单克隆抗体 PPT课件

• 单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物 活性单一、与抗原结合的特异性强，广泛应用于 生物学和医学研究领域：
• 1.作为亲合层析的配体 • 2.作为生物物治疗的导向武器 • 3.作为免疫抑制剂 • 4.探针 • 5.作为医学检验试剂
1.免疫原的制备 ：
• 完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和 蛋白质等分子量大于5000Da生物物质
病毒诱导制备转化脾细胞
• 有人直接取出健康的活化脾细胞，在 培养中加入病毒体外诱导，以获得能 永久生长的特异脾细胞系。
• 这种方法工作量大、难度高，在制备 人用单抗时比较有用。
（二）杂交瘤技术
• 将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得 到既能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的 杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分 泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通 称为杂交瘤技术 （hydridomatechniquete）。
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3. 干扰素
• 脊椎动物受多种因素(如微生物)诱导产生 的一组抗病毒蛋白质。可影响细胞的运动
和免疫过程，也可干扰多种病毒的复制而
得此名。
• 分子量数百至数千不等。
• 工程菌表达为主。
问题的引出 • 血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某
一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此 必须采用其他方法。
• 互补性决定区 （Complementarity determining region，CDR） VH 和VL的三个高变区共同组 成Ig的抗原结合部位 （Antigen-binding site）。 该部位形成一个与抗原决定簇 互补的表面，决定抗体的多样 性与特异性。
多克隆抗体与单克隆抗体
• 动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克 隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克 隆抗体。
高度纯质
高，与抗原上特定决定 簇结合 相对较差，对理化条件 敏感 易于标准化，批次间差 异小
不常见，可避免非特异 反应
多数没有
一种或多种，需适当选 择 无限
小鼠腹水2.0-30 mg/ml
10.0-15.0 mg/ml 存在
体外培养一般没有，小 鼠腹水0.5-5.0 mg/ml 体外培养可能有少量小 牛血清蛋白，小鼠腹水
• 半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子 量小于5000 Da 物质
• 半抗原需与BSA、OA等载体交联后成完全抗 原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗 体
2.小白鼠免疫及脾脏细胞获得
• 1) 小白鼠 (BALB/c) 先以目标抗原 (如菌体) 免疫，2) 抗原需加 佐剂 (adjuvant, 如 TiterMax) 制成乳剂， 3) 打入小鼠体内慢慢释出 (免疫流程)，4) 诱使 B 细 胞成熟增殖并生产抗体，5) 然后取出脾细胞 (大多为 B 细胞) 。
11.8.3 单克隆抗体
• 回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？
• 细胞融合 （Cell fusion）是指使用人工方法使 两 个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技 术。
• 体细胞杂交：克服有性不亲和性，实现远源遗传 重组，在育种方面意义重大。
• 杂交瘤细胞：具有两亲本特性，生物制药。
• 基础知识回顾
Байду номын сангаас
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免疫学基础
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1 抗原
• 进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的 外源物质。
• 包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、 各 种细胞等。
• 特点：外源性、结构性 （分子具有表面稳定的 环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与 抗体的反应）。
2 抗体P238
• 动物免疫系统分泌的中和或消 除抗原物质的影响的物质，存 在于血清中，本质是免疫球蛋 白 （Immuniiglobbulin,Ig）。
无效Ig含量 其它血清蛋白
多克隆抗体（PcAb）
免疫原纯度高，抗体纯 度才能高 多克隆性
高度异质
较高，与抗原上多种决 定簇结合 较好
较难，不同批次的抗体 质量差异大 很常见，难避免非特异 性反应 有
大多数血清学试验
有限
0.1-0.2 mg/ml
单克隆抗体（MAb）
不纯的免疫原可以获得 高纯度抗体 单克隆性
• 一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族， 因此能刺 激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中 的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称 为多克隆抗体。
• 单克隆抗体和多克隆抗体的比较（见下页）
比较项目 免疫原要求 抗体产生细胞 均质性 特异性 稳定性 标准化
交叉反应
沉淀反应 实用的血清学试验 供应量 有效抗体含量
• 如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的 B淋巴 细胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？
• 问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？
• 很难离体培养B淋巴细胞。
（一）历史发现
• 1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应 于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫 过的小鼠的脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融 合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：既像骨 髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖， 又能持续地分泌特异性抗体。
• 4）注意免疫过的脾脏被大量结缔组织包裹,分离起来比 正常脾脏困难一些，如果不能完整的分离，可以分小块 分离。
• 将小鼠两后肢交叉固定(左后肢在上以便于脾脏的暴露)， 用小镊子在远离脾脏的部位捏住腹膜并向上提起，用小 剪刀在提起部位后剪一小口，将剪刀尖从小口伸进去， 打开剪刀将小口向两边撑开，再将小镊子从撑开的小口 伸进去，夹紧并挂住腹膜向前撕扯，直到脾脏完全暴露。 换一套小剪刀和镊子，用小镊子夹紧脾脏并轻轻向上提 起，用小剪刀剪断结缔组织即可分离出脾脏，之后，用 小剪刀在脾脏的边缘剪一些小口，将脾脏转移到玻璃匀 浆器中。加5mL RPMI-1640基础培养液到玻璃匀浆器中， 将脾脏进行匀浆，直到看不见红色的组织块，补加5mL
• 2) 注意乳剂的生产要完全，可取小量滴入水中，震动 后应该不会散去。 也可以在 电泳后，切出所要色带， 胶体装入乳化针筒，加入佐剂 直接制成乳剂，可有相 当好的免疫效果。
• 3 ) 有人直接取出健康的脾细胞，在培养中加入抗原进 行体外免疫；或打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。 近来更流行以抗原的 DNA 种入肝脏中，以此 DNA 的表 现产物，直接在生物体内诱发免疫反应。 但除非抗原 来源困难或有其它目的，我们仍实行旧法，因免疫反应