第7章 4 分子筛

一般说来，色谱柱的理论塔板
Ve 2 达到分配平衡的次数越多，越 N 5.54( ) Wh 有利于分离；柱效表现为洗脱
Ve—洗脱体积；
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数越大，表示组分在色谱柱中
峰的宽度，洗脱峰越窄，柱效
Wh—半峰高时的峰宽
越高（N越大）。
分离，全排-全渗-部分渗透
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GF分辨率
分辨率（分离度）Rs用于描述混合组分中两种物质组分间分离 效果的好坏，定义为相邻两峰洗脱体积（保留值）之差与两峰 底宽平均值之比，
Ve 2 Ve1 2(Ve 2 Ve1) Rs Wb 2 Wb1 Wb 2 Wb1 2
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凝胶过滤介质的参数及性质
基本参数 粒度5~400 μm范围 小粒度—柱效高，但背景压力大，设备要求高
，分析型
大粒度—柱效低，压力小，样品量大，制备型 粒度均一——分离效果好
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2. 凝胶过滤层析的特点
1.设备简单，操作方便，只需一种缓冲液；
2.根据分子大小和形状分离；
3.生物大分子可测定其分子量大小；
4.分离条件缓和，应用广泛；
5.分辨率不高，样品被稀释。
3.目标组分的分子量、形状
关于GF分级范围
凝胶的分级范围（渗入限与排阻限） 相对分子量>分级范围上限——全排阻分子，流 程最短，无法分离 相对分子量<分级范围下限——全渗透分子，流 程最长，无法分离 分级范围下限<相对分子量<分级范围上限—— 部分渗透分子，流程长短不一，有效分离
凝胶层析
凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛 层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物 质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可反复使用，
适用于不同相对分子质量的各种物质的分离，已广泛地
用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。
发现历史
Ve＝Vo＋Kd Vi
另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加 Kd=0 ，全排阻分子，Ve=Vo；
以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级 Kd=1 ，全渗透分子， Ve=Vo+Vi 分离 。
0<Kd<1，部分渗透分子，Vo<Ve<Vo+Vi
分级分离—部分渗透分子之间的分离；
组别分离（分类分离）—不同类别分子间的
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交联度、网孔结构、机械强度
• 交联度高，颗粒网孔小，机械强度高 • 膨胀度：每克干胶溶胀过程中吸收水的体积ml/g •
，也称得水值 交联度高，得水值越小（水分子无法大量进入颗 粒网孔之间）
机械强度与交联度呈正相关
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如要提高分辨率，只能从选择性和柱效进行考虑!
选择性：柱系统分离大小不同组分的能力。习惯上用 相对保留值α表示，取决于凝胶介质的分级范围、渗 透性等特性。
Ve 2 V o Ve1 Vo
衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，这类层析介质的 流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机 溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤
• 机械强度低，G100、150、200属于软胶，高压易
破裂
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一、凝胶过滤层析概述
1. 基本原理
当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子 物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔， 沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小 分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的 速度较慢（分子筛效应），从而使样品中各组分按 相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而 达到分离的目的。
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Sephadex GX ②葡聚糖凝胶常用G-X代表， Sephadex GX ，X为凝 胶吸水值的10倍； Sephadex GX，X—每10g干胶的 得水值（ml/10g） 种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、 G200。 如G-25表示1g干凝胶的吸水量为2.5mL，G-100表示
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柱效
1.
以特定实验条件下层析柱的理论塔板数N来表示
塔板理论认为，一根柱子可以分为N段，在每段内组 分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔 板。理论塔板数（N）可根据色谱图上所测得的洗脱 体积和半峰宽按下式推算：
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凝胶介质的主要类型
交联葡聚糖凝胶（Sephadex）

基本性质
① 由数个葡萄糖分子聚合而成的同多糖就是葡聚糖 ，通过环氧丙烷交联而成交联葡聚糖凝胶。具有 良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常 网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条 用的凝胶。 件来控制
1g干胶持水10mL，依次类推。
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③ X数字既代表持水量（得水值），也代表交联度， 也能反映膨胀程度和分级范围。 X数字越小，得水值越小，交联度越大，网孔越小 ，吸水膨胀就越小。适用于分离低分子质量生化产 品。 X数字越大，得水值越大，交联度越小，网孔越大 ，吸水膨胀就越大，适用于分离高分子生化产品。
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4.层析柱的重要参数 凝胶柱体积参数
Vt=Vo+Vi+Vg
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洗脱体积
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Ve＝Vo＋Kd· Vi
Kd—溶质分子在固定相与流动相之间的分配系数，只 与颗粒大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd可 通过实验由Ve、Vo和Vi求得。
GF分离中的两种类型： 一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋 白质与盐类，称作类分离或组分离。 ·
Per Flodin, Jerker Porath and Björn Ingelman
1941年Ingelman意外发现了葡聚糖dextran。1957年， Porath 在葡聚糖柱中发现了分子筛现象。1959年，Pharmacia推出 Sephadex G-25和G50凝胶过滤填料。2004年， Pharmacia并入 GE。
分子筛效应
样品流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着 两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散 运动。大分子直径较大，不易进入凝胶微孔，所以 向下移动的速度较快。小分子可以进入凝胶微孔， 在向下移动的过程中，从一个颗粒内扩散到间隙后 再进入另一颗粒，如此不断地进入和扩散，导致小 分子的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中 大的分子先流出色谱柱，中等的分子后流出，小分 子最后流出，这种现象叫分子筛效应。
当 = 1时，Ve2=Ve1，无论如何两种组分是无法分开的。
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表现为两组分洗脱体积的差异，Ve差值越大，选择性harose
• 无交联剂，Sepharose
2B、4B、6B，数字代表琼
脂糖含量，含量高则强度高，分级范围变小
• pH4-9范围内的盐溶液稳定
• 40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学
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特点 • 较强的亲水性 • 溶胀、浸泡时沸水（脱气）、轻搅（防裂） • 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷
键易水解
• 湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受
凝胶过滤介质的基本结构
分级范围
多孔性 粒度
Rs
N