《酶工程实验》word版

实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的

了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。二、实验原理

H

2O

2

被过氧化氢酶分解出H

2

O和O

2

，未分解的H

2

O

2

用KMNO

4

在酸性环境中滴

定，根据反应前后H

2

O

2

的浓度差可求出反应速度。

本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km

三、实验器材

1.锥形瓶100～150ml（×6）。

2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。

3.温度计（0～100℃）。

4.微量滴定管5ml（×1）。

5.容量瓶1000ml（×1）。

四、实验试剂

1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）

取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。

2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。

3、0.02mol/L KMnO

4：称取KMnO

4

（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，

2d后过滤，棕色瓶保存。

4、0.004mol/L KMnO

4

：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓

硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO

4

滴定至微红色，水浴，加热

至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO

4

的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。

5、0.05 mol/L H

2O

2

：取30% H

2

O

2

23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度

（约0.2mol/L），用标准KMnO

4

（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成

0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H

2SO

4

2.0ml，用0.004mol/L

KMnO

4

滴定至微红色）。

6、25% H

2SO

4

五、操作

取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：

表一过氧化氢酶米氏常数的测定

管号

试剂

012345

0.05mol/L H

2

O

2

/ml

蒸馏水/ml

酶液/ml

9.5

0.5

1.00

8.50

0.5

1.25

8.25

0.5

1.67

7.83

0.5

2.5

7.0

0.5

5.00

4.50

0.5

先加好0.05mol/L H

2

O

2

及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加 2.0ml 25%硫酸终止反应，充分混匀。用

0.004mol/L KMnO

4

滴定各瓶中剩余的H

2

O

2

至微红色，记录消耗的KMnO

4

体积。六、计算

分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。

[S]=c1V1/10

式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）；

c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；

V

1

：H

2

O

2

体积（ml）；

10：反应的总体积（ml）；

υ：反应速度（m mol/min）；

c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；

V

2

：KMnO

4

体积（ml）；

以1/υ对1/[S]作图求出Km。

实验二酶促反应中初速度时间范围测定

一、实验目的

1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；

2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。

二、实验原理

酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。

酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。

利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。

酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。

要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。

三、实验试剂与器材

1.试剂

（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）

（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）

取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A

在0.6～0.7之间。

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