单克隆抗体的制备ppt课件
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单克隆抗体PPT课件
单克隆抗体的应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于研究生物分子结构和功能 ，探索生命现象的本质。
诊断
用于检测生物样本中的抗原、 抗体、激素等生物分子，用于
疾病的诊断和监测。
治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾 病、感染性疾病等，通过与靶 分子结合，发挥治疗作用。
免疫学检测
用于检测食品、环境、生物武 器等中的有害物质和病原微生
高特异性
总结词
单克隆抗体具有极高的特异性，能够精确地识别和结合特定的抗原，几乎不会 与其它物质发生交叉反应。
详细描述
单克隆抗体的特异性表现在它能够精确地识别和结合细胞、蛋白质、病毒等抗 原的特定表位，这种结合具有高度的选择性，避免了与其他物质的交叉反应， 提高了检测和治疗的准确性。
高灵敏度
总结词
单克隆抗体可以用于鉴别血型、 检测血红蛋白病和白细胞表面抗 原，有助于血液疾病的诊断和治 疗。
生物标记与示踪研究
1 2
细胞分型
利用单克隆抗体标记不同细胞表面抗原，对细胞 进行分型和鉴定，有助于研究细胞发育、分化及 功能。
示踪研究
将单克隆抗体与荧光、放射性同位素等标记物结 合，追踪生物体内的物质分布、代谢和排泄过程。
良好的重复性
总结词
单克隆抗体的生产和制备具有高度的一致性和重复性，保证了产品质量和实验结果的可靠性。
详细描述
通过采用适当的细胞培养技术，可以在实验室条件下实现单克隆抗体的规模化生产和制备。由于单克 隆抗体的克隆来源单一，其生产和制备过程具有高度的一致性和重复性，这使得单克隆抗体的质量稳 定可靠，实验结果的可重复性强。
提高单克隆抗体的生产效率与质量
优化细胞培养条件
《单克隆抗体技术》课件
单克隆抗体的制备与纯化
单克隆抗体是通过杂交瘤细胞在体外培养或注射到动物体内进行体内培养产生的，经过一系列的分离 和纯化过程，最终获得高纯度、高特异性的单克隆抗体。
制备过程中通常采用各种层析技术、沉淀技术等对抗体进行分离和纯化，以确保获得高质量的单克隆 抗体。
单克隆抗体的鉴定与质量控制
鉴定是通过对单克隆抗体的免疫学特 性、生物学活性和分子结构等方面进 行检测和评估，以确定其特异性和质 量。
总结实验过程和结果，分析存在的问题和改 进方向，为后续实验提供参考和依据。
感谢您的观看
THANKS
生物标记物
用于研究细胞生物学、分子生物学 等领域。
03
02
生物药物
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等 。
免疫分析
用于检测生物样品中的抗原、抗体 等。
04
02 单克隆抗体技术的原理
杂交瘤细胞系的建立
杂交瘤细胞系的建立是单克隆抗体技 术的核心步骤之一，通过将免疫脾细 胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细 胞。
通过抗原-抗体反应检测杂交瘤细胞产生的 抗体特异性。
克隆筛选
通过选择性培养基筛选出能够产生所需抗体 的杂交瘤细胞克隆。
细胞培养与抗体纯化
将筛选出的杂交瘤细胞进行培养，并采用蛋 白质纯化技术获得单克隆抗体。
实验结果分析与总结
结果分析
对实验结果进行统计分析，评估杂交瘤细胞 的抗体产生能力和特异性。
总结
这些杂交瘤细胞既具有脾细胞无限增 殖的能力，又具有产生特异性抗体的 能力，从而为单克隆抗体的制备提供 了稳定的细胞源。
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
在筛选过程中，通过抗原-抗体反应检 测杂交瘤细胞产生的抗体，筛选出能 够产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞 。
《单克隆抗体》课件
05
单克隆抗体的未来发展
新型单克隆抗体的研发
总结词
随着生物技术的不断发展，新型单克 隆抗体的研发将更加活跃，以满足更 多治疗需求。
详细描述
新型单克隆抗体将通过基因工程技术 、蛋白质工程技术等手段进行设计和 优化，以改善其疗效、降低副作用和 降低生产成本。
单克隆抗体与其他技术的结合应用
总结词
单克隆抗体将与其他治疗手段和技术相结合，以实现更有效的疾病治疗和诊断 。
03
类型
IgG、IgM、IgA等。
单克隆抗体的发现和发展历程
1901年
Ehrlich提出“侧链学说”，认为抗体是 由细胞产生的化学物质。
1986年
FDA批准第一个单克隆抗体药物上市， 用于治疗非霍奇金淋巴瘤。
1975年
Kohler和Milstein首次成功制备出单克隆 抗体。
2014年
FDA批准第一个全人源单克隆抗体药物 上市，用于治疗类风湿性关节炎。
生物治疗
总结词
单克隆抗体在生物治疗中具有显著疗效 ，可用于治疗癌症、自身免疫病等多种 疾病。
VS
详细描述
通过靶向肿瘤细胞表面抗原或免疫系统中 的特定分子，单克隆抗体能够发挥抗癌作 用。例如，针对某些癌症的单克隆抗体药 物能够抑制肿瘤生长、扩散和转移，提高 患者生存率和生活质量。此外，在自身免 疫病治疗中，单克隆抗体也具有良好疗效 ，能够调节免疫系统，缓解单克隆抗体的概述 • 单克隆抗体的制备 • 单克隆抗体的特性 • 单克隆抗体的应用实例 • 单克隆抗体的未来发展
01
单克隆抗体的概述
单克隆抗体的定义
01
单克隆抗体
由单一B细胞克隆产生的具有 高度特异性识别抗原表位的抗
(培训课件)单克隆抗体PPT幻灯片
• 种类：氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多 糖、细胞因子、明矾等，其中弗氏不完全佐 剂（羊毛脂：石蜡油=1:5）和弗氏完全佐剂 （弗氏不完全佐剂＋灭活的分枝结核杆菌） 是目前动物实验中最常用佐剂。
4
• 抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的 B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。
5
6
脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes)
淀）。
18
（2）HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
19
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则
①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时； ②缺乏HGPRT酶和TK酶； ③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高；
脾细胞的选择
由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Bal b/c小鼠，因此应尽 量选择同源的Bal b/c健康小鼠（8-12周）作为免疫动物。
死亡
20
3、阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）
• 检测时间：杂交瘤细胞布满孔底1／10时开 始检测特异性抗体，进行筛选。
• 检测方法：最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法
3）离心，弃上清，加15mL HAT培养基，混匀，转入96孔 板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100 ul。
4
• 抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的 B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。
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脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes)
淀）。
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（2）HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
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HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则
①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时； ②缺乏HGPRT酶和TK酶； ③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高；
脾细胞的选择
由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Bal b/c小鼠，因此应尽 量选择同源的Bal b/c健康小鼠（8-12周）作为免疫动物。
死亡
20
3、阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）
• 检测时间：杂交瘤细胞布满孔底1／10时开 始检测特异性抗体，进行筛选。
• 检测方法：最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法
3）离心，弃上清，加15mL HAT培养基，混匀，转入96孔 板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100 ul。
高二生物选修三《单克隆抗体的制备》课件
单 点
击
击 此
处
添 添
加 副
加 标
题
标 题
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性 细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞融合的步骤
去除细胞壁后诱导 原生质体融合
使细胞分散后诱导 细胞融合
诱导方法 用途
物理（离心、振荡、 电刺激）
化学（聚乙二醇）
获得杂种植株
物理、化学方法 （同左） 灭活的病毒
主要用于制备 单克隆抗体
○
三
二一
．
○
．．
浆来 。结的抗概 抗
二 、
B
细 胞 （
源 ：
淋 巴 细 胞 ）
合 的 具
、 并 能
体 是 机
念 ：
体
有与体
单 克
免该受 疫抗抗
隆
功原原 能发刺
抗
的生激 球特后
体
蛋异产
白性生
传统血清抗体的制备
特异性差、纯度低； 产量低、反应不够灵敏
2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的 原因是 每__一__种__B_淋__巴__细__胞__只__能__分__泌__一__种__特__异__性__抗体
3.产生抗体的细胞是_效__应__B_细__胞__（__浆__细_ 胞） 产生单克隆抗体的细胞是杂__交__瘤__细__胞__
抗原 刺激 动物体 抗原不纯
浆细胞 抗体
抗体不纯
每个浆细胞（Ｂ淋巴细胞）只能分泌一种抗体，由一 个Ｂ淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单 一的。
如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？
体外培养单个Ｂ淋巴细胞，提取分泌的抗体
击
击 此
处
添 添
加 副
加 标
题
标 题
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性 细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞融合的步骤
去除细胞壁后诱导 原生质体融合
使细胞分散后诱导 细胞融合
诱导方法 用途
物理（离心、振荡、 电刺激）
化学（聚乙二醇）
获得杂种植株
物理、化学方法 （同左） 灭活的病毒
主要用于制备 单克隆抗体
○
三
二一
．
○
．．
浆来 。结的抗概 抗
二 、
B
细 胞 （
源 ：
淋 巴 细 胞 ）
合 的 具
、 并 能
体 是 机
念 ：
体
有与体
单 克
免该受 疫抗抗
隆
功原原 能发刺
抗
的生激 球特后
体
蛋异产
白性生
传统血清抗体的制备
特异性差、纯度低； 产量低、反应不够灵敏
2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的 原因是 每__一__种__B_淋__巴__细__胞__只__能__分__泌__一__种__特__异__性__抗体
3.产生抗体的细胞是_效__应__B_细__胞__（__浆__细_ 胞） 产生单克隆抗体的细胞是杂__交__瘤__细__胞__
抗原 刺激 动物体 抗原不纯
浆细胞 抗体
抗体不纯
每个浆细胞（Ｂ淋巴细胞）只能分泌一种抗体，由一 个Ｂ淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单 一的。
如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？
体外培养单个Ｂ淋巴细胞，提取分泌的抗体
单克隆抗体制备 ppt课件
实验研究的目的性 — 功能、形态、数量 实验设计的科学性 — 全面、动态、鲜明、对应、对照 实验方法的合理性 — 确切、先进 实验原理的内涵性 — 意义、要点 实验操作的规范性 — 准备、严格、准确、重复
单克隆抗体制备
1
免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
2
一、免疫血清的制备
1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
4
4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂
（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载
2. 种类
1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂
多糖（LPS）、细胞因子；
2）氢氧化铝、明矾；
3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双
链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）；
4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
（ISCOMs）、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
6
3. 弗氏完全佐剂
1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
5
佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或
预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
单克隆抗体制备
1
免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
2
一、免疫血清的制备
1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
4
4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂
（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载
2. 种类
1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂
多糖（LPS）、细胞因子；
2）氢氧化铝、明矾；
3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双
链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）；
4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
（ISCOMs）、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
6
3. 弗氏完全佐剂
1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
5
佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或
预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
人教版高中生物选修三《单克隆抗体的制备及应用》教学课件
阳性细胞
二、单克隆抗体的应用
（1）作为诊断试剂——最广泛应用
准确、高效、简易、快速
（如利用同位素标记的 单克隆抗体，可定位诊 断肿瘤、心血管畸形等）
二、单克隆抗体的应用
（2）运载药物
ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成。
ADC的抗体和药物各具有什么作用？ 抗体主要发挥靶向运输作用；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
一个极富创造力的方案： B淋巴细胞 骨髓瘤细胞
（能产生抗体）（能大量增殖）
融合细胞
（既能产生抗体，又能大量增殖）
米尔斯坦
科勒
一、单克隆抗体的制备
探究一
小组合作利用太空泥模拟细胞融合的过程（只考虑两个细胞融合）
随机融合后培养基中细胞的类 型有哪些？
一、单克隆抗体的制备
探究二
已知细胞分裂过程中，合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋 呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖，其本 身也不能在体外长期存活。 鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但 可以在体外无限增殖，如果它的D途径被阻断的话，它会因为不能合成 DNA而死亡。
二、单克隆抗体的应用
（3）直接用于治疗疾病
实例：利妥昔单抗(美罗华)是一种针对 CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第 一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进 入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性 作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与 CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞 生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死 淋巴瘤细胞。
一、单克隆抗体的制备
1.传统抗体制备方法及缺陷 （1）方法： 向动物体内反复注射某种抗原
从动物血清中分离所需抗体 （2）缺点： 产量低、纯度低、特异性差
单克隆抗体技术讲解PPT课件
8
局限性 ： （1）固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范 围 （2）反应强度不如多克隆抗体 （3）制备技术复杂、费时费工、价格较高
9
三、单克隆抗体技术的应用
1.检验医学诊断
（1）病原微生物抗原抗体的检测：乙肝表面抗原试纸
（2）肿瘤抗原的检测
（3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定：早孕检测试纸、女性排卵检测试纸 （5）细胞因子的测定 （6）其他：吗啡类毒品检测试纸等
抗体工程制药
单克隆抗体的制备
1
掌握：单克隆抗体的概念和特点、制备原理， 制备方法及基本过程 熟悉：单克隆抗体技术的应用 了解：单克隆抗体的发展
2
主要内容
1.单克隆抗体的发展 2.单克隆抗体的概念和特点 3.单克隆抗体技术的应用
4.单克隆抗体的制备过程
3
没有单克隆抗体前人类所遇见的问题
银屑病
手口足病
陷细胞可以在此培养基中生存。是常用的骨髓杂交瘤细胞选择性培
养对筛选方法的要求： 多——大量样品一次检测； 快——迅速取得检测结果； 准——检测结果可靠性高； 灵——检测方法灵敏度高。 常用筛选方法： ELISA、IFA等
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6. 克隆化过程
方法：有限稀释法 克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔 饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞
2.蛋白质的提纯
3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
10
四、单克隆抗体制备过程
致敏淋巴细胞的准备
骨髓瘤细胞的准备
细胞融合 选择性培养 抗体分泌细胞的筛选 克隆化过程
单克隆抗体的制取
11
1.致敏淋巴细胞的准备
动物选择：品系、年龄、性别、健康状态 抗原接种：方式—体内、体外 剂量—0.5-100g 次数—视抗原而定 间隔—视抗原而定 佐剂—视抗原而定 收集时间：末次接种后72 h
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单克隆抗体的制备步骤 四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
ELISA方法筛选阳性孔
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单克隆抗体的制备步骤
四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
阳性孔 间接ELISA方法筛选阳性孔 用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应
15
单克隆抗体的制备步骤 六：亚克隆 是为了获得稳定的阳性菌株 对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细
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单克隆抗体的制备步骤
三.细胞融合 步骤
培养骨髓瘤细胞
饲养细胞的制备
• 1：选择对数生长期 的细胞进行传代培 养。
• 2：胞形态：浑圆、 透亮、均一、排列 整齐
• 3：避免细胞返祖： 定期用8-AG处理细 胞
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● ·1：饲养细胞为小鼠的 腹腔巨噬细胞。
• 2：固定小鼠，切开皮 肤，夹起腹膜。
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单克隆抗体的制备步骤
一：免疫原的制备 ：
1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于 5000Da生物物质
2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产
生可应用的高效价的抗体
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单克隆抗体的制备步骤 抗原接种
Page 9
单克隆抗体的制备步骤
三：细胞融合
细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG 融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤 细胞继承了 B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行 大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制 奠定了坚实的基础。
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单克隆抗体的制备步骤
七：杂交瘤细胞的冻存与复苏
细胞冷冻的意义
1，：来在不建及防立染非对止杂色分所污体泌交有染丢细瘤的失胞细、杂、的胞交防过避的止度瘤免过细程胞中作，进有一时步一的次工融作合，产需生要很把多其“中阳一性部”分孔细 胞冻存生起长来、；防另止一细方胞面密，为了防止实验室可能发生的意外事故。
• 3：往小鼠腹腔注射适 量不完全培养液:，吹 打几次。
• 4：抽出腹腔培养液， 加入一定量的不完全 培养液，加入血清， 使血清浓度为20%。
• 5：分装至96孔板，
脾细胞的制备
• 1：取已免疫小鼠， 眼球采血，分离血 清作对照血清。
• 2：拉颈处死，泡 于75%酒精中。
• 3：开腹取脾 • 4：在不完全DM液
中碾磨脾脏至粘稠 • 5：收集脾细胞，
离心。
单克隆抗体的制备步骤 三.细胞融合
1： 将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀 2： 离心，弃上清，磨成糊状 3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG1450 4：加入DM液 5：离心，弃上清 6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱 7：五天后，15%血清的HAT补液 8：八天后，彻底换15%血清DM液
单克隆抗体的制备步骤
二.动物免疫
免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的Bal B/C。 免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免佐剂的选择。
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体外培养法： a、悬浮培养法 b、微载体培养法
Microcarrier c、中空纤维细胞培养系统 d、微囊化细胞培养系统
胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗 体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失
16
单克隆抗体的制备步骤
六：亚克隆
筛选阳性细胞孔 HAT重悬阳性孔内的细胞 取10ul做倍比稀释 目标孔：80-100个细胞 将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板 每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔 按上述方法进行第二，第三次亚克隆 第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养
2:配制方案度：过D高M而EM死亡:血清：DMSO=7：2：1 “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 保存数年至数十年.
“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复 苏.
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单克隆抗体的制备步骤 八：如何得到大量的单克隆抗体？
动物体内诱生法：使用的 动物当然首选BALB/c小 鼠 ,将杂交瘤细胞接种于 小鼠腹腔内，在小鼠腹腔 内生长杂交瘤，并产生腹 水，因而可得到大量的腹 水单抗且抗体浓度很高。
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所
需
试
剂
：
培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液
细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而 有助于细胞融合
作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度 与毒性有所不同
单克隆抗体的制备
Monocolonal antibody
丁乔棋 2015年8月9号
1
什么是单克隆抗体？
1、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细
胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单 克隆抗体。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量 供应。
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单克隆抗体制备原理
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单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
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在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞
③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
这五种细胞中， ① ④没有分裂能力，逐渐衰老死亡； ③ ⑤的DNA复制只有D途径， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但 是还Pag可e 5以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。
单克隆抗体的制备步骤 四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
ELISA方法筛选阳性孔
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单克隆抗体的制备步骤
四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
阳性孔 间接ELISA方法筛选阳性孔 用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应
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单克隆抗体的制备步骤 六：亚克隆 是为了获得稳定的阳性菌株 对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细
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单克隆抗体的制备步骤
三.细胞融合 步骤
培养骨髓瘤细胞
饲养细胞的制备
• 1：选择对数生长期 的细胞进行传代培 养。
• 2：胞形态：浑圆、 透亮、均一、排列 整齐
• 3：避免细胞返祖： 定期用8-AG处理细 胞
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● ·1：饲养细胞为小鼠的 腹腔巨噬细胞。
• 2：固定小鼠，切开皮 肤，夹起腹膜。
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单克隆抗体的制备步骤
一：免疫原的制备 ：
1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于 5000Da生物物质
2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产
生可应用的高效价的抗体
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单克隆抗体的制备步骤 抗原接种
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单克隆抗体的制备步骤
三：细胞融合
细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG 融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤 细胞继承了 B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行 大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制 奠定了坚实的基础。
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单克隆抗体的制备步骤
七：杂交瘤细胞的冻存与复苏
细胞冷冻的意义
1，：来在不建及防立染非对止杂色分所污体泌交有染丢细瘤的失胞细、杂、的胞交防过避的止度瘤免过细程胞中作，进有一时步一的次工融作合，产需生要很把多其“中阳一性部”分孔细 胞冻存生起长来、；防另止一细方胞面密，为了防止实验室可能发生的意外事故。
• 3：往小鼠腹腔注射适 量不完全培养液:，吹 打几次。
• 4：抽出腹腔培养液， 加入一定量的不完全 培养液，加入血清， 使血清浓度为20%。
• 5：分装至96孔板，
脾细胞的制备
• 1：取已免疫小鼠， 眼球采血，分离血 清作对照血清。
• 2：拉颈处死，泡 于75%酒精中。
• 3：开腹取脾 • 4：在不完全DM液
中碾磨脾脏至粘稠 • 5：收集脾细胞，
离心。
单克隆抗体的制备步骤 三.细胞融合
1： 将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀 2： 离心，弃上清，磨成糊状 3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG1450 4：加入DM液 5：离心，弃上清 6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱 7：五天后，15%血清的HAT补液 8：八天后，彻底换15%血清DM液
单克隆抗体的制备步骤
二.动物免疫
免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的Bal B/C。 免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免佐剂的选择。
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体外培养法： a、悬浮培养法 b、微载体培养法
Microcarrier c、中空纤维细胞培养系统 d、微囊化细胞培养系统
胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗 体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失
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单克隆抗体的制备步骤
六：亚克隆
筛选阳性细胞孔 HAT重悬阳性孔内的细胞 取10ul做倍比稀释 目标孔：80-100个细胞 将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板 每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔 按上述方法进行第二，第三次亚克隆 第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养
2:配制方案度：过D高M而EM死亡:血清：DMSO=7：2：1 “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 保存数年至数十年.
“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复 苏.
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单克隆抗体的制备步骤 八：如何得到大量的单克隆抗体？
动物体内诱生法：使用的 动物当然首选BALB/c小 鼠 ,将杂交瘤细胞接种于 小鼠腹腔内，在小鼠腹腔 内生长杂交瘤，并产生腹 水，因而可得到大量的腹 水单抗且抗体浓度很高。
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所
需
试
剂
：
培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液
细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而 有助于细胞融合
作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度 与毒性有所不同
单克隆抗体的制备
Monocolonal antibody
丁乔棋 2015年8月9号
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什么是单克隆抗体？
1、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细
胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单 克隆抗体。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量 供应。
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单克隆抗体制备原理
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单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
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在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞
③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
这五种细胞中， ① ④没有分裂能力，逐渐衰老死亡； ③ ⑤的DNA复制只有D途径， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但 是还Pag可e 5以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。