内含肽
某大学生物工程学院《普通生物化学》考试试卷(5986)
某大学生物工程学院《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（140分，每题5分）1. 维生素B1的辅酶形成是TPP，在糖代谢中参与α酮酸的氧化脱羧作用。
（）[河北师范大学研]答案：正确解析：B族维生素常以辅酶和辅基的形成存在，参与物质代谢。
维生素B1的辅酶形成为TPP，是涉及糖代谢中羧基碳的合成与裂解的辅酶，是α酮酸脱羧酶、转酮酶及磷酸酮酶的辅酶，在α裂解反应、α缩合反应及α酮酸转移反应中起重要作用。
2. 所有的原核细胞都是单倍体，而所有的真核细胞都是二倍体。
（）答案：错误解析：3. 脂类化合物都含有甘油和脂肪酸。
（）[华中农业大学2017研]答案：错误解析：酯类化合物是指酸与醇起反应生成的一类有机化合物，是油、脂肪、类脂的总称。
脂肪是由甘油和脂肪酸脱水合成而形成的。
4. 真核生物成熟mRNA的两端均带有游离的3′OH。
（）答案：正确解析：成熟的mRNA两端都带有游离的3′OH，防止被降解。
5. α磷酸甘油脱氢生成的FADH2经线粒体内膜上的复合体Ⅱ进入呼吸链。
（）答案：错误解析：复合体Ⅱ的主要成分是琥珀酸脱氢酶，α磷酸甘油不能作为它的底物，因此不能通过它进入呼吸链，而是通过内膜上的其他组分进入呼吸链。
6. L氨基酸氧化酶是参与氨基酸脱氨基作用的主要酶。
（）答案：错误解析：氨基酸脱氨基作用主要通过联合脱氨基，参与氨基酸脱氨基作用的主要酶是转氨酶和L谷氨酸氧化酶。
7. NADH脱氢酶是指以NAD＋为辅酶的脱氢酶的总称。
（）[华东师范大学2008研]答案：错误解析：NADH脱氢酶又称为NADH脱氢酶复合物，是一种位于线粒体内膜催化电子从NADH传递给辅酶Q的酶，并不是指以NAD＋为辅酶的脱氢酶的总称。
8. 内含肽仅存在于单细胞生物。
研究生入学考试生物化学(蛋白质)历年真题试卷汇编10
研究生入学考试生物化学（蛋白质）历年真题试卷汇编10(总分：180.00，做题时间：90分钟)一、判断题请判断下列各题正误。
(总题数：30，分数：60.00)1.(南开大学2008年考研试题)甘氨酸分子的分子量为75道尔顿。
（分数：2.00）A.正确√B.错误解析：2.(四川大学2007年考研试题)胶原(蛋白)(collagen)是动物结缔组织最丰富的一种蛋白质，它是由原胶原蛋白分子组成。
原胶原蛋白是一种具有左手超螺旋结构的蛋白。
每个原胶原分子都是由3条特殊的右手螺旋的多肽链芹手旋转形成的。
（分数：2.00）A.正确B.错误√解析：解析：胶原(蛋白)(collagen)是动物结缔组织最丰富的一种蛋白质，它是由原胶原蛋白分子组成。
原胶原蛋白是一种具有右手超螺旋结构的蛋白。
每个原胶原分子都是由3条特殊的左手螺旋的多肽链右手旋转形成的。
3.(四川大学2007年考研试题)肌红蛋白(myoglobin)是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，是肌肉内储存氧的蛋白质，神经质氧饱和曲线为S曲线型。
而血红蛋白(hemoglobin)是由含有血红素辅基的4个亚基组成的结合蛋白，血红蛋白负责将氧由肺运输到外周组织，它的氧饱和曲线为双曲线型。
（分数：2.00）A.正确B.错误√解析：解析：肌红蛋白(myoglobin)是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，是肌肉内储存氧的蛋白质，神经质氧饱和曲线为双曲线型。
而血红蛋白(hemoglobin)是由含有血红素辅基的4个亚基组成的结合蛋白，血红蛋白负责将氧由肺运输到外周组织，它的氧饱和曲线为S曲线型。
4.(四川大学2006年考研试题)谷胱甘肽中的所有肽键都是一个氨基酸的α氨基和另一个氨基酸的α一羧基经缩合而形成的。
（分数：2.00）A.正确B.错误√解析：解析：谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物。
半胱氨酸与甘氨酸间的肽键是由甘氨酸的α-氨基和半胱氨酸的α一羧基缩合而成的；而谷氨酸和半胱氨酸间的肽键是由半胱氨酸的α一氨基和谷氨酸的γ-羧基缩合而成的。
某大学生物工程学院《普通生物化学》考试试卷(5820)
某大学生物工程学院《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（140分，每题5分）1. 真核生物中不存在反转录现象。
（）答案：错误解析：反转录现象是一种普遍现象，不仅存在于反转录病毒的生活史之中，也存在于原核生物和真核生物中。
真核生物中端粒酶催化的反应就是反转录反应。
2. 胰高血糖素可激活磷酸果糖激酶2（PFK2）。
（）[中国科技大学2008研]答案：错误解析：胰高血糖素可抑制磷酸果糖激酶2（PFK2）。
3. 核苷酸从头合成途径的起始物都是PRPP。
（）答案：错误解析：嘌呤核苷酸合成的起始物是PRPP；嘧啶核苷酸的合成一开始没有核糖参加。
4. 肾上腺素既可以产生“快反应”，又可以产生“慢反应”。
（）答案：正确解析：cAMP可以通过PKA激活CREB改变某些基因的表达而产生慢反应。
5. 葡萄糖通过脱氢可异构为果糖。
（）[中山大学2018研]答案：错误解析：6. 生物体的DNA复制都是双向对称的，没有例外。
（）[中国科学院研]答案：错误解析：生物体的DNA复制并不都是双向对称复制的，如枯草杆菌的DNA复制就是双向不对称复制的，同样也有少部分原核生物DNA是进行单向复制的。
7. 线粒体内膜上的复合体I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中均含有FeS蛋白。
（）答案：错误解析：复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均含有FeS蛋白但复合体Ⅳ缺乏FeS蛋白。
8. 磷脂是中性脂。
（）答案：错误解析：磷脂不是中性脂，中性脂通常是指三酰甘油，因其分子中的酸性基结合掉了，所以是中性的，称为中性脂。
9. 色氨酸操纵子中含有衰减子序列。
（）[华南理工大学2005研]答案：正确解析：色氨酸操纵子的转录调控除了阻遏系统以外，还有弱化子系统。
10. DNA复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制开始，它即进行下去，直到整个复制子完成复制。
基因工程05幻灯片
⒉ 表达形式
直接转录并翻译出目的基因ORF对应的氨基酸序列，即 表达出完整的目的蛋白。
目的基因以融合蛋白的形式进行表达。
pKK223-3
终止子： 5SrRNA 区域（rrnB 操纵子区域），rrnBT 和 rrnBT2 终止子（ 防止通读）。
受 lac 阻抑物调控， 1-5mM IPTG 诱导。 可直接表达任何含 RBS 和 ATG 的基因，若无 RBS，其
当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序 列组成的融合蛋白。?
GST是来源于血吸虫的小分子酶（26kDa），在E.coli易
表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有 很强的结合能力。利用这些性质可用来分离纯化表达的 目的蛋白。
图5-4 GST融合表达载体pGEX图谱
分离纯化表达的目的蛋白
几丁质结合域
多克隆位点 克隆、表达
几丁质
内含肽1 目的蛋白 过柱、洗涤
pH7，室温，自然水解
洗脱 目的蛋白
产物纯化
在pTWIN1中，当外源目的基因插入多克隆位点并带有自 身的翻译终止密码子时，可表达出目的蛋白N末端带有 CBD和intein1的融合蛋白（图5-6）。
表达该融合蛋白的细胞抽提物流过几丁质树脂层析柱时， 融合蛋白就被吸附在树脂上，通过洗涤可将其他蛋白去 除。
启动子；噬菌体的PL启动子。(注意：表示方法）
⑵ 终止子
转录会受到模板RNA序列结构的影响，当遇到颈环 结构时转录便会停止，或遇到ρ因子介导的终止信 号转录也会停止。
⑶ 核糖体结合位点
转录出来的mRNA可在宿主细胞的翻译机器作用下翻 译出目的蛋白。
细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效的核糖体结 合位点以及其中的Shine-Dalgarno序列（SD序列）， 从而启动邻近其下游的翻译起始密码子的蛋白质翻 译。
第一章蛋白质结构基础第三节
通常出现的障碍
①中间体通过外露疏水基团的聚合 ②不正确二硫键的形成 ③脯氨酸残基的异构化 为了清除这些障碍，细胞产生了一些特殊蛋 白质来帮助蛋白质正确折叠，如伴侣蛋白、 二硫键异构酶等
4.帮助正确折叠的蛋白质和酶
(1) 分子伴侣(molecular chaperone) (2) 帮助正确二硫键形成的酶 (3) 肽酰脯氨酰异构酶
N
C
β链以反平行的上-下方 式顺序连接，最后一股连 与第一股链以氢键结合， 形成一个类似桶状的结构
平行β螺旋折叠
1993年在细菌果胶酶的晶体结构中首次发现。这些β螺旋结构中， 多肽链卷曲折叠为由β链与环链区相间构成的宽松螺旋
双层螺旋
钙离子 钙离子 钙离子
每圈螺旋由2股β链与2 段环链区相间构成，在 形成结构域时这一基本 结构单位重复3次，产生 一个右手缠绕螺旋结构， 中间形成疏水内核
最大限度满足氢键的形成而达到的能量最低状态 。
1．蛋白质折叠的热力学基础
(1)Anfinsen提出 “热力学假说”
认为多肽链的氨基酸顺序包含 了形成其热力学上稳定的天然 构象所必需的全部信息，即最 终的天然构象是由氨基酸序列 决定的。不需要别的任何信息、 诱导或能量，蛋白质就可自发 折叠成天然构象，折叠过程是
第三节 多肽链的生物合成与折叠
• 蛋白质是具有高度组织、结构极复杂的生物大分子 • 了解这种复杂蛋白质结构的形成机理，对于以设计
和构建新型蛋白质为目标的蛋白质工程的战略性考 虑和具体途径选取，都有十分重要的意义
一、多肽链的生物合成
• 自然界中的蛋白质可以由几十个氨基酸组成，也 可以由上千个氨基酸组成
(1) 分 子 伴 侣
(2) 帮助正确二硫键形成的酶
蛋白质剪接研究进展
蛋白质剪接研究进展任元涛;方宏清;周长林;陈惠鹏【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2010(21)4【摘要】蛋白质剪接是一个翻译后自催化加工过程,它不需要酶或其他辅助因子的参与.在这个过程中,前体蛋白的Intein(内含肽)被切离,其两侧的Extein(外显肽)连接在一起.Intein按结构可分为经典Intein和微型Intein,其中的经典Intein包括Hint结构域和中间的归巢内切酶结构域(该结构域在微型内含肽中不存在).蛋白质剪接及其他具有Hint结构域的蛋白加工过程的起始步骤是N-S/O酰基重排反应,该反应是由Hint结构域催化的;Intein的剪接还分为顺式剪接和反武剪接,通过对Intein进行改造,可以阻断剪接过程,但不影响N端肽键或C端肽键的断裂;通过筛选突变体,可以获得温度敏感型、pH敏感型或小分子诱导型的内含肽.这些研究促进了Intein在多肽制备及其它方面的应用.【总页数】6页(P575-580)【作者】任元涛;方宏清;周长林;陈惠鹏【作者单位】中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071【正文语种】中文【中图分类】Q51;Q71【相关文献】1.蛋白质剪接在蛋白质研究和蛋白质工程中的应用 [J], 戴旭东;孟清;刘相钦2.钯配合物对结核杆菌RecA intein蛋白质剪接的抑制作用 [J], 刘嬿;吴芩;郑玉船;刘扬中3.蛋白质剪接及在蛋白质工程中的应用 [J], 赫冬梅;钱凯先;沈桂芳4.定向进化后Cne PRP8蛋白质内含子的剪接机理研究 [J], 李淑梦;李曼;孟清5.蛋白质剪接和蛋白质内含子 [J], 黄仕和因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
第11章 蛋白质的生物合成(共96张PPT)
携带Met的tRNA有两种：
甲硫氨酸tRNAm：tRNAmMet 甲酰甲硫氨酸tRNAf：tRNAfMet
甲酰FH4
蛋白质生物合成：
原核细胞以fMet- tRNAf为起点； 真核细胞以Met- tRNAm为起点
甲酰基转移酶
甲酰甲硫 氨酰tRNAf
（2）起始
1 核糖体大小亚基分离 2 mRNA在核糖体小亚基定位结合 3 起始氨基酰-tRNA与起始密码子结合 4 核糖体大亚基结合，形成70S起始复合物
内含肽与外显肽基因进行同步转录和翻译，当翻译形成蛋白质前体 后，内含肽具有自我催化功能，可从蛋白质中自体切除，形成成熟 的具有活性的蛋白。
内含肽剪接是自我催化，机制不详。
2．二硫键的形成
mRNA中没有胱氨酸的密码子，而不少蛋白质都含有二硫 键，这是蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的。
核糖体亚基
rRNAs
蛋白
RNA的特异顺序和功能
细菌
70S 50S 23S=2904b 31种(L1-L31）含CGAAC和GTψCG互补
2.5×106D
5S=120b
66%RNA 30S 16S=1542b 21种(S1-S21) 16SRNA(CCUCCU)和S-D
顺序(AGGAGG)互补
哺乳动物
一级结构的核苷酸序列。 含量少，占总RNA的5%，容易降解。
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与蛋白质合成的正确起始有关。 避免mRNA被核酸酶降解，增强其稳定性。
遗传密码子（genetic codon）
mRNA分子中，从5’-3’ 每三个相邻的核苷酸组成的三联体，代表某个氨基酸或 其它信息，称为遗传密码子，也称三联体密码子。
U G AC
2. tRNA的功能
分子遗传学名词解释
一、名词解释1、结构基因（Structural gene）：可被转录形成mRNA，并进而翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。
2、调节基因（Regulatory gene）：指某些可调节控制结构基因表达的基因，合成阻遏蛋白和转录激活因子。
其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。
3、基因组(genome)：基因组（应该）是整套染色体所包含的DNA分子以及DNA分子所携带的全部遗传指令。
或单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA 或RNA。
4、C值悖理(C-v a l u e p a r a d o x)：生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位及复杂性之间无严格的对应关系，这种现象称为C值悖理(C——value paradox)。
N值悖理（N-v a l u e p a r a d o x）：物种的基因数目与生物进化程度或生物复杂性的不对应性，这被称之为N（number of genes）值悖理(N value paradox)或G（number of genes）值悖理。
5、基因家族(gene family)：由同一个祖先基因经过重复(duplication)与变异进化而形成结构与功能相似的一组基因，组成了一个基因家族。
6、孤独基因（orphon）：成簇的多基因家族的偶尔分散的成员称为孤独基因（orphon) 。
7、假基因(pseudogene): 多基因家族经常包含结构保守的基因，它们是通过积累突变产生，来满足不同的功能需要。
在一些例子中，突变使基因功能完全丧失，这样的无功能的基因拷贝称为假基因，经常用希腊字母表示8、①卫星DNA（Satellite DNA）：是高等真核生物基因组重复程度最高的成分，由非常短的串联多次重复DNA序列组成。
②小卫星DNA(Minisatellite DNA) ：一般位于端粒处，由几百个核苷酸对的单元重复组成。
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内含肽生物体本身就是一个神秘而精密地高效运作的机器。
大到各系统之间，小到每个细胞，无一不展示着生命的神奇，他们之间的配合是那样的天衣无缝。
继内含子的自我剪接功能发现之后，第一个内含肽——命名为Sce VMA1 发现了，它的发现使内含肽陆续在各种生物中发现，它们在单细胞真核生物、真细菌、古细菌、噬菌体和病毒的基因组中均有分布. 自我剪接机制的发现为蛋白质工程提供方便，尤其是对蛋白质的提纯方面，是一个开创性的突破。
与传统的蛋白质提纯相比存在许多优势，成本低而且快捷。
下面对内含肽的结构与功能做一些简单的介绍。
1内含肽的性质1.1内含肽的定义：内含肽intein是位于宿主蛋白质中的一段插入序列，前缀in一取自inventing, 后缀tein一取自protein。
与内含肽相对应的另一专用术语是外显肽。
内含肽基因不是一个独立的, 必须插人于外显肽基因才能复制转录，可从前体蛋白中切除并将两侧外显肽连接起来成为成熟蛋白质。
其对应的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白对应的核酸序列之中，与宿主蛋白基因存在于同一开放阅读框架(open reading frame，ORF)内，并与宿主蛋白质基因进行同步转录和翻译，当翻译形成蛋白质前体后，内含肽从宿主蛋白质中切除，从而形成成熟的具有活性的蛋白。
1.2内含肽结构和种类1.2.1结构被人们公认的标准内含肽的结构模体为：N端剪接区+中部归巢核酸内切酶区域+ C剪接区域。
两端剪接区参与蛋白质的剪接，中部区域参与蛋白质归巢过程，少数内含肽不含核酸内切酶区域。
全功能型内含肽包括8个保守区或基序，一般由244～1650个氨基酸碱基组成，大部分在500个氨基酸残基左右。
自导引归巢核酸内切酶将剪接功能区分为含有A和B保守区的N端和含有G和F的C端功能区。
从N端开始到C端依次为A、B、C、D、E、H、F、G，其中C、D、E、H属于自导引归巢核酸内切酶家族。
微型内含肽均带有A、B、F、G保守区，一般由128～1309个氨基酸残基组成，大部分为160个左右氨基酸残基自导引归巢核酸内切酶(Homing endonuclease)活性在识别序列和功能上与核酸内含子(Intron)的自导引归巢核酸内切酶类似，具有位点特异性，可以在无Intein等位基因的双链DNA位点定点切割，引起Intein的插入。
N端和C端的序列高度保守；绝大多数内含肽均以Ser／Cys作为N端起始氨基酸，以Asn作为C端末位氨基酸，包含了剪接过程的所有信息.。
仅有两种内含肽的C端为Gin。
90％的内含肽c端的倒数第二个残基为His，其作用是辅助相邻的末位Asn环化天冬酰胺的环化是内含肽剪接过程中关键的一步，其过程是不可逆的。
1.2.2种类：从内含肽的内部有无自导引归巢核酸内切酶结构域，可将内含肽分为2种类型。
一种是全功能型内含肽(maxi—intein)，具有蛋白剪接活性和自导引核酸内切酶序列(homingendonuclease)；另一种是微型内含肽(mini—intein)，只有蛋白剪接活性。
其中自导引归巢核酸内切酶结构域的缺失在SceVMAI内含肽、SspDnaB内含肽及MtuRecA内含肽中不影响蛋白剪接的活性，在PspPol—I内含肽中则可导致剪接活性的缺失。
在天然状态下MxeGyrA中则直接形成微型内含肽，并不影响剪接活性根据其的存在形式，分为整体内含肽和分离内含肽。
前者的两个剪接区域共同存在于同一多肽片段上，后者的两个剪接区域分裂成两份或者更多片段，存在于不同的多肽片段上，所以成为分离内含肽。
整体内含肽进行顺式剪接作用，分离内含肽进行反式剪接作用。
内含肽具有蛋白质和核酸两种水平上的含义，指插入宿主蛋白质中的多肽序列和对应的核苷酸序列。
反式剪接的是一种特殊的剪接通常发生在微小内含肽之间按。
这个微小内含肽的N端和C端剪接结构域的基因被750kb的基因组序列分开，且分别位于相反的DNA链上。
1.3内含肽的剪接作用机制：内含肽剪接是一个快速、高效的反应过程，前体蛋白在细胞中几乎分离不到。
反应亦不需要任何辅助因子、酶和ATP能量，其催化结果是将内含肽两侧的外显肽通过肽键连接成成熟的天然肽。
基于剪接位点氨基酸残基的化学性质以及带分支的剪接中间产物分子的发现，人们提出了多种假说来描述这一反应过程。
目前被普遍接受的剪接机制可以拆解为以下四步（1)N—x酰基转移(X=0，s) 内含肽起始氨基酸Ser／Cys的侧链基团一OH／一SH向前一位氨基酸残基的羰基发动亲核攻击，产生N一0或N—s 的酰基重排，打破原来的肽键而代之以(硫)酯键，将N一外显肽转移到内含肽第一个残基的侧链上。
在中性pH条件下，酰胺一硫酯平衡通常是有利于酰胺键形成的。
但是，含有内含肽的前体蛋白的晶体结构显示，位于上游剪接点的肽键在构象能级上处于不利的地位。
用其他氨基酸残基替代内含肽N端的SedCys会完全阻断该剪接位点肽键的断裂。
(2)转酯：内含肽N端的(硫)酯键在C端外显肽首位氨基酸Cys／SedThr 侧链一OH／一SH基团的亲核替代作用下发生断裂，将N．端外显肽序列从内含肽的N端转至C端外显肽起始氨基酸侧链上，形成分支中间体。
该反应在碱性条件下(pH9—10)可发生逆转，由分支中间体变回线性前体。
(3)Asn／Gln环化Asn的侧链基团一N 对其自身的羰基发动亲核攻击，使Asn形成氨基琥珀酸五元环结构，同时内含肽与C端外显肽之间的肽键断裂。
在此步反应中，内含肽被释放出来。
与前几步反应不同的是，Asn／Gln的环化基本上是不可逆的。
若用其他氨基酸取代Asn／Gln，则会完全阻断内含肽C端肽键的裂解反应，但并不影响上步反应中(硫)酯键中间产物的形成。
内含肽C端倒数第二位的His可以辅助与之相邻的Asn的环化，其突变也会影响C端肽键的裂解反应。
值得注意的是，前两步反应似乎并不是第三步C端肽键的裂解反应必要前提。
因此可采用将靶蛋白直接与内含肽C端融合的方法进行蛋白质的纯化和重组。
（4)外显肽的连接连接的两个外显肽的(硫)酯键自发进行的转酰基反应，以更稳定的酰胺肽键取代(硫)酯键，将N端C端外显肽用天然肽键连接起来。
2.内含肽在蛋白质工程中的应用：内含肽序列加上C端外显肽的第一个氨基酸残基包含了蛋白剪接的全部信息，甚至可以介导非“原配”的外源蛋白质的剪接。
内含肽与上游和下游的外显肽序列之间几乎没有同源性，所以，如果外源目的蛋白替换天然外显肽，内含肽仍然可以保持剪接活性。
但是利用好这一特点对蛋白质人工剪接需要考虑一些影响因素：外源蛋白及剪接位点附近氨基酸残基的变化、表达宿主的不同以及反应条件(温度、pH、诱导试剂)的不同。
合理地利用这些影响因素可以有效地进行剪接控制。
2.1.目的蛋白的分离和纯化内含肽具白切割特性的这种特性而实现目标蛋白与亲和标签分离的目的的。
内含肽在蛋白质纯化中的应用修饰后(位点特异性突变)的内含肽经诱导能够介导N端或C端单侧肽键断裂。
首先将编码亲和标签、内含肽及目标蛋白的基因序列连接在一起，在合适的宿主系统中表达出一个标签-内含肽-目标蛋白的三联体，利用修饰后的内含肽构建的蛋白纯化载体可以将目的蛋白直接融合表达于内含肽的N端或C端，几丁质结合域(chitin binding domain，CBD，5kDa，环状芽孢杆菌)融合表达于内含肽的另一端或内部。
当这个“三元”融合蛋白复合物流经结合有几丁质的亲和纯化柱时，再利用固定在树脂上的配体吸附三联体的标签而截留融合蛋白，随后在某些简单的理化因素作用下(如pH、温度的变化或者巯基化合物的加入)该三联体从内含肽的N一端或者C端端发生白切割释放目标蛋白，而此内含肽与CBD的复合物结合在亲和纯化柱上，目的蛋白直接洗脱下来。
传统的亲和纯化方式是指利用基因融合技术将亲和标签和目标蛋白进行融合表达质，再依靠亲和标签与固定化的配体之间的特异性吸附作用实现目标蛋白的分离纯化。
通常情况下，通过亲和层析得到的融合蛋白，需再经过蛋白酶的水解用移除亲和标签以得到纯化的目标蛋白质。
在实验室规模的应用中，亲和纯化方式有着简单而方便的优点，但也存在着一些缺陷。
一方面，为了消除亲和标签常常需要外加蛋白酶。
尽管设计之初在融合标签与目的蛋白质之间引入了能够被蛋白酶特异性识别并切割的连接片段，但仍然存在着目标蛋白质被意外切割的情况：再者，后期对蛋白酶的清除过程以及蛋白酶本身较高的价格也增加了蛋白质纯化的成本。
另一方面，亲和树脂及缓冲液的高制造成本也进一步加大了蛋白质纯化的代价，而在火规模的生产应用中，成本因素往往是必须考虑的一个重要方面。
以内含肽为基础的蛋白纯化技术的优越性在于：不需要使用昂贵的蛋白酶进行蛋白裂解；裂解仅发生在剪接位点，与目的蛋白上的蛋白酶敏感位点无关，避免了蛋白酶对目的蛋白的降解；蛋白纯化和内含肽活性的诱导均可直接在亲和纯化柱上进行；最为重要的是，内含肽介导的蛋白质纯化不会对蛋白质的生物学活性产生影响2.2内含肽介导的蛋白连接(intein—mediated proteinligation,IPL)。
通过改变裂解条件以及对内含肽进行适当修饰，可以生物合成c端带有硫酯键或N端带有半光氨酸的蛋白质分子。
两种蛋白质混合以后，硫酯键和半光氨酸利用“自然化学连接”(native chemical ligation)的原理进行自发的连接反应，在硫酯和半光氨酸之间形成肽键，从而将两种蛋白质连接起来。
自然化学连接是从蛋白质半合成研究中发展起来的技术，其基本原理是，C端带有硫酯的合成肽与N端带有半光氨酸的合成肽或蛋白质混合后，硫酯和半光氨酸之间会发生高效的化学选择性反应，形成的硫酯键将两个蛋白质分子连接起来，随后的S- N的酰基重排将硫酯键转变为肽整个过程除了没有发生Asn的环化以外，与内含肽的作用机理基本一致。
但是，自然化学连接法不能在细胞中表达C末端硫酯蛋白，而且固相合成的肽链长度也有限2.3断裂型内合肽介导的蛋白质环化环化蛋白质具有3个明显的特性：①提高稳定性和活性，这是由于环化的蛋白质可以减少非折叠状态的构象熵值；②折叠速度快，这是因为其减少了折叠途径的数目的缘故；③对N端和C端特异性的蛋白酶具有抗性，因此能改善在体内的稳定性。
由于以上特性，环化蛋白质在蛋白质工程和医药工业中备受重视。
以IMPACT～TWIN(NEB公司产品)和SICLOPPS为代表的2种载体分别被构建，用于体外和体内环化蛋白。
IMPACT一rWIN用于表达“N端内含肽一靶蛋白一C端内含肽”形式的融合蛋白。
在体外纯化后，经pH及巯基诱导切割此产物产生N端的半胱氨酸和C端的巯酯键，在低浓度下有利于靶蛋白分子内末端连接反应形成环状分子，而在高浓度下则促进分子之间末端的连接，从而产生串联的多聚产物，然后通过内含肽介导的连接方式(intein—mediatedproteinligation，IPL)由N端半胱氨酸攻击C端巯酯键。