细胞化学染色
细胞化学染色
细胞化学染色细胞化学染色是将形态和功能相结合的细胞科学。
它是在保持完整的细胞形态和细胞结构的前提下,运用化学反应将被检细胞内的各类化学成分和细胞结构及生理活性物质原位地显示。
因而对于探索细胞内的化学成分、生理功能、新陈代谢及细胞生理和病理改变有着重要意义。
血液细胞化学染色的范围一般可分为：蛋白质类（氨基酸、酶)、核酸类、多糖类、脂类、盐类或金属类,采用的方法通常为化学结合和物理溶解及酶-底物反应。
临床评价:1.细胞化学染色的开展,已有数十年的历史。
其在结合细胞形态学的基础上对各类白血病的确诊，对许多血液疾病鉴别诊断中的帮助，对各种良、恶性血液系统疾病疗效和预后估计提供一定的信息。
2.血液系统各种恶性疾病，特别是急性白血病，因其多为早期分化较差的病理细胞增殖,客观上存在着形态变异、畸形发育，即使是有经验的检验人员仅凭细胞形态也难以避免错误诊断的发生。
如将细胞形态和细胞化学染色相结合，能提高急性白血病的诊断和较正确地对其分型及亚型分型，即为急性白血病FAB 分型。
3.近年来，由于细胞免疫学、细胞遗传学、分子生物学和细胞超微结构等迅速发展，进一步推动了细胞化学染色这一领域的进展，并出现了细胞免疫组织化学染色、细胞超微化学染色等更新、更准确的检验方法与手段，对探讨各类血液疾病发病原理和观察治疗反应及预后起了极其重要的作用。
如将细胞免疫化学、细胞遗传学、分子生物学这三者与细胞化学染色及细胞形态学相结合，对各种白血病进行分型，即成为白血病的MICM分型诊断。
4.细胞化学染色通常应用在各种血液系统疾病特别是对各种急性白血病的诊断与鉴别诊断中。
但白血病细胞因其呈高度的异质性和多态性，有时即使是同一类型的白血病也可在细胞形态、细胞化学染色结果、细胞免疫表型及分子生物学等方面存在较大的差异。
所以对各类型白血病作一套较完整的细胞化学是补充了单凭形态对细胞辨认的不足。
因此我们在实际工作中若要对各类型白血病作出比较准确的诊断与鉴别诊断，应尽可能采用多项细胞化学染色或双（多）重染色。
细胞化学染色
细胞化学染色检验前言细胞化学是细胞和化学相结合的一门科学。
细胞化学染色是根据化学反应的原理，应用涂片染色的方法，观察细胞的化学成分及其变化的重要方法。
在病理情况下，血细胞的化学成分可发生改变。
因此，细胞化学染色不仅对研究血细胞的代谢活动、生理功能，而且对生理和病理情况下血细胞的化学成分的变化、各种类型血细胞的鉴别、某些血液病的鉴别诊断、疾病的疗效观察以及发病机制的探讨均有重要意义。
研究血细胞的化学物质较多，如各种酶类、脂类、糖元、铁等。
下面主要介绍血液学中常用的一些细胞化学染色方法。
瑞氏染色法：瑞氏染色液的配制：瑞氏染料（粉）1g纯甲醇60ml将染料放在乳钵内加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解得倒入洁净的玻璃瓶内，剩下未溶解的再加少量甲醇研磨，如此继续操作，直到全部染料溶解及用完甲醇为止。
制配好的染液保存于温室中一周便可应用。
新鲜配制的染液偏碱性，放置后可呈酸性，染液储存愈久染色愈好。
缓冲液的配制及其作用:1% KH2PO4 (即1g KH2PO4+100ml蒸馏水) 30ml1% Na2HPO420ml加蒸馏水至1000mlPH 6.4~6.8过氧化物酶染色一、原理：细胞中的过氧化物酶（POX）分解底物过氧化氢（H2O2）产生新生态氧，后者使联苯胺氧化为联苯胺蓝沉淀而定位于POX活性部位。
二、过氧化物酶染色法染液的配制：（1）联苯胺（Benzidine）0.3g95%乙醇（Ethye alcohol）99ml36%亚硝基铁氰化钠（Sodium Nitroprusside）1ml (0.36g+1ml蒸馏水，置于37℃水浴箱中促溶。
)（2）30%mlml过氧化氢溶液：30%双氧水，吸取一滴约0.05ml放入50ml蒸馏水内，每次用时必须新鲜配制。
三、结果判断：细胞质中有蓝色颗粒的为阳性细胞。
四、临床意义：粒细胞中除早期原粒细胞呈阴性反应外，晚期原粒细胞及以后各阶段粒细胞均呈阳性反应，细胞越成熟反应越强。
细胞化学染色
3．单核细胞系统：除早期原始阶段外皆呈弱 阳性反应。其颗粒细小，弥散分布，可覆 盖核上，有的也可呈阴性反应。
4．正常网状细胞(分化型)及吞噬细胞：可呈 不同程度阳性反应。
5．淋巴细胞、浆细胞、红细胞、巨核细胞系 统等：均为阴性。
6．Auer小体：呈阳性。
【临床意义】
POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(简 称急粒)、急性单核细胞白血病(简称急单)、 急性淋巴细胞白血病(简称急淋)类型的重 要细胞化学方法。
二、铁 染 色(Iron Stain)
【目的和原理】 骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，
其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢， 经稀盐酸处理后而游离，并能在酸性亚铁 氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内 铁也可用此法显示。
【材料】
1.酸性亚铁氰化钾溶液
取200g／L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓 缓滴加浓盐酸，边滴边摇匀，至出现白色沉淀， 再滴加200g／L亚铁氰化钾溶液，亦边滴边摇匀， 至白色沉淀消失为止，备用。
(++)：有较多的铁颗粒和小珠。
(+++)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小 块状。
(++++)：有极多铁颗粒、小珠，有很多 的小块，密集成堆。
(3)细胞内铁：用油镜计数100个中、晚幼红 细胞，记录胞浆中含有蓝色铁粒的细胞(铁 粒幼红细胞)的百分率。并根据细胞内铁颗
粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情
1．急性粒细胞白血病：细胞分化较好时，原 始粒细胞呈阳性反应，阳性率可>30%， 在分化较差的白血病，如AML-M0和未分 化型（AML-M1）的部分病例，原粒细胞 的POX染色也可呈阴性。
2．急性早幼粒细胞白血病时白血病细胞呈强 阳性反应。
细胞化学染色
颗粒 什么关系
POX
如果原粒出现颗粒POX一定阳性吗？NO 如果幼淋出现颗粒POX一定阴性吗？YES
若POX阳性，肯定是髓系的。 有颗粒+POX阴性 做酯酶双染及免疫分型 （存在一部分是POX阴性的白血病，MDS转白，CML急变，HAL ） 无颗粒+POX阴性 +临床及形态 淋系 （1%做免疫分型，M0）
4.异常细胞MPO的变化 ①分化差的原始粒细胞及原始单核细胞MPO可为
阴性，如M2，并不是所有原始细胞均阳性。M5a， 原始单核细胞常阴性。 ②MDS：原始细胞POX常阴性，发育异常的下阶 段粒细胞POX可为阴性。 ③MDS转白，CML转白，HAL，原始粒细胞POX 可为阴性，但不能诊断为M0，因为原始粒细胞不 像幼稚淋巴细胞，且可能为发育异常，并不是分化 差。 ④反之，如果典型原始粒细胞POX阴性，应考虑到 是否为MDS转化而来。
急性白血病类型鉴别：
急性粒细胞白血病：阳性率常≥3%，呈现弥散 状，颗粒状或块状阳性；
急性单核细胞白血病：呈弱阳性（弥散状）或 阴性；
急性淋巴细胞、巨核细胞性白血病：阴性。
急性白血病MPO反应强弱顺序： M3>M2>M6(粒)，M4，M1>M5>HAL
2.嗜天青颗粒（紫红色，非特异性颗粒，阿氏颗粒）：
干 4、复染：E液20min
积分计算
据兰色颗粒所占胞浆面积、颗粒大小、多少及染色强度来判断。 阴性为胞浆内无兰色颗粒。 正常值：正常人积分一般为40－100分
级别
+ ++ +++ ++++
兰色颗粒占 颗粒大小 胞浆面积 （％）
第三章 细胞化学染色
急性单核细胞白血病的POX染色 1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.原始单核细胞，呈阳性；
3.原始单核细胞，呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性
一、过氧化物酶（POX）染色
【临床意义】
1.帮助鉴别急性白血病的类型 2.成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化 活性增高：见于再生障碍性贫血、感染、急性淋巴细
其他为阳性。
第三章 第二节 细胞化学染色
第三章 第二节 细胞化学染色
四、过碘酸-雪夫（PAS）反应
【正常血细胞的染色反应 】
1.粒细胞系统 分化差的原始粒细胞呈阴性，分化 好的原始粒细胞至中性分叶核粒细 胞均呈阳性，并随着细胞的成熟而 逐渐增强；嗜酸性粒细胞中颗粒之 间的胞质呈红色；嗜碱性粒细胞中 的嗜碱性颗粒呈阳性。
2.红细胞系统 有核红细胞及红细胞均呈阴性。 3.单核细胞系统 分化差的原始单核细胞呈阴性，
第三章 第二节 细胞化学染色
（二）α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)染色
【临床意义 】
1.急性单核细胞白血病 单核系细胞多呈阳性，阳性 反应能被氟化钠抑制。
2.急性粒细胞白血病 原始粒细胞呈阴性或弱阳性， 阳性反应不能被氟化钠抑制。
3.急性早幼粒细胞白血病 早幼粒细胞呈强阳性，阳 性反应不能被氟化钠抑制。
第三章 第二节 细胞化学染色
1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.晚幼红细胞，呈阴性； 3.单核细胞，呈弱阳性；4.浆细胞，呈阴性
一、过氧化物酶（POX）染色
帮助鉴 别急性 白血病 的类型
临床意义
是辅助判断急性白 血病细胞类型的首选、 最重要的细胞化学染色
成熟中性 粒细胞过 氧化物酶 活性的变 化
第三章 第二节 细胞化学染色
细胞化学染色
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6、临床意义 （1）正常分布 粒系:早期原粒阴性，晚期原粒及以下各阶段呈 不同程度阳性。 单核系:早期原单阴性，其它阶段皆呈弱阳性。 淋巴、红系、浆细胞、巨核均呈阴性。
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（2）急性白血病的鉴别诊断 幼稚细胞POX阳性率≥3% ：急非淋（AML) 幼稚细胞POX阳性率＜3% ：急淋（ALL)
至9.2，4℃保存！
（3）作用(基质液): 磷酸萘酚钠
5mg
N-N二甲基酰胺 1ml
Tris-Hcl液
4ml
坚固蓝RR盐
5mg
（4）复染液：1%中性红
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3.操作步骤 1、新鲜、干燥的外周血或骨髓涂片（标本片及 对照片）加固定剂作用30秒（染缸），水洗待干； 2、滴加作用液，室温染色15min，水洗待干； 3、1%中性红复染1min
过氧化物酶染色 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 糖原染色 非特异性酯酶染色 特异性酯酶染色 骨髓铁染色
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（一)过氧化物酶(POX)染色
1、原理：
pox
H2O2
O
联苯胺
联苯胺蓝 +
亚硝基铁氰化钠
蓝黑色颗粒
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2.试剂 (1)联苯胺酒精溶液： 取0.3g联苯胺加亚硝基铁氰化钠饱合液（36%）1ml, 再加95%乙醇至100ml，存在于棕色瓶中，可存一年。 (2) 稀过氧化氢（新鲜配制）：取50ml蒸馏水加 30%H2O21滴。 （3）瑞吉氏复染液
细胞化学染色检验
申家辉
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一、概述 二、细胞化学染色的基本方法 三、临床应用
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一、概 述
1、概念： 细胞化学染色是细胞学和化学相结合而成的一门
细胞(组织)化学和免疫化学染色技术
细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。
细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。
细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。
一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。
骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。
以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。
（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。
（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。
（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。
（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。
“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。
细胞化学染色基本步骤
细胞化学染色是一种用于检测和显示细胞内特定分子或结构的方法。
以下是一般的细胞化学染色的基本步骤：
1. 样品固定：将待染色的细胞或组织样本固定在载玻片或培养皿中，以保持其形态和结构的稳定。
2. 渗透处理：对样品进行渗透处理，以增加染料进入细胞内部的能力。
常见的渗透剂有甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。
3. 染色操作：根据所需的染色目标，选择适当的染料或抗体进行染色。
染料可以是特定的染色剂，用于显示细胞核、细胞器或特定分子。
抗体可以用于免疫染色，特异性地标记目标分子。
4. 洗涤：在染色完成后，用缓冲液或溶剂进行洗涤，以去除未结合的染料或抗体。
5. 封片或封装：将染色后的样品加入适当的封片剂或封装剂中，通常使用透明树脂或胶水进行固定，以保护样品并保持其结构。
6. 显微观察：将封好的样品置于显微镜下，并使用适当的放大倍数观察和记录染色结果。
可以使用不同的滤光片或激光进行荧光染色的观察。
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细胞化学染色
定义
快速、准确、科学、 公正、严谨
细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成 的一门科学，是以细胞形态学为基础，结合 运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学 成分(如酶类、酯类、铁、蛋白质、核酸等) 作定性、定位、半定量分析的方法。
基本要求
快速、准确、科学、 公正、严谨
三、酯 酶 染 色
快速、准确、科学、 公正、严谨
根据 酯酶 特异 性高 低分
为
特异性酯酶(氯乙酸AS-D萘酚酯酶)
酸性酯酶(酸性α- 醋酸萘酚酯酶 )
pH值不同
非特异性酯酶
α- 醋酸萘酚酯酶 中性酯酶
醋酸AS-D萘酚酯酶
碱性酯酶( α-丁酸萘酚酯酶 )
快速、准确、科学、 公正、严谨
非特异性酯酶
非特异性酯酶是属水解酶, 由较多的同工酶所组成，在不同的 细胞内存在有不同的同工酶。电泳分析证明人血细胞含有九种 酯酶同工酶，如中性粒细胞含同工酶1、2、7、9；单核细胞和 血小板含有同工酶4、5。淋巴细胞含有同工酶1和6等。其中同 工酶4、5 能被NaF所抑制，所以对染色呈阳性的细胞作NaF抑制 试验可鉴别中性粒细胞和单核细胞。
一、过氧化物酶（POX）染色
【临床意义】
1.帮助鉴别急性白血病的类型 （3）急性单核细胞白血病有时需与组织细胞白血病、 恶性组织细胞病相鉴别，异常组织细胞的过氧化物酶呈 阴性，而白血病性幼单核细胞和单核细胞呈弱阳性。
三、酯 酶 染 色
快速、准确、科学、 公正、严谨
根据 酯酶 特异 性高 低分
为
特异性酯酶(氯乙酸AS-D萘酚酯酶)
• 原位显示细胞成分和结构 • 反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性
基本步骤
快速、准确、科学、 公正、严谨
固定 显示
复染
快速、准确、科学、 公正、严谨
干燥固定
固
蒸汽固定
物理法
化学法
火焰固定
定
液体固定
快速、准确、科学、 公正、严谨
显示金属 沉淀 法源自雪夫 反应偶氮 偶联 法普鲁 士蓝 反应
联苯 胺法
胞就可见强阳性反应。且酶的活性不随细胞分化成熟 而增强。此酶的阳性产物比POX更为特异。
• 单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞等均为阴性，所以在 临床上将AS-DCE染色作为是粒细胞的标志性酶。
快速、准确、科学、 公正、严谨
（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色
【原理】
酯酶 氯乙酸AS-D萘酚
酸性酯酶(酸性α- 醋酸萘酚酯酶 )
pH值不同
非特异性酯酶
α- 醋酸萘酚酯酶 中性酯酶
醋酸AS-D萘酚酯酶
碱性酯酶( α-丁酸萘酚酯酶 )
快速、准确、科学、 公正、严谨
氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色 （AS–DCE）
• 酶主要分布在粒细胞和肥大细胞中。 • 从原粒细胞后期即可见有弱阳性反应，而到早幼粒细
【正常血细胞的染色反应】
1.粒细胞系统 • 随着细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分叶
核粒细胞为强阳性。 • 嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒比
中性粒细胞粗大，有折光。
快速、准确、科学、 公正、严谨
一、过氧化物酶（POX）染色
【正常血细胞的染色反应】
1.粒细胞系统 2.单核细胞系统 原始单核细胞呈阴性，幼稚
偶联
AS-D萘酚
重氮盐
快速、准确、科学、 公正、严谨
（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色
【正常血细胞的染色反应 】
（1）粒系：分化差的原始粒细胞为阴性，分化好的为阳性 • 早幼粒细胞至成熟粒细胞均为阳性 • 嗜酸性粒细胞呈阴性或弱阳性，嗜碱性粒细胞呈阳性 （2）其他细胞主要为阴性反应
快速、准确、科学、 公正、严谨
（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色
【临床意义 】
• 本染色法主要用于鉴别急性白血病类型。 • 1.急性粒细胞白血病和急性单核细胞白血病的鉴别
意义大。
快速、准确、科学、 公正、严谨
急性粒细胞白血病（M2a）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色 1.原始粒细胞，呈弱阳性；2.幼稚粒细胞，呈强阳性；3.中性杆状核粒细胞，呈强阳性
快速、准确、科学、 公正、严谨
急性早幼粒细胞白血病的POX染色 １.原始红细胞，呈阴性；其他早幼粒细胞均呈强阳性
快速、准确、科学、 公正、严谨
急性单核细胞白血病的POX染色 1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.原始单核细胞，呈阳性；
3.原始单核细胞，呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性
快速、准确、科学、 公正、严谨
快速、准确、科学、 公正、严谨
急性淋巴细胞白血病的POX染色 1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；其他原始淋巴细胞均呈阴性
快速、准确、科学、 公正、严谨
一、过氧化物酶（POX）染色
【临床意义】
1.帮助鉴别急性白血病的类型 （2）急性早幼粒细胞白血病有时需与急性单核细胞白血
病鉴别，如果白血病细胞呈过氧化物酶强阳性，应确定 为急性早幼粒细胞白血病。
成熟中性 粒细胞过 氧化物酶 活性的变 化
快速、准确、科学、 公正、严谨
一、过氧化物酶（POX）染色
【临床意义】
1.帮助鉴别急性白血病的类型 （1）POX染色是鉴别急性淋巴细胞白血病和 急性粒细胞白血病的重要指标。
快速、准确、科学、 公正、严谨
急性粒细胞白血病（M2a) 的POX染色 原始粒细胞均呈阳性
探讨发病机制
快速、准确、科学、 公正、严谨
过氧化物酶染色 苏丹黑染色 酯酶染色 过碘酸-雪夫反应 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 酸性磷酸酶染色
铁染色
快速、准确、科学、 公正、严谨
一、过氧化物酶（POX）染色
【原理】
二氨基联苯胺法
H2O2
POX
新生态氧
二氨基 联苯胺
快速、准确、科学、 公正、严谨
一、过氧化物酶（POX）染色
及成熟单核细胞多呈弱阳性，其颗粒细少稀 疏，分布不均。
快速、准确、科学、 公正、严谨
1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.晚幼红细胞，呈阴性； 3.单核细胞，呈弱阳性；4.浆细胞，呈阴性
快速、准确、科学、 公正、严谨
一、过氧化物酶（POX）染色
帮助鉴 别急性 白血病 的类型
临床意义
是辅助判断急性白 血病细胞类型的首选、 最重要的细胞化学染色
复染
快速、准确、科学、 公正、严谨
目的： 使各种细胞能显示出来便于观察。 选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对 比度，即能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化 学染色结果。
快速、准确、科学、 公正、严谨
辅助判断急性白血病的细胞类型
临
床
辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断
应
观察疾病疗效和预后
用