果：
CO 酶活性部位
蓝褐色
心肌、肾小管上皮内颗粒(线粒体) 棕色
阴性对照(可选)：
相同切片入试剂(E)- CO 对照液中，室温孵育 20～60min，其余同上，呈阴性反应。
注意事项：
1、 本染色液适用于冰冻切片，同时应减少切片在室温暴露的时间。
2、 CO 孵育液孵育时间因组织而异.
组成：
名称 试剂(A): CO 孵育液 试剂(B): Lugol 碘液 试剂(C): 海波溶液 试剂(D): CO 分化液 试剂(E): CO 对照
Storage
50ml 4℃ 避光
50ml RT 避光
50ml RT
50ml RT 避光
10ml 4℃ 避光
1份
操作步骤(仅供参考)：
1、冰冻切片，厚 6μm，丌固定。 2、 切片入 CO 孵育液内，室温(20～25℃)孵育 20min。 3、 切片入 Lugol 碘液，孵育 3min。 4、 入海波溶液处理 1min。 5、 入配制好的 CO 分化液，分化 30s。 6、 流水冲洗 3min。 7、常规脱蜡透明，中性树胶封固。
北京雷根生物技术有限公司
细胞色素氧化酶染色液(对苯二铵法)
简介：
细胞色素氧化酶( Cytochrome Oxidase，CO)被认为是线粒体膜固有的酶，在含有大 量线粒体的细胞（如心 肌、肾小管上皮以 及胃壁细胞、肝 细胞）内都具有 高度活性。细胞 色素氧化酶染色液(对苯二铵法)以 N-苯基-对-苯二胺为底物，在有氧存在的情况下，经细 胞色素氧化酶作用可不萘酚生成有色的靛酚蓝，即为 Nadi 反应。