细胞因子的检测方法 PPT
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细胞因子检测
1.细胞增殖法
原理： 一些细胞因子可专一刺激某些细胞增殖，而且 细胞增殖的程度与这些细胞因子活性呈正相关。
如：IL-2 —— T细胞， IL-3 ——肥大细胞，IL-6 ——浆细胞。 这些只依赖某种细胞因子才能生长的细胞系称为 依赖细胞株。
如人IL-2对鼠T细胞有生长支持作用 一定数量鼠T细胞+ 每孔分别加不同剂量的IL-2
IL-6诱导肝细胞产生-抗用相关试验来检测 验干扰素含量。
血凝素生成抑制试验：
小鼠脑脊髓心肌炎病毒可感染人肺癌A549细胞，该病毒 在生长过程中可产生血凝素，使人O型RBC凝集
试验管：A549细胞（已长好） 加一定量干扰素 培
养一定时间 加病毒
第十四章 细胞因子检测 P150
一.细胞因子检测应注意的问题
1.欲了解机体免疫功能，应检测多项细胞因子， 如细胞免疫应测IL-2、TFN-γ等
2.局部取标本：细胞因子由局部细胞产生，在 血液中浓度极低，最好取局部体液或细胞
3.动态检测比较，如疾病的复发期、缓解期、 恢复期
4.同一细胞因子选用多种方法联合检测，各种 方法检测结果不一定平衡
二.检测方法（P161）
生物学方法 免疫学方法 分子生物学方法
（一）生物学方法
原理：根据不同细胞因子生物学活性（功能) 不同而设计的方法
如IL-2可促进T淋巴细胞生长； TNF可杀肿瘤细胞； CSF可刺激造血细胞形成集落； IFN可保护细胞免受病毒攻击。
具体方法：
细胞增殖法 靶细胞杀伤法 诱导的产物分析法 细胞病变抑制法
利用细胞因子基因探针检测特定的细胞因子 mRNA表达的技术
常用方法：斑点杂交、逆转录PCR、 Northern blot、细胞或组织原位杂交等
《细胞因子的检测》课件
干细胞治疗
干细胞分泌的细胞因子具有促进组织再生和修复的作用，可用于治 疗多种疾病。
基因治疗
通过将具有治疗作用的基因导入细胞，调控细胞因子的表达，达到治 疗遗传性疾病和罕见病的目的。
04
细胞因子检测的挑战与展望
检测灵敏度与特异性
检测灵敏度
提高检测方法的灵敏度，降低检测限，以便更早地发现细胞 因子的存在。
挑战
面临的挑战包括如何提高检测方法的 实用性和可靠性，以及如何降低检测 成本，使其更易于在临床推广应用。
05
案例分析
案例一：肿瘤细胞因子检测
总结词
肿瘤细胞因子检测是利用细胞因子作为生物标志物，对肿瘤进行早期诊断、病情监测和疗效评估的方 法。
详细描述
肿瘤细胞因子检测通过检测肿瘤细胞分泌的细胞因子，如肿瘤坏死因子、白介素等，来判断肿瘤的存 在、发展阶段和预后情况。该方法具有无创、灵敏度高、特异性强等优点，有助于提高肿瘤的诊断准 确性和治疗效果。
案例三：感染性疾病细胞因子检测
总结词
感染性疾病细胞因子检测是利用细胞因子作 为生物标志物，对感染性疾病进行诊断和病 情监测的方法。
详细描述
感染性疾病细胞因子检测通过检测患者体内 异常升高的细胞因子，如白介素-1、白介素 -6等，来判断感染性疾病的类型和严重程度 。该方法有助于早期发现感染源，为患者提 供及时有效的治疗，同时有助于评估治疗效 果和预后情况。
药物研发
药物筛选
通过检测细胞因子水平的变化，可以筛选出具有潜在治疗作用的 候选药物。
药物疗效评估
在药物研发过程中，检测细胞因子水平的变化可以评估药物的疗 效和作用机制。
个体化治疗
根据患者细胞因子表达水平的差异，可以制定个体化的治疗方案 ，提高治疗效果。
干细胞分泌的细胞因子具有促进组织再生和修复的作用，可用于治 疗多种疾病。
基因治疗
通过将具有治疗作用的基因导入细胞，调控细胞因子的表达，达到治 疗遗传性疾病和罕见病的目的。
04
细胞因子检测的挑战与展望
检测灵敏度与特异性
检测灵敏度
提高检测方法的灵敏度，降低检测限，以便更早地发现细胞 因子的存在。
挑战
面临的挑战包括如何提高检测方法的 实用性和可靠性，以及如何降低检测 成本，使其更易于在临床推广应用。
05
案例分析
案例一：肿瘤细胞因子检测
总结词
肿瘤细胞因子检测是利用细胞因子作为生物标志物，对肿瘤进行早期诊断、病情监测和疗效评估的方 法。
详细描述
肿瘤细胞因子检测通过检测肿瘤细胞分泌的细胞因子，如肿瘤坏死因子、白介素等，来判断肿瘤的存 在、发展阶段和预后情况。该方法具有无创、灵敏度高、特异性强等优点，有助于提高肿瘤的诊断准 确性和治疗效果。
案例三：感染性疾病细胞因子检测
总结词
感染性疾病细胞因子检测是利用细胞因子作 为生物标志物，对感染性疾病进行诊断和病 情监测的方法。
详细描述
感染性疾病细胞因子检测通过检测患者体内 异常升高的细胞因子，如白介素-1、白介素 -6等，来判断感染性疾病的类型和严重程度 。该方法有助于早期发现感染源，为患者提 供及时有效的治疗，同时有助于评估治疗效 果和预后情况。
药物研发
药物筛选
通过检测细胞因子水平的变化，可以筛选出具有潜在治疗作用的 候选药物。
药物疗效评估
在药物研发过程中，检测细胞因子水平的变化可以评估药物的疗 效和作用机制。
个体化治疗
根据患者细胞因子表达水平的差异，可以制定个体化的治疗方案 ，提高治疗效果。
细胞内因子的流式检测(共10张PPT)
所需试剂
1、细胞表面染色用的荧光标记的单抗试剂 如CD3、CD4、CD8、CD25等
2、荧光标记的细胞因子抗体： 如IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-4等
3、溶血素：裂解红细胞
4、激活剂：
如PMA、Ionomycin，可以刺激T细胞活化并分泌细胞因子
所需试剂
5、阻断剂
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细胞免疫检测I细胞因子的检测.ppt
实验三 细胞免疫检测I： 细胞因子的检测
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之（从细胞因子的角 度考虑
方案归纳
人体免疫包括细胞免疫和体液免疫。本次 实验从T细胞分泌的细胞因子着手检测细胞 免疫功能。
确定研究对象，给药途径，剂量，样本量。 给药后检测血清中细胞因子的含量。
竞争法 双抗体夹心法 改良双抗体夹心法 抑制性测定法 抗体夹心法
抑制性测定法
间接法测抗体
本次实验操作步骤
每孔加用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的IL-2 抗体，4℃过夜。
封闭：用10%小牛血清封闭，37℃孵育20 分钟，洗涤3次。
于每孔内分别加不同稀释度（如1:5，1:10， 1:20…1:80）的待测血清，PBS空白对照， 阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。 37℃孵育30分钟，洗涤3次
金免疫技术
金免疫技术的特点是以胶体金作为示踪标 记物 ，应用于抗原抗体反应的一种新型免 疫标记技术。
酶联免疫分析法
酶联免疫分析法是当前应用最广泛的免疫检测方法。 本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化 作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变 化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏 感度可达ng水平。
免疫荧光技术免疫荧光技术放射免疫分析法放射免疫分析法酶联免疫分析法酶联免疫分析法化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法金标记技术金标记技术免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记的抗体或抗原与组织或细胞中的相应的抗体或抗原与组织或细胞中的相应抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体的方法
常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附 法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原；后者 主要测定可溶性抗原或抗体。
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之（从细胞因子的角 度考虑
方案归纳
人体免疫包括细胞免疫和体液免疫。本次 实验从T细胞分泌的细胞因子着手检测细胞 免疫功能。
确定研究对象，给药途径，剂量，样本量。 给药后检测血清中细胞因子的含量。
竞争法 双抗体夹心法 改良双抗体夹心法 抑制性测定法 抗体夹心法
抑制性测定法
间接法测抗体
本次实验操作步骤
每孔加用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的IL-2 抗体，4℃过夜。
封闭：用10%小牛血清封闭，37℃孵育20 分钟，洗涤3次。
于每孔内分别加不同稀释度（如1:5，1:10， 1:20…1:80）的待测血清，PBS空白对照， 阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。 37℃孵育30分钟，洗涤3次
金免疫技术
金免疫技术的特点是以胶体金作为示踪标 记物 ，应用于抗原抗体反应的一种新型免 疫标记技术。
酶联免疫分析法
酶联免疫分析法是当前应用最广泛的免疫检测方法。 本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化 作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变 化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏 感度可达ng水平。
免疫荧光技术免疫荧光技术放射免疫分析法放射免疫分析法酶联免疫分析法酶联免疫分析法化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法金标记技术金标记技术免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记的抗体或抗原与组织或细胞中的相应的抗体或抗原与组织或细胞中的相应抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体的方法
常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附 法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原；后者 主要测定可溶性抗原或抗体。
第七版医学免疫-第六章-细胞因子 ppt课件
ppt课件
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五、趋化因子(chemokine)
概念：是一类能诱导细胞定向移动到该细胞因子化学 浓度较高部位的小分子细胞因子(5～10kD)，不但有趋化 作用，也可激活靶细胞。
分类： 分4个家族： • CXC：氨基端有一个C-1个任意氨基酸-C基序 • CC：氨基端有两个相邻半胱氨酸（CC） • C ：氨基端有一个半胱氨酸 • CX3C ：氨基端有一个C-3个任意氨基酸-C序列
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
要点内容：
一、细胞因子概述 二、细胞因子的分类 三、细胞因子受体 四、细胞因子的生物学活性
ppt课件
5
ppt课件
·6·
第一节 细胞因子概述
细胞因子(cytokines)的概念：
ppt课件
·22·
第三节 细胞因子受体
细胞因子通过与细胞表面相应的细胞因子受体结合，启 动特定的细胞信号转导，进而发挥相应的生物学作用。 依据分子结构和所介导的信号转导途径分类： • 免疫球蛋白超家族受体 • Ⅰ类细胞因子受体家族 • Ⅱ类细胞因子受体家族 • 肿瘤坏死因子受体超家族 • 趋化因子家族受体
； • 以自分泌、旁分泌或内分泌形式发挥作用； • 其作用具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性；
ppt课件
·12·
大部分以自分泌和旁分泌，少 部分以内分泌方式发挥作用
ppt课件
·13·
多效性 pleiotropy
IL-4
B
活化、增殖、分化
增殖 胸腺细胞
增殖
肥大细胞
ppt课件
·14·
重叠性
IL-2、 IL-4、
细胞因子检测方法ppt课件
用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区 分表达特定细胞因子的细胞亚群。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志 组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用 特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。
特点： 快速
简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
小结
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
燥剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右
检测方法的进展
高通量细胞因子检测
CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来 捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、 EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其 采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技 术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已 知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样 本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而 且可以得到一个样本的多个数据。
夹心ELISA
缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同 一性和频率性的直接信息
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志 组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用 特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。
特点： 快速
简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
小结
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
燥剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右
检测方法的进展
高通量细胞因子检测
CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来 捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、 EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其 采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技 术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已 知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样 本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而 且可以得到一个样本的多个数据。
夹心ELISA
缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同 一性和频率性的直接信息
6第六章--细胞因子PPT课件
二、细胞因子的共同特性
①受抗原、丝裂原等刺激后由细胞分泌产生，多为小分子。 ②对靶细胞作用通常无抗原特异性。在较低浓度下即有生物学
活性。 ③通过与靶细胞表面受体结合发挥作用。 ④以自分泌、旁分泌和内分泌的形式发挥作用。 ⑤一种细胞因子可由多种细胞产生，一种细胞也可产生多种细
胞因子；一种细胞因子可作用于多种类型细胞（多效性）， 多种细胞因子也可作用于同一种靶细胞（重叠性）；一种细 胞因子可抑制其他细胞因子的功能（拮抗性），一种细胞因 子可增强另一种细胞因子的功能（协同性）；细胞因子在体 内相互调节，形成复杂的细胞因子网络。
（四）诱导细胞凋亡
IL-2可诱导抗原活化的T细胞发生凋亡； TNF可诱导肿瘤细胞的凋亡。
（五）促进创伤的修复
第四节 细胞因子受体
一、细胞因子受体（CKR）分类: 膜结合型细胞因子受体（mCKR） 可溶性细胞因子受体（sCKR）
(一)免疫球蛋白基因超家族
如IL-1R、IL-6R、M-CSFR、SCFR
1.淋巴因子（lymphokine）淋巴细胞分泌 2.单核因子（monokine）单核巨噬细胞分泌 3.其他细胞分泌的细胞因子
干扰素治疗急性乙型肝炎
患者Gerald M.Edelman，男，35岁.主诉:因近日胃口 欠佳、乏力、反复出现头晕、肝区不适而入院。
患者入院前，自感全身乏力、萎靡、食欲不振，并有恶心、 呕吐、头晕、失眠、巩膜、皮肤出现黄染入院。患者自述6 年前体检发现HBsAg阳性，未作任何治疗。入院后，体格 检查：肝肿大于肋下1cm、压痛，左肋下可触及脾脏；实验 室检查：谷丙转氨酶升高，诊断为急性乙型肝炎。住院后经 用拉米夫定、肝泰乐、维生素等抗病毒和护肝药物治疗两个 半月，病情仍未明显好转；根据患者病情迁延不愈，医生随 即在原用药的基础上，使用干扰素抗病毒治疗（500万U/ 次），使用干扰素四个月后，病人自感觉状态好转，使用干 扰素抗病毒治疗6个月，患者血清谷丙转氨酶转正常， HbsAg转阴性，病人痊愈出院。 问题：1、为什么使用干扰素能治愈“乙肝”？干扰素有哪些特 点？2、除干扰素外细胞因子还有哪几大类？其理化性质和 作用特点如何？
细胞因子(免疫学检验课件)
态
免疫学测定方法学评价
➢优点： 特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。
➢缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一
定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细
胞因子的结合
(四) 集落刺激因子（colony-stimulating factor， CSF） ：G-CSF、M-CSF、GM-CSF、SCF、 EPO、TPO等。
(五)趋化因子（chemokine）：促进淋巴细胞、中性 粒细胞、单核细胞等到达炎症部位并激活。
(六)生长因子（growth factor，GF） ：TGF-β、 EGF 、NGF、VEGF、FGF 等。
（六）两面性：通常情况下，发货 抗感染、抗病毒、促进造血和免疫 调节等功能，但在一些异常情况下 又参与炎症反应、诱导肿瘤等疾病 的发生。
（七）非特异性：细胞因子以非特异性 方式发挥作用,不受MHC限制，细胞因 子必须与相应受体结合才能发挥效应;
（八）网络性：细胞因子之间通过合成 分泌的作用相互调节、生物学效应的相 互影响，从而形成复杂而有序的因子网 络，达到机体稳态平衡。
三、细胞因子的免疫学检测法
利用抗原抗体反应的原理，制备出抗细 胞因子的单克隆抗体或多克隆抗体，通过 同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大 和显示，从而定性或定量分析细胞因子。 （一）酶联免疫吸附试验（ELISA）
是定量分析中最常用方法。但不能判 断细胞因子的生物学活性。
ELISA方法
ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一 步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基 本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细 胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘 附因子的测定
免疫学测定方法学评价
➢优点： 特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。
➢缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一
定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细
胞因子的结合
(四) 集落刺激因子（colony-stimulating factor， CSF） ：G-CSF、M-CSF、GM-CSF、SCF、 EPO、TPO等。
(五)趋化因子（chemokine）：促进淋巴细胞、中性 粒细胞、单核细胞等到达炎症部位并激活。
(六)生长因子（growth factor，GF） ：TGF-β、 EGF 、NGF、VEGF、FGF 等。
（六）两面性：通常情况下，发货 抗感染、抗病毒、促进造血和免疫 调节等功能，但在一些异常情况下 又参与炎症反应、诱导肿瘤等疾病 的发生。
（七）非特异性：细胞因子以非特异性 方式发挥作用,不受MHC限制，细胞因 子必须与相应受体结合才能发挥效应;
（八）网络性：细胞因子之间通过合成 分泌的作用相互调节、生物学效应的相 互影响，从而形成复杂而有序的因子网 络，达到机体稳态平衡。
三、细胞因子的免疫学检测法
利用抗原抗体反应的原理，制备出抗细 胞因子的单克隆抗体或多克隆抗体，通过 同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大 和显示，从而定性或定量分析细胞因子。 （一）酶联免疫吸附试验（ELISA）
是定量分析中最常用方法。但不能判 断细胞因子的生物学活性。
ELISA方法
ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一 步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基 本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细 胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘 附因子的测定
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细胞因子的检测方法
细胞因子
一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分 子蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。 ❖白细胞介素(interleukin, IL) ❖干扰素(interferon, IFN) ❖肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) ❖集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) ❖生长因子(growth factor, GF) ❖ 趋化因子(chemokine)
❖ 优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。 可检测到百万分之一阳性细胞率; 单细胞水平、活 细胞功能检测; 操作简便，可进行高通量筛选。
ELISPOT
1.特异性单抗包被在培养板孔底部； 2.封闭能结合单抗的其他部位；
3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞 分泌的细胞因子被单抗捕获；
4.移出细胞，洗涤；
ELISA RIA FIA ELISPOT 。。。
优点：方便、迅速 缺点：价格昂贵，结 果仅代表CK的量而非 活性，敏感性较低。
分子生物学检测法
3
利用基因探针，检测特 定细胞因子基因表达， 即mRNA水平。
斑点杂交 Northern印迹 细胞和组织原位杂交 RT-PCR 。。。
局限性：仅能检测基因表 达情况，不能直接提供有 关细胞因子的浓度和活性， 只用于机制探讨。
Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colorimetric)
Chromium-51 (51Cr) release assays
细胞
微孔 滤膜 趋化因子
计数受趋化细胞
趋化实验示意图
免疫标记技术
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗 原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可 见的或可测定的。
37ºC，24-48小 观察细胞病变（时镜检或比色）
Using CFSE to track CML progenitor proliferation
SDM
SDM + Glivec
Calculation of Proliferative Index (P.I.)
43210
CFSE --->
The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells. It is useful for paring quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing different treatments.
5.加入生物素标记的二抗；
6.加入酶标链霉亲和素；
7.加入显色底物，在酶的催化分解下， 产生不可溶的色素，就近沉淀在局 部的膜上形成斑点；
8.斑点计数（可人工计数，也可用自 动读板仪计数），数据处理，结果 分析。
应用
❖ 移植研究--allograft rejection ❖ 疫苗开发--亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 ❖ Th0/Th1/Th2细胞转换分析 ❖ 自体免疫研究--免疫调节及免疫治疗研究 ❖ 癌症研究--肿瘤反应T细胞作用 ❖ 过敏机制探讨--IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参
Cytokine network
CBA原理示意图
cytokine bead arrays(CBA) ❖ Lab Invest 2003, 83:1131–1146
ELISPOT(酶联免疫斑点实验)
❖ ELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子 的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细胞 因子。实验中每个斑点（spot）是激活的淋巴细胞 分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它 可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应 能力。
高通量细胞因子检测
❖CBA (Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合 来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养 液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的 量。其采用夹心法分析策略，与传统的 ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测 多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线 就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不 受样本量的限制，而且可以得到一个样本的 多个数据。
与过敏机制之细胞因子的研究 ❖ 传 染 疾 病 研 究 --Lyme disease, Chlamydia infections,
Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, 等
HIV-peptide specific recall response shows dissociated production of IFN- and GzB
细胞因子的检测方法
生物学检测法
1
不 同的CK具 有不同的 生 物学活性 ，选 择CK 独特的生物学活性，即 可检测。
细胞增殖/抑制实验 细胞病变抑制实验 细胞毒实验 细胞趋化实验 。。。
优点：敏感、可靠； 缺点：需长期饲养细 胞、检测耗时长、步 骤繁杂。
免疫学检测法
2
利用抗体对抗原表位的 识别，测定的是可溶性 细胞因子的抗原性。
细胞增殖实验
待检样品(细胞上清) 指示细胞（CTLL-2） IL-2依赖细胞系
按不同稀 释度加入
37ºC，16-20小时 加入3HTdR（1-5Ci）
37ºC，4-6小时 收集细胞
测定
细胞病变抑制实验
待检样品（细胞上清） IFN-指示细胞（wish）
按不同稀 释度加入
37ºC，4小时 弃取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒)
HIV- peptide recall patient B
Medium
Peptide 1
Peptide 21
GzB
Kleen T. et al, AIDS 2003, 18: 383-392
ELISPOT 和 ELISA的区别
ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展，它们最大的不同:
细胞因子
一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分 子蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。 ❖白细胞介素(interleukin, IL) ❖干扰素(interferon, IFN) ❖肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) ❖集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) ❖生长因子(growth factor, GF) ❖ 趋化因子(chemokine)
❖ 优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。 可检测到百万分之一阳性细胞率; 单细胞水平、活 细胞功能检测; 操作简便，可进行高通量筛选。
ELISPOT
1.特异性单抗包被在培养板孔底部； 2.封闭能结合单抗的其他部位；
3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞 分泌的细胞因子被单抗捕获；
4.移出细胞，洗涤；
ELISA RIA FIA ELISPOT 。。。
优点：方便、迅速 缺点：价格昂贵，结 果仅代表CK的量而非 活性，敏感性较低。
分子生物学检测法
3
利用基因探针，检测特 定细胞因子基因表达， 即mRNA水平。
斑点杂交 Northern印迹 细胞和组织原位杂交 RT-PCR 。。。
局限性：仅能检测基因表 达情况，不能直接提供有 关细胞因子的浓度和活性， 只用于机制探讨。
Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colorimetric)
Chromium-51 (51Cr) release assays
细胞
微孔 滤膜 趋化因子
计数受趋化细胞
趋化实验示意图
免疫标记技术
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗 原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可 见的或可测定的。
37ºC，24-48小 观察细胞病变（时镜检或比色）
Using CFSE to track CML progenitor proliferation
SDM
SDM + Glivec
Calculation of Proliferative Index (P.I.)
43210
CFSE --->
The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells. It is useful for paring quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing different treatments.
5.加入生物素标记的二抗；
6.加入酶标链霉亲和素；
7.加入显色底物，在酶的催化分解下， 产生不可溶的色素，就近沉淀在局 部的膜上形成斑点；
8.斑点计数（可人工计数，也可用自 动读板仪计数），数据处理，结果 分析。
应用
❖ 移植研究--allograft rejection ❖ 疫苗开发--亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 ❖ Th0/Th1/Th2细胞转换分析 ❖ 自体免疫研究--免疫调节及免疫治疗研究 ❖ 癌症研究--肿瘤反应T细胞作用 ❖ 过敏机制探讨--IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参
Cytokine network
CBA原理示意图
cytokine bead arrays(CBA) ❖ Lab Invest 2003, 83:1131–1146
ELISPOT(酶联免疫斑点实验)
❖ ELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子 的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细胞 因子。实验中每个斑点（spot）是激活的淋巴细胞 分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它 可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应 能力。
高通量细胞因子检测
❖CBA (Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合 来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养 液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的 量。其采用夹心法分析策略，与传统的 ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测 多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线 就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不 受样本量的限制，而且可以得到一个样本的 多个数据。
与过敏机制之细胞因子的研究 ❖ 传 染 疾 病 研 究 --Lyme disease, Chlamydia infections,
Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, 等
HIV-peptide specific recall response shows dissociated production of IFN- and GzB
细胞因子的检测方法
生物学检测法
1
不 同的CK具 有不同的 生 物学活性 ，选 择CK 独特的生物学活性，即 可检测。
细胞增殖/抑制实验 细胞病变抑制实验 细胞毒实验 细胞趋化实验 。。。
优点：敏感、可靠； 缺点：需长期饲养细 胞、检测耗时长、步 骤繁杂。
免疫学检测法
2
利用抗体对抗原表位的 识别，测定的是可溶性 细胞因子的抗原性。
细胞增殖实验
待检样品(细胞上清) 指示细胞（CTLL-2） IL-2依赖细胞系
按不同稀 释度加入
37ºC，16-20小时 加入3HTdR（1-5Ci）
37ºC，4-6小时 收集细胞
测定
细胞病变抑制实验
待检样品（细胞上清） IFN-指示细胞（wish）
按不同稀 释度加入
37ºC，4小时 弃取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒)
HIV- peptide recall patient B
Medium
Peptide 1
Peptide 21
GzB
Kleen T. et al, AIDS 2003, 18: 383-392
ELISPOT 和 ELISA的区别
ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展，它们最大的不同: