细胞化学染色检验.
细胞化学染色
细胞化学染色检验前言细胞化学是细胞和化学相结合的一门科学。
细胞化学染色是根据化学反应的原理，应用涂片染色的方法，观察细胞的化学成分及其变化的重要方法。
在病理情况下，血细胞的化学成分可发生改变。
因此，细胞化学染色不仅对研究血细胞的代谢活动、生理功能，而且对生理和病理情况下血细胞的化学成分的变化、各种类型血细胞的鉴别、某些血液病的鉴别诊断、疾病的疗效观察以及发病机制的探讨均有重要意义。
研究血细胞的化学物质较多，如各种酶类、脂类、糖元、铁等。
下面主要介绍血液学中常用的一些细胞化学染色方法。
瑞氏染色法：瑞氏染色液的配制：瑞氏染料（粉）1g纯甲醇60ml将染料放在乳钵内加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解得倒入洁净的玻璃瓶内，剩下未溶解的再加少量甲醇研磨，如此继续操作，直到全部染料溶解及用完甲醇为止。
制配好的染液保存于温室中一周便可应用。
新鲜配制的染液偏碱性，放置后可呈酸性，染液储存愈久染色愈好。
缓冲液的配制及其作用:1% KH2PO4 (即1g KH2PO4+100ml蒸馏水) 30ml1% Na2HPO420ml加蒸馏水至1000mlPH 6.4~6.8过氧化物酶染色一、原理：细胞中的过氧化物酶（POX）分解底物过氧化氢（H2O2）产生新生态氧，后者使联苯胺氧化为联苯胺蓝沉淀而定位于POX活性部位。
二、过氧化物酶染色法染液的配制：（1）联苯胺（Benzidine）0.3g95%乙醇（Ethye alcohol）99ml36%亚硝基铁氰化钠（Sodium Nitroprusside）1ml (0.36g+1ml蒸馏水，置于37℃水浴箱中促溶。
)（2）30%mlml过氧化氢溶液：30%双氧水，吸取一滴约0.05ml放入50ml蒸馏水内，每次用时必须新鲜配制。
三、结果判断：细胞质中有蓝色颗粒的为阳性细胞。
四、临床意义：粒细胞中除早期原粒细胞呈阴性反应外，晚期原粒细胞及以后各阶段粒细胞均呈阳性反应，细胞越成熟反应越强。
细胞化学染色检验方法和要求
定义：
细胞化学染色是细胞学和化学相结合的一 门科学。它是以细胞形态学为基础，根据 化学反应的原理、应用涂片染色的方法观 察细胞的化学成分及其变化的重要方法。
各种类型血细胞的化学成分（酶，脂，糖， 蛋白，核酸）,分布及其量不完全相同,在病 理情况下,血细胞的成分可发生改变.
二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）
原理:成熟中性粒细胞内的AKP在PH 9.4~9.6缓 冲
液中能水解基质液中的α-磷酸柰酚，产生α-奈 酚，其与重氮盐偶联，形成不溶性灰黑色偶氮染 料沉淀，定位于酶活性处。
AKP主要存在于中性成熟粒细胞内,其他细胞基 本阴性.
阳性程度：
- —— 胞浆中无紫黑色颗粒 + —— 胞浆中有一层棕黑色不透明或局限地 方 有紫黑色颗粒(约1/4) ++—— 胞浆中颗粒占胞浆1/2或遍布整个胞 浆，但较疏松 +++—— 胞浆中颗粒占3/4，颗粒染色浓 ++++——仅见核影，其余均是黑色
原理： 正常人骨髓中的储存铁主要存在于骨髓
小粒和幼红细胞中。骨髓小粒中的含铁血黄素 称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质 结合不牢，经稀盐酸处理后而游离，并能在酸 性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞 内铁也可用此法显示。根据反应的强弱了解骨 髓中铁的含量。
细胞内铁：中、晚幼红细胞胞浆中有蓝绿色颗 粒,为铁蛋白. 铁粒幼细胞：胞质内有蓝绿色颗粒的幼红细胞. 环铁粒幼红细胞：胞质内有蓝绿色颗粒在6个以 上，并围绕于核周排列成环形者，超过1/2区
4.再障与PNH的鉴别 再障—— NAP增高 PNH —— NAP减低
慢粒与中性粒细胞性类白血病反应的鉴别
三、过氧化物酶染色（POX）
免疫细胞化学染色法的原理
免疫细胞化学染色法的原理免疫细胞化学染色法是一种常用的实验技术，用于检测细胞中特定蛋白质的存在和定位。
其原理基于免疫学和细胞生物学的知识，可以通过以下步骤来解释：1. 抗原抗体反应，首先，我们需要选择一个特定的抗体，该抗体能够与我们感兴趣的蛋白质（即抗原）发生特异性的结合。
这个抗体可以是由动物免疫产生的多克隆抗体或单克隆抗体，也可以是经过重组技术获得的单克隆抗体。
2. 细胞固定，接下来，我们需要将待染色的细胞固定在载玻片上，通常使用甲醛或乙醛进行固定。
固定可以保持细胞的形态结构和蛋白质的空间位置。
3. 渗透化处理，为了使抗体能够渗透到细胞内部，我们需要对细胞进行渗透化处理。
一般常用的方法是使用洗涤剂（如TritonX-100）或酸性溶液（如盐酸）来破坏细胞膜，使抗体能够穿过细胞膜进入细胞内。
4. 抗体结合，将选择的抗体加入到载玻片上的细胞上，抗体会与细胞内的特定抗原结合。
这种抗原-抗体的特异性结合可以帮助我们检测和定位感兴趣的蛋白质。
5. 二抗结合，由于直接观察抗原-抗体结合并不容易，我们需要使用一个与第一抗体结合的二抗体。
这个二抗体通常是由动物免疫产生的，可以与多种不同种类的抗体结合。
二抗体通常被标记上一种可视化信号，如荧光染料或酶标记物。
6. 可视化信号检测，根据实验需要，我们可以选择不同的方法来检测二抗体的存在。
如果使用的是荧光染料，我们可以使用荧光显微镜来观察染色结果。
如果使用的是酶标记物，我们可以添加适当的底物，使其产生可见的色素反应。
通过以上步骤，免疫细胞化学染色法可以帮助我们检测和定位细胞中特定蛋白质的存在。
这种方法在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域具有广泛的应用。
细胞化学染色检验
细胞化学染色检验摘要】细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学。
它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质(酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。
【关键词】血液细胞染色检验过氧化物酶(peroxidase，POX)染色方法有Washburn法、四甲基联苯胺法和改良的Pereira染色法等。
前者曾是最为常用的方法，但由于其底物联苯胺具有致癌性，故现常用后两者，下面分别介绍这两种方法的原理。
四甲基联苯胺法粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，POX能分解 H2O2而释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。
改良的Pereira染色法粒细胞和部分单核细胞中POX能分解H2O2而释放出新生氧，使碘化钾氧化生成碘，碘再与煌焦油蓝作用形成蓝绿色沉淀，定位于酶活性的细胞质内。
1 苏丹黑染色原理苏丹黑B(Sudan black B，SBB)是一种脂溶性重氮染料，能溶解于细胞内的含脂结构(如中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇)中，而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色。
脂类物质在粒细胞中丰富，单核细胞中也有少量。
2 中性粒细胞碱性磷酸酶染色原理中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophilic alkaline phosphatase，NAP)染色的方法有G0mori钙-钴法和Kaplow偶氮偶联法，因为钙-钴法操作较为繁琐且所需时间长，而偶氮偶联法的试剂盒操作方便，染色时间短，故目前国内常用偶氮偶联法。
Kaplow偶氮偶联法成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在pH 9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸萘酚钠底物，释放出萘酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。
不同的底物与重氮盐的组合不同，化学反应过程以α-醋酸萘酚钠为例。
3 酸性磷酸酶染色原理酸性磷酶(acid phosphatase，ACP)存在于细胞的溶酶体颗粒中，有的细胞中酸性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及鉴别诊断。
细胞(组织)化学和免疫化学染色技术
细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。
细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。
细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。
一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。
骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。
以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。
（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。
（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。
（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。
（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。
“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。
细胞化学染色基本步骤
细胞化学染色是一种用于检测和显示细胞内特定分子或结构的方法。
以下是一般的细胞化学染色的基本步骤：
1. 样品固定：将待染色的细胞或组织样本固定在载玻片或培养皿中，以保持其形态和结构的稳定。
2. 渗透处理：对样品进行渗透处理，以增加染料进入细胞内部的能力。
常见的渗透剂有甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。
3. 染色操作：根据所需的染色目标，选择适当的染料或抗体进行染色。
染料可以是特定的染色剂，用于显示细胞核、细胞器或特定分子。
抗体可以用于免疫染色，特异性地标记目标分子。
4. 洗涤：在染色完成后，用缓冲液或溶剂进行洗涤，以去除未结合的染料或抗体。
5. 封片或封装：将染色后的样品加入适当的封片剂或封装剂中，通常使用透明树脂或胶水进行固定，以保护样品并保持其结构。
6. 显微观察：将封好的样品置于显微镜下，并使用适当的放大倍数观察和记录染色结果。
可以使用不同的滤光片或激光进行荧光染色的观察。
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。
试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。
3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。
5、马上用荧光显微镜观看。
观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。
留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。
2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法：直接法原理和操作流程
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法原理和操作流程
一、原理与意义
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法——直接法，是一种荧光抗体染
色法。
该方法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较
高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。
此法每种荧光抗体只能检
查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。
二、操作流程
1、染色：切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧
光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。
2、洗片：倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2 PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。
3、用50%（用0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固，并镜检
拍照。
4、对照染色
①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。
②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血
清（相同）等量混合，如上法处理切片。
结果应为阴性。
为证明此种
染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。
此法结果较二步法稳定。
③类属抗原染色试验，前面已作叙述。
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色的化合物，定位于含有多糖类的胞质中。根据胞质中糖原种类及
含量多少，可呈现粗细不等红色颗粒、块状物或均匀红色。
方法步骤
1. 新鲜干燥的涂片用95％乙醇固定10min，流水冲洗，待干。
2. 加入10g/L过碘酸氧化15～20min，蒸馏水冲洗，待干。
3. 置雪夫染液中37℃(或室温)染色30～60min。 4. 用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用流水冲洗2～3min，待干。 5. 20g/L甲绿复染10～20min。 6. 水洗，待干，镜检。 7. 结果判断：如在胞质中出现弥散状、颗粒状或块状红色为阳性。胞质无 色或无颗粒为糖原阴性。反应强度判断标准如下：
氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。
4. 染色液适宜pH值应为5.5，若pH值 <5.0会出现假阳性结果。 5. 试剂应置于低温暗处，防止光线照射失效。 6. 染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀，否则同 一片子上细胞染色情况不一致。
临床意义
POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(acute myeloblastic leukemia,
AML)、急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia, AMOL)、 急
性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)的重要细胞化学 染色方法。AML时白血病细胞可呈阳性反应, 阳性颗粒一般较多， 较粗大， 常呈局限性分布；ALL时白血病细胞呈阴性反应；AMOL时白血病细胞呈 阴性或弱阳性反应，阳性时颗粒稀少、细小，呈弥散分布。
（1）中性粒细胞的分级标准：
0分 1分 2分 胞质无色。 胞质内呈淡红色，有极少颗粒。 胞质呈红色，厚而不透明，或有少量颗粒。
3分
4分 0分 1分 2分 3分 4分
胞质呈深红色，颗粒较紧密，但尚有空隙。
胞质呈深紫红色，颗粒紧密，无空隙。 胞质内无色。 胞质内呈弥散淡红或有少数细颗粒(<10个)。 胞质内呈弥散较深的红色或有多数细颗粒(≥10个)。 胞质内有较粗颗粒或少数小块状红色物质。 胞质内呈多数粗颗粒并有大块红色物质。
胞呈阴性反应。
2. 白血病类型的鉴别：AML原始粒细胞与早幼粒细胞呈阴性或弱阳 性反应，以弥漫性反应为主；ALL原、幼淋巴细胞多呈块状阳性 反应，也有少数呈阴性反应；AMOL原、幼单核细胞呈强阳性反 应，其颗粒细小，弥散分布。
3. 直接用流水冲洗，待干，再用瑞氏染液复染15～20min。
4. 流水冲洗后，待干，用油镜镜检。 5. 结果判断 在细胞质中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性反应。 阴 性：无颗粒。
弱阳性：颗粒小，分布稀疏。
阳 性：颗粒略粗，分布较密集。 强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。
注意事项
1. 涂片应新鲜制作、厚薄适宜。 2. TMB 配制在85％～88％的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90 ％～95％乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞 内渗入而使显色反应减弱或消失。 3. 过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂 片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示过
（4）巨核细胞的分级标准：
1分
2分 3分 4分
少量糖原包涵体，常定位于核膜附近。
中等量糖原包涵体，定位于核膜处或分散在胞质中，约占胞质的1/3。 大量糖原包涵体分散于胞质中，占胞质1/2。 糖原包涵体充满整个胞质。
注意事项
1. 所用染色缸及器具应十分清洁、干燥。 2. 雪夫(Schiff)染液应避光密封冰箱保存，一般4℃下可保存6个月， 试剂应为无色，变红则失效。 3. 10g/L过碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用。氧化时间要准确，以 20min为宜。
4. 染色时间和温度应相对恒定，一般以37℃染色30min最适宜。
5. 染色好的涂片应及时检查，以免褪色。 6. 偏重亚硫酸钠易于分解，过碘酸易潮解，应密封干燥保存。 7. 碱性品类型的鉴别：红血病、红白血病、缺铁 性贫血、重型地中海贫血及骨髓增生异常综合征时幼红细胞呈强 阳性反应；溶血性贫血、急慢性白血病、淋巴瘤时幼红细胞呈阴 性反应或弱阳性反应；再生障碍性贫血、巨幼细胞贫血时幼红细
过碘酸-雪夫反应(PAS)
目的: 了解过碘酸-雪夫反应的原理、方法、注意事项和临床意义。
原理: 过碘酸-雪夫反应(Periodic acid Schiff reaction, PAS)又称糖 原染色，其原理为过碘酸可将细胞内含有1,2-乙二醇基的糖类氧化 而产生双醛基，后者与雪夫(Schiff)染料作用，使无色品红变为紫红
蓝。四甲基联苯胺蓝又可与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝 色颗粒，定位于细胞质酶所在部位。若无亚硝基铁氰化钠，四甲基联苯胺蓝则
自我脱氢氧化成棕色的四甲基苯醌二胺沉着于酶所在部位。
方法步骤
1. 取0.1％TMB乙醇溶液1ml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μl，溶液呈淡 棕黄色。染色液应在临用前配制。 2. 在新鲜干燥的涂片上，加0.1％TMB-亚硝基铁氰化钠饱和溶液的混合试 剂0.5ml，放置1min后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，吹匀，染色6min。
（2）淋巴细胞分级标准：
（3）幼红细胞的分级标准：
0分
1分 2分 3分 4分 0分
胞质内无色。
胞质内有少数分散细小颗粒或浅红色弥漫物质。 胞质中有1～2个浓的颗粒或胞质呈弥散红色。 胞质中有较粗红色颗粒直至小块红色物质。 胞质中有粗大红色块或有粗大致密的紫红色颗粒。 胞质内无红色颗粒，但仍呈弥散性着色，此系其它多糖类物质。
细胞化学染色检验
一、过氧化物酶染色（POX)
目的: 了解过氧化物酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。
原理(四甲基联苯胺法）: 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物 酶(peroxidase, POX)，POX能将底物四甲基联苯胺
(tetramethylbenzidine,TMB)氢离子传递给H2O2，使之氧化为四甲基联苯胺