腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书
IL-31重组腺病毒载体的构建及鉴定
IL-31重组腺病毒载体的构建及鉴定黄俊琼;张海峰;章春花;胡永林【期刊名称】《临床和实验医学杂志》【年(卷),期】2008(7)6【摘要】目的构建并鉴定人白细胞介素31(IL-31)重组腺病毒Ad-IL-31,为下一步IL-31功能研究奠定基础.方法以pGEM-T-IL-31为模板扩增IL-31基因,将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,PmeⅠ线性化后与腺病毒骨架质粒共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-IL-31,经PacⅠ线性化后转染QBI-293A 细胞,荧光显微镜下观察细胞内荧光,测定病毒效价,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(western blot)分析细胞内IL-31信使核糖核酸(mRNA)和蛋白质的表达.结果经双酶切及基因扩增仪鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见500 bp插入片段,测序结果和基因库中的基因序列一致;重组病毒效价为2.6×108pfu/ml;重组病毒感染后,QBI-293A细胞中有IL-31mRNA和蛋白质表达.结论成功构建IL-31重组腺病毒载体,并在QBI-293A细胞中表达,为进一步研究IL-31的功能奠定了基础.【总页数】3页(P17-19)【作者】黄俊琼;张海峰;章春花;胡永林【作者单位】遵义医学院附属医院检验科,贵州,遵义,563003;苏州大学医学院细胞与分子生物学教研室,江苏,苏州,215123;苏州大学医学院细胞与分子生物学教研室,江苏,苏州,215123;遵义医学院附属医院检验科,贵州,遵义,563003【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.大鼠shRNA-Slfn1重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德;2.大鼠shRNA-Slfn1重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德3.重组腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP载体的构建及鉴定 [J], 曾理;唐泽飞;李春鸣4.抑制miR-327表达的重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 郑涛;杨简;刘晓雯;杨英;李奇;杨俊5.抑制miR-327表达的重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 郑涛;杨简;刘晓雯;杨英;李奇;杨俊;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人nm23-H1基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
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中 老年 腔医 志２ １ 年 １ 第 ｌ 卷第 １ 华 口 学杂 ０２ 月 Ｏ 期
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１ ．材 料和 方法
１１试剂和材料 ． Ａｄ ａｙＶ ｅ ｏ ｉ ｌ ｃｏ Ｅ ｓ Ａｄ ｎ ｖｒ ｔｒ Ｍ ａ Ｖｅ
2024年基因合成技术服务合同
2024年基因合成技术服务合同甲方（需求方）：乙方（提供方）：根据《中华人民共和国合同法》、《中华人民共和国生物安全法》等相关法律法规的规定，甲乙双方在平等、自愿、公平、诚实信用的原则基础上，就甲方委托乙方进行基因合成技术服务的事宜，经友好协商，达成如下协议：一、服务内容1.1乙方根据甲方的需求，为甲方提供基因合成服务，包括但不限于基因序列设计、合成、表达载体构建、细胞培养、蛋白表达及纯化等。
1.2乙方应确保提供的服务符合我国相关法律法规的要求，保证服务过程中的生物安全和环境保护。
1.3甲方应向乙方提供所需的基因序列信息及相关参数，并对提供的信息的准确性、完整性和合法性负责。
二、服务期限2.1本合同自双方签字盖章之日起生效，服务期限为一年。
2.2乙方应在合同约定的服务期限内完成甲方委托的服务事项。
三、服务费用3.1乙方向甲方提供的基因合成服务费用为人民币【】元整（大写：【】元整）。
3.2甲方应按照本合同约定的付款方式及时足额支付服务费用。
3.3双方另有约定的，从其约定。
四、付款方式4.1甲方支付服务费用的方式为分阶段支付，具体支付进度如下：（1）合同签订后七个工作日内，甲方支付服务费的30%；（2）乙方完成基因合成实验并提交实验报告后，甲方支付服务费的60%；（3）乙方完成所有服务事项并经甲方验收合格后，甲方支付服务费的10%。
4.2甲方应按照约定的付款方式及时足额支付服务费用。
乙方开具正规发票。
五、违约责任5.1任何一方违反本合同的约定，导致合同无法履行或者造成对方损失的，应承担违约责任。
5.2乙方未按照约定时间完成服务事项的，应按照逾期天数向甲方支付违约金，违约金计算方式为：违约金=服务费用×逾期天数×日违约金比例。
日违约金比例为千分之三。
六、争议解决6.1本合同的签订、履行、解释及争议解决均适用中华人民共和国法律。
6.2双方在履行合同过程中发生的争议，应通过友好协商解决；协商不成的，任何一方均有权向合同签订地人民法院提起诉讼。
微型腺病毒载体的扩增和纯化研究（论文）
文章编号:0427-7104(2001D 05-0525-05微型腺病毒载体的扩增和纯化研究邰艳红1 2 王飞1 王琪1 卢大儒1 郑尊2 薛京伦1(1.复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室 上海200433;2.第二军医大学基础部细胞生物学教研室 上海200433D 摘要:微型腺病毒(mAd D 是去除所有编码基因 仅保留两侧反向末端重复序列(ITR D 及包装信号(I D 的新型腺病毒载体.它具有包装容量大 免疫原性小等优点.在大量扩增时 需与缺失E 1区及包装信号的辅助腺病毒共转染入包装细胞(293细胞D 内 S 1超离心纯化 将二者分开.再通过琼脂糖覆盖挑斑~在包装细胞内大量扩增~S 1超离心纯化等步骤 最终得到较为纯净的mAd .但因mAd 结构不稳定 易与辅助病毒发生同源重组 在S 1超离心时不能完全与辅助病毒分开 导致外源基因表达逐步下降.关键词:微型腺病毒;扩增;纯化中图分类号:G 39;R 554文献标识码:A腺病毒(AdenoviruS Ad D 因其滴度高~易于制备~转染效率高等优点 现已成为仅次于反转录病毒载体的应用最广泛的一类病毒载体[1].然而 由于腺病毒基因本身转录的病毒蛋白会诱导宿主产生细胞免疫及体液免疫 最终导致外源基因不能长期稳定地表达 且造成二次注射失败[2];目前常用的腺病毒载体(AdV D 包装容量小(约8kb D 不能容纳大片断外源基因.为了提供腺病毒载体的包装容量 降低腺病毒载体的免疫原性 提高外源基因的表达时间及可重复注射的目的 腺病毒载体的结构一直在不断的被改进[3*5].我们尝试构建去除所有病毒编码基因 仅保留两侧反向末端重复序列(ITR D 及包装信号(I D 共500bp 左右的微型腺病毒载体(mini -Ad mAd D 介导凝血F X 基因及绿色荧光蛋白报告基因(GFP D 进行大量扩增~纯化~离体及活体表达检测.由于微型腺病毒缺失所有结构蛋白基因 仅保留复制及包装所必需的顺式结构 在其大量扩增时 就必须与辅助腺病毒(E 1区缺失D 一同转入包装细胞(含腺病毒的E 1区片断D 为其提供复制及包装所需的蛋白.因此 在大量扩增2种病毒混合液后 mAd 的分离纯化是一个关键问题.本文就微型腺病毒载体的大量扩增及纯化作了初步的尝试 为其下一步的外源基因表达打下基础.1材料和方法1.1细胞系及腺病毒混合液293细胞为含有Ad 5的E 1区并持续表达E 1A 及E 1B 功能蛋白的人胚肾细胞系 由加拿大哥伦比亚大学A .Ama1Sitano 赠送;含凝血F X 基因及GFP 报告基因的微型腺病毒(mAdcFIX ;mAd D 和含B -ga1报告基因的辅助腺病毒(Ad~B D 由美国Baxter 公司张维维博士构建 由本实验室负责扩增及纯化.RSF 细胞(兔成纤维细胞系D 购自美国AT 公司.1.2mad 和adHB 混合斑(6D 的制备将高糖DMEM +10%F S (体积分数D 加入在6孔板培养的293细胞中至细胞50%铺满 改用含2%525第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究 收稿日期:2000-12-07基金项目:国家 863'项目(863-Z 20-02-01D ;国家自然科学基金(39880019D ;国家教育部优秀青年教师基金;教育部博士点基金(98024620D ;霍英东基金;全国优秀博士论文基金;教育部跨世纪人才基金资助作者简介:邰艳红(1970 D 女 医学硕士.625复旦学报(自然科学版D第40卷FCS的高糖DMEM培养基加入20pL mAd及AdHB混合液转染6h后倒去培养液.将加热的12g/L 琼脂糖与加温的2>DMEM液等量混匀调温至42C取2mL混合液轻轻地加入培养孔中室温冷却凝培养箱中.在转染第3天~第5天如法覆盖.第5~7天挑取含mAdcFIX与AdHB的混合病结后转至CO2毒颗粒的半透明空斑20个分别加入0.5mL Tris-HCl(0.01mol/mL pH=8.1D中反复吹打经37C和-80C(各5min D中冻融3次~3000r/min(4C10min D离心后留上清得到20个初次重组腺病毒斑的粗提液.用上述粗提液分别转染293细胞用琼脂糖覆盖~挑半透明感染空斑20个3次冻融和离心得到1 mL含混合腺病毒颗粒的粗提液.各取300pL粗提液转染293细胞.当观察到部分细胞有CPE反应(细胞毒性效应D时收集含混合腺病毒的293细胞用荧光显微镜和X-gal染色鉴定并筛选出荧光反应强~X-gal染色阳性率适中的克隆.1.3mad的大量扩增将首代鉴定的mAd粗提液感染在6孔板中培养的293细胞用含2%(体积分数D小牛血清的DMEM培养待90%的293细胞出现CPE反应时收集细胞~离心(3000r/min4C10min D;取沉淀细胞用0.01mol/L Tris-HCl(pH8.1D复悬(在约5>106细胞中加入0.3mL Tris-HCl液D经37C和-80 C(各5min D中冻融3次;冻融液离心取上清液为mAd粗提液.以同样方法大量扩增病毒粗提液-20 C保存;待收集培养的293-mAd细胞达150瓶(以100mL的培养瓶计算D一同超离心纯化.在每次收集病毒粗提液后取0.1mL感染105贴壁生长的RSF细胞6h后在492nm波长激发光下用荧光显微镜观察报告基因GFP的表达同时做X-gal染色.确保mAd的转染和包装良好.1.4mad的CSCI超离心纯化[3]共进行连续2次CsCl梯度超离心,在11.5mL的CsCl超离心管中依次加入0.5mL的1.5g/mL CsCl 2.5mL的1.35g/mL CsCl和2.5mL的1.25g/mL CsCl在CsCl液面上缓慢加入mAd及AdHB 5.5mL用石蜡油封顶并配平.离心条件为8150kg(S 41离心机STS型转头D1h.离心后抽取1.35 g/mL和1.25g/mL CsCl之间的单一病毒带.将抽取的病毒液与1.35g/mL CsCl按1:5混匀加入11. 5mL离心管内离心条件为8150kg18h.2条病毒带分别位于距管底2.7cm 3.5cm处.分别抽取至透析盒中用PBS透析3次(每次透析液3000mL D第4次透析液采用10%(体积分数D甘油-PBS每次2 ~3h;纯化产物分装于-20C暂时保存备用.1.5二种病毒的浓度测定取纯化的腺病毒颗粒5pL加120~125pL第4次透析液(PBS+10%(体积分数D甘油D混匀以第4次透析液为空白对照紫外分光光度计(波长260nm D比色根据D(260D值计算Ad颗粒数(mL-1D,即D(260D>稀释倍数>1012.1.6mad的纯度检测将2种病毒纯化液分别加入到70%融合的培养RSF细胞的6孔板内(102particles/cell D6h后在492nm激发光下以荧光显微镜观察一孔细胞的GFP表达另一孔细胞用4%(体积分数D多聚甲醛固定10min X-gal染色4h后再在荧光显微镜下观察GFP的表达同时在普通光学显微镜下观察B-gal的表达情况计算表达报告基因的细胞所占比例.2结果2.1GFP表达的稳定性检测在进行mAd大量扩增的过程中为了使得到的mAd始终保持较高活力我们对每一代扩增的病毒粗提液都进行报告基因GFP的表达检测发现GFP的表达很不稳定其中第1代mAd中GFP表达的细胞约占100%而到第5代降为60%到7代以后降到30%以下(图1所示D.图1mAd 扩增后RSF 细胞GFP 的表达情况Fig .1The expreSSion of GFP in RSF cellS after mAd S amplification .A .第一代;.第五代;C .第七代;D .未感染腺病毒的RSF 细胞.GFP 位于核周(-)2.2mad 的超离心纯化及浓度测定通过连续2次CSCl 梯度超离心 最终在1.35g /mL 和1.25g /mL CSCl 之间得到2条界限不明显的病毒宽带 分别抽取2条病毒带(上方为浮密度小的mAd 距管底3.5cm 下方为浮密度大的Ad~B 距管底2.7cm 测D (26O) 计算病毒颗粒含量 mAd 为2.3>1O 11mL -1;Ad~B 为4.5>1O 11mL -1.2.3mad 的纯度检测感染mAd 组的RSF 细胞在荧光显微镜下可见表达GFP 的细胞占83% X -gal 染色后仅见极少蓝染细胞;感染Ad~B 组RSF 细胞在荧光显微镜下可见GFP 表达占23% X -gal 染色后蓝染细胞占97%(图2所示) 而未感染腺病毒的对照组未见荧光及蓝染(未显示).图2mAd 的纯度检测Fig .2The detection of mAd S purity .A .感染mAd 的RSF 细胞GFP 表达(-);.感染mAd 的RSF 细胞的GFP 表达(Y )及X -gal 染色(-);C .感染Ad~B 的RSF 细胞后GFP 表达(-);D .感染Ad~B 的RSF 细胞的GFP 表达(Y )及X -gal 染色(-)3讨论本实验通过大量扩增~CSCl 超离心纯化 成功地得到了颗粒含量较高且较为纯净的mAd 纯化液.其携带的报告基因GFP 的表达检测证明 mAd 介导外源基因可以在离体培养细胞内较高水平地表达 但同时也发现 mAd 感染的细胞中偶尔也可检测出B -gal 的表达 即mAd 中掺杂有约1%的Ad~B .这种现象应从微型腺病毒载体系统本身的结构分析(图3 此图为本室自制):(1)mAd 缺失所有结构基因 仅保留725第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究500bp 左右的顺式结构,它与野生型腺病毒的结构差异性最大,因此其结构的稳定性也最差,因此,Ad~B 的包装能力远大于mAd ,造成Ad~B 的优先包装(3D .(2D 由于mAd 的结构特点,在复制及包装时,必需有Ad~B 与其共转染293细胞(内含E 1区片断D 为其提供反式补偿.(3D mAd 与Ad~B 及293细胞内E 1区之间存在一定的同源序列.在一定条件下可发生同源重组而产生新的病毒(3,7D .由于以上三种原因,使扩增mAd 过程中产生大量重组病毒,其长度介于mAd 与Ad~B 之间.这样就导致mAd 携带的报告基因的逐步丢失,随扩增代数的增加,GFP 表达下降.而且在CSCI 超离心纯化时2种病毒带界限不清或形成宽带,造成分离的困难.因此在大量制备mAd 时,应注意仅保留扩增的前几代病毒,尽量减少同源重组的机会.尽管目前仅有几个实验室在进行微型腺病毒的研究,腺病毒的同源重组问题仍然引起了极大的关注,并尝试了各种解决的方法.除尝试不同的CSCI 超离心条件外,ParkS 等[8~11]在辅助型腺病毒的包装信号两侧插入IoXP 位点后,与mAd 共转染入293Cre (持续表达Cre 重组酶的293细胞D 细胞中扩增,这样可以通过同源重组将IoXP 位点之间的包装信号缺失,并保证辅助型腺病毒结构的稳定性,有效减少了辅助病毒与mAd 及包装细胞之间的同源重组,同时也降低了辅助病毒的包装效率,氯化铯梯度超离心后,辅助病毒的污染率明显降低.但并未从根本上将2种病毒完全分开.因此,要完全将2种病毒分开,从而得到高纯度的mAd ,除进一步摸索最佳的实验条件外,最根本的手段是进一步改进微型腺病毒载体系统本身的结构,增加其结构稳定性,最大限度地降低同源重组的发生.图3介导F X 的微型腺病毒载体系统简图Fig .3The SimpIe deScription of mAd vector Which mediateS factor XCA :CMV 人actin 启动子9EF :人延长因子启动子参考文献:[1]候云德.分子病毒学[M ].北京:学苑出版社,1990.151-180.[2]Piedra P A ,Poveda G A ,RamSey B .Incidence and prevaIence of neutraIizing antibodieS to commonadenoviruSeS in chiIdren With cyStic fibroSiS :ImpIication for gene therapy With adenoviruS vectorS [J ].PeClCtllCS ,1998,lol(6D :1013-1019.[3]AIemany R ,Dai Yi -fan ,Yan Chun -Iou ,et Cl .CompIementation of heIper -dependent adenoviraI vector :Size effectS and titer fIuctuationS [J ].J vllol meth ,1997,68:147-159.[4]Moorhead J M ,CIayton G ~,Smith R L .A repIication -incompetent adenoviruS vector With thepreterminaI protein gene deIeted efficientIy tranSduceS mouSe earS [J ].J vllol ,1999,73(2D :1046-1053.825复旦学报(自然科学版D 第40卷[5]Morsy M A*Gu M C*Motzel S*et al.An adenoviral vector deleted for all viral coding seguences resultsin enhanced safety and extended expression of a leptin transgene[J].P1oc Natl Acac Sci*1998*95:7866-7871.[6]Kochanek S*Clemens P R*Mitani K*et al.Anew adenoviral vector:Replacement of all viral codingseguences with28kb independently expressing both full-length dystrophin and B-galactosidase[J].P1oc Natl Acac Sci*1996*93:5731-5736.[7]Lochmuller~*Jani A*~uaro J*et al.Emergence of early region1-containing replication-competentadenovirus in stocks of replication defective adenovirus recombinants(A E1A E3)during multiple passages in293cells[J].Pum Gene the1*1994*5:1485-1491.[8]Parks R J*Chen L*Anton M*et al.A helper-dependent adenovirus vector system:Removal of helpervirus by Cre-mediated excision of the viral packaging singal[J].P1oc Natl Acac Sci*1996*93:13565-13570.[9]Schiedner G*Morral N*Parks R J*et al.Genomic DNA transfer with a high-capacity adenovirusvector results in improved in UiUo gene expression[J].Natu1e Genet*1998*18:180-183.[10]~aecker S E*~ansell~*Stedman~*et al.Ln UiUo expression of full-length human 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novel adenoviral vector that contains only the viral inverted terminal repeat seguences(I T R)*packaging signal and ci S-acting elements reguired for viral DNA replication and packaging.MAd vector has larger capacity and lower immunogenicity*which showed its proprietary prospect in the field of gene therapy.F or amplification of mAd vector*the cells must be co-transfected with mAd and helper Ad that deleted E1region and packaging signal for packaging cells.T hrough plague assay*amplification and propagation*the density of purified mAd was2.3>1011mL-1.~owever*mAd genome was found unstable and with1%contamination of helper Ad.T he amplification and purification of mAd were discussed.Keywords:Mini-Adenovirus;amplification;purification 925第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究微型腺病毒载体的扩增和纯化研究作者：邰艳红， 王飞， 王琪， 卢大儒， 郑尊， 薛京伦作者单位：邰艳红(复旦大学生命科学学院遗传学研究所;第二军医大学基础部细胞生物学教研室)，王飞,王琪,卢大儒,薛京伦(复旦大学生命科学学院遗传学研究所)， 郑尊(第二军医大学基础部细胞生物学教研室)刊名：复旦学报(自然科学版)英文刊名：JOURNAL OF FUDAN UNIVERSITY年，卷(期)：2001,40(5)1.候云德分子病毒学 19902.Piedra P A;Poveda G A;Ramsey B Incidence and prevalenc e of neutralizing antibodies to common adenoviruses in children with cystic fibrosis:Implication for gene therapy with adenovirus vectors [外文期刊] 1998(06)3.Alemany R;Dai Yi-fan;Yan Chun-lou Complementation of helper-dependent adenoviral vector: Size effects and titer fluctuations 19974.Moorhead J M;Clayton G H;Smith R L A replication-incompetent adenovirus vector with the preterminal protein gene deleted efficiently transduc es mouse ears[外文期刊] 1999(02)5.Morsy M A;Gu M C;Motzel S An adenovi ral vector deleted for all viral coding sequences resultsin enhanced safety and extended expression of a leptin transgene[外文期刊] 1998(14)6.Kochanek S;Clemens P R;Mitani K Anew adenoviral vect or:Replacement of all viral coding sequences with 28 kb independently expressing both full-length dystrophin and β-galactosidase 19967.Lochmuller H;Jani A;Huaro J Emergence of early regio n 1-containing replication-competent adenovirus in stocks of replication defec tive adenovirus recombinants (△E1+△E3) during multiple passages in 293 cells 1994(05)8.Parks R J;Chen L;Anton M A helper-dependent ade novirus vector system:Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging singal[外文期刊] 19969.Schiedner G;Morral N;Parks R J Genomic DNA transfer with a high-capacity adenovirus vector results in improved in v i vo gene expression 199810.Haecker S E;Hansell H;Stedman H In vivo express ion of full-length human dystrophin from adenoviral vectors deleted of all viral genes 1996(07)11.Lieber A;Chen Y H;Kay M A Adenoviral preterminal protein sta bilizes mini-adenoviral genomes in vitro and in vivo[外文期刊] 199712.Lieber A;Steinwaerder D S;Carlson C A Integrating a denovirus-adeno-associated virus hybrid vectors devoid of all viral gene 1999(11)13.Steinwaerder D S;Carlson C A;Lieber A Generation of adenovirus vectors devoid of all viral genes by recombination between inverted repeats[外文期刊] 1999(11)引用本文格式：邰艳红.王飞.王琪.卢大儒.郑尊.薛京伦微型腺病毒载体的扩增和纯化研究[期刊论文]-复旦学报(自然科学版) 2001(5)。
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那么合同要怎么拟定？想必这让大家都很苦恼吧，以下是我为大家收集的个人技术服务合同范本，欢迎大家共享。
个人技术服务合同范本1甲方:乙方:现有工程,甲方因施工现场项目管理人员阅历不足,特托付乙方对甲方的现场管理人员进行技术支持和指导。
本工程(协议书)本着公允、公正、诚恳守信、协议双方自愿的原则,详细约定内容如下:一、工程名称:二、工程施工地点:三、工程专业:中水工程四、技术支持范围:中间计量、现场签证、工程变更、试验、工程资料(包含平安资料,不包含施工方案) 五、合同签订时间:x年月日合同截止时间:六、合同金额:小写:1x0 元。
大写:壹拾贰万元整。
七、合同形式:固定价格合同,合同价格固定不变。
(此价格只包含合同范围内的工作,若增加项目需另收取费用) 八、甲方的权利和义务:1、按合同约定的付款式支付乙方的技术服务费用;2、向乙方供应技术服务时所须要的车辆及相关人员,并负责将乙方送回乙方指定地点; 3、乙方技术服务时(施工现场)向乙方供应午餐和晚餐及人员住宿; 4、乙方若无重大过错不得终止合同的履行,乙方若拒绝履行应履行的义务,甲方有终止合同履行的权利。
5、甲方担当合同价款的税金,并以现金的形式支付给乙方;6、供应乙方临时运用的办公室、办公桌、打印机、台式电脑一台、资料编制软件一套、打印用的纸张及施工中有关文具用品、试验仪器和试验化学药品。
7、协作乙方办理施工许可证和开工前的全部手续九、乙方的权利和义务:1、负责工程从开工进场到竣工资料移交且工程结算完成的全过程技术服务。
主要内容为施工过程中的计量申报、现场签证、工程变更、竣工结算、施工过程中的试验检测及资料编制(包含平安资料)。
2、不得无故中断或终止技术服务,工程未竣工验收结算、资料移交之前,不得终止技术服务。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
生物技术委托合同8篇
生物技术委托合同8篇篇1甲方（委托方）：__________统一社会信用代码：__________地址：__________法定代表人：__________联系电话：__________电子邮箱：__________乙方（受托方）：__________生物技术有限公司统一社会信用代码：__________地址：__________法定代表人：__________联系电话：__________电子邮箱：__________鉴于甲方需就生物技术的特定事项委托乙方进行研究和开发，双方根据《中华人民共和国合同法》等相关法律法规的规定，本着平等、自愿、诚实信用的原则，经友好协商，达成如下协议：第一条委托事项1.1 甲方委托乙方进行生物技术的研发及相关事项的处理。
具体包括但不限于以下事项：____________。
（此处列举具体委托事项，如生物技术的研究、开发、试验、专利申请等。
）第二条合作范围与方式2.1 乙方应按照甲方的要求，提供生物技术方面的专业知识和技能，完成甲方委托的任务。
2.2 双方应共同制定项目计划，明确项目进度、质量要求、验收标准等。
2.3 乙方在研究开发过程中，应及时向甲方报告进展情况，协商解决遇到的问题。
第三条双方的权利与义务3.1 甲方的权利与义务：（1）甲方有权要求乙方按照约定的时间和要求完成委托事项；（2）甲方有义务提供乙方所需的研究资料和数据；（3）甲方有义务支付乙方相应的报酬。
3.2 乙方的权利与义务：（1）乙方有权获得甲方支付的报酬；（2）乙方有权要求甲方提供研究所需的相关资料和数据；（3）乙方应按照约定的时间和要求完成委托事项；（4）乙方应对甲方的技术资料和数据承担保密义务。
第四条进度与交付4.1 双方应根据项目计划制定具体的进度安排，明确各阶段的时间节点和交付物。
4.2 乙方应按照约定的时间节点完成各阶段的任务，并及时向甲方交付相应的成果。
4.3 如因乙方原因未能按时完成委托事项，乙方应承担相应的违约责任。
重组腺相关病毒（AAV）载体构建技术原理
重组腺相关病毒（AAV）载体构建技术原理腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微⼩病毒科（parvoviridae）家族的成员之⼀，是⼀类⽆法⾃主复制、⽆被膜的⼆⼗⾯体微⼩病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。
研究中采⽤的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在⾮致病的野⽣型AAV基础上改造⽽成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性⾼、宿主细胞范围⼴（对分裂细胞和⾮分裂细胞均具有感染能⼒）、扩散能⼒强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之⼀。
AAV基因组结构悬浮框：包装纯化及滴度检测--侵染细胞过程-- rAAV载体优势—rAAV⾎清型选择—应⽤案例rAAV包装纯化及滴度检测AAV包装过程中，包装质粒负责编码⽬的基因以及两个末端反向重复序列（ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作⽤），辅助质粒包含AAV包装所需的cap（编码病毒⾐壳蛋⽩）和rep（参与病毒的复制）基因，以及腺病毒Helper质粒。
三种质粒共同转染293T细胞后，AAV病毒开始复制和包装。
和元⽣物腺相关病毒的⽣产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采⽤三质粒系统在293T细胞中进⾏包装。
所获得的病毒颗粒经过超速离⼼纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进⾏滴定。
另外，我们也可以根据使⽤者要求，提供蛋⽩染⾊检测⾐壳蛋⽩的完整性以及内毒素含量等。
⼀般情况下rAAV的滴度在1012~1013VG/ml，完全可以满⾜各类整体实验的使⽤要求。
AAV包装流程图滴度检测⽅法：定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。
滴度检测原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA，外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术效劳合同书
1．甲方所提供之腺病毒产品需通过严格的质量操纵，其所携带的基因通过测序确证无误。
2．甲方的腺病毒产品通过快递公司送达乙方。
3．若是乙方对产品质量有任何异议，请在货到后一周内及时与甲方联系，甲方将复核产品的质量状况，并给予乙方中意的回答。
第五条甲方应在_________年_________月_________日前完成技术效劳工作，并向乙方提交以下功效及其报告：
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术效劳合同书
效劳方（甲方）：_________
地 址：_________
邮 编：_________
电 话：_________
传 真：_________
e-mail：_________
开户银行：_________
帐 号：_________
委托方（乙方）：_________
第二条费用及价钱（人民币）
1．病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买；
2．合同总价_________元，（大写）_________。
第三条乙方责任
1．乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能操纵的实验组中进行实验研究，在任何情形下决不用于人类，决不用于以谋利（直接或间接）为目的的生物制药和临床分析等方面。
地 址：_________
邮 编：_________
电 话：_________
传 真：_________
甲乙两边依照《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原那么下，经协商一致，订立本合同，以兹两边一路遵循执行。
第一条病毒名称
甲方同意乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_________腺病毒，腺病毒滴度_________pfu/ml。
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腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术
服务合同书
服务方（甲方）：_________
地址：_________
邮编：_________
电话：_________
传真：_________
e-mail：_________
开户银行：_________
帐号：_________
委托方（乙方）：_________
地址：_________
邮编：_________
电话：_________
传真：_________
甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。
第一条病毒名称
甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_________腺病毒，腺病毒滴度_________pfu/ml。
第二条费用及价格（人民币）
1．病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买；
2．合同总价_________元，（大写）_________。
第三条乙方责任
1．乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利（直接或间接）为目的的生物制药以及临床分析等方面。
2．未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、出售或租借给他人使用。
3．保证乙方应用甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品进行的研究符合现行的法律法规，不得应用甲方腺病毒产品进行有损于人类安全或其它非法目的的研究。
4．所有在研究过程中经本产品及其一切复制、衍生产品处理过之动物、植物、蛋类以及乳制品等均应妥善处理，决不可食用或出售。
5．乙方及乙方的课题组在发表文章中注明该重组腺病毒购自甲方，并将已发表文章复印一份给甲方。
6．甲方的腺病毒产品是由人5型腺病毒改造而来，在特殊情况下仍可能具有一定的致病性，乙方必须遵守国家安
全使用腺病毒原则。
任何违反该原则而引起的实验人员或其他人员的健康问题，甲方概不承担法律责任。
7．若乙方不再应用本产品须将其销毁或返还甲方。
8．乙方承诺在使用本产品的过程中不会做出任何有损于甲方的言论或行为。
9．乙方对其提供技术服务的病毒不得转卖、转送及商业化用途。
10．乙方在收到甲方提供的腺病毒制品后，应立即将其分成小份装于无菌的病毒冻存管中并低温保存于-20℃，避免反复冻融而导致病毒滴度下降。
由于使用不当引起的质量问题由乙方承担。
第四条甲方责任
1．甲方所提供之腺病毒产品需经过严格的质量控制，其所携带的基因经过测序确证无误。
2．甲方的腺病毒产品通过快递公司送达乙方。
3．如果乙方对产品质量有任何异议，请在货到后一周内及时与甲方联系，甲方将复核产品的质量状况，并给予乙方满意的答复。
第五条甲方应在_________年_________月_________日前完成技术服务工作，并向乙方提交下列成果及其报告：1．成果：重组腺病毒，分别为_________。
2．载体构建流程报告。
3．病毒重组及鉴定报告。
4．病毒颗粒数检测报告。
5．病毒滴度检测报告。
6．病毒纯度hplc检测报告。
第六条付款方式
1．乙方在合同签订当日应当支付合同费用的1/3，即人民币_________。
2．甲方向乙方提交第六条所列的成果当天，乙方支付合同费用的1/3，即人民币_________。
3．甲方向乙方提交第六条所列的报告当天，乙方最后支付合同费用剩余的款项，即人民币_________。
第七条违约责任
1．甲方如不按时向乙方提交第六条所列的成果，每拖延一天，应向乙方偿付合同金额千分之三的违约金。
2．合同履行期间，乙方不得自行解除本合同，否则乙方总额向甲方支付违约金。
第八条争议解决方法
乙方对产品质量有任何异议，在货到后一周内及时与甲方联系，甲方将复核产品的质量状况，并给予乙方明确的答复。
本合同未尽事宜，双方可另行协商解决。
合同履行期间双方发生争议，不能协商解决的，由合同履行地所在仲裁委
员会仲裁解决。
第九条其他约定
1．备注：_________（甲乙双方需增加的条款）
2．本合同一式两份，甲乙双方各执一份，并具有同等法律效力。
3．本合同的附件具有同等法律效力。
4．本合同经双方签字并加盖公章后即生效。
甲方（盖章）：_________ 乙方（盖章）：_________ 代表人：_________代表人：_________
研究生导师：_________
_________年____月____日_________年____月___
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