小肠结肠炎耶尔森氏菌
肠杆菌科的分类与鉴定
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粘质沙雷菌在营养琼脂平板上的菌落特征（18—24h）
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4、 哈夫尼亚菌属的分类鉴定
该菌属只有一个种,即:蜂房哈夫尼亚菌。其 特点是;不分解乳糖;发酵葡萄糖产酸产气; 动力“+”;I “—” ;V-P “+”;C “+”;赖 氨酸“+” ;鸟氨酸“+” ;H2S “—” ;山梨 醇“—” ;棉籽糖“—” 。
约克纳菌属 Yokenella 肠道菌 58 群 Enteric group 58 肠道菌 59 群 Enteric group 98 肠道菌 60 群 Enteric group 60 肠道菌 63 群 Enteric group 63 肠道菌 64 群 Enteric group 64 肠道菌 68 群 Enteric group 68 肠道菌 69 群 Enteric group 69 肠道菌 137 群 Enteric group 137
沙雷氏菌属中具有临床意义的有三个种,即:粘质 沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、深红色沙雷氏菌。
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生化反应 山梨醇 阿拉伯糖
粘质沙雷氏菌 + —
液化沙雷氏菌 + +
深红色沙雷氏菌 — +
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+ —
粘质沙雷氏菌
沙雷氏菌属
山梨醇
+ 阿拉伯糖
—
+
+
液化沙雷氏菌
深红色沙雷氏菌
肠杆菌科的分类与鉴定
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肠杆菌科是临床上最常见的一类革兰氏 阴性杆菌,它主要存在于人或动物的肠道 以及自然界的水源、土壤中。在正常情 况下,多数肠杆菌科细菌对人是无害的,有 些菌种还是人体所必需的,这是因为肠杆 菌科在正常寄生部位和正常寄生数量的 条件下对人体具有重要的生理作用:
食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检测技术研究
食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检测技术研究作者：陈学强来源：《现代食品·下》2017年第04期摘要：小肠结肠炎耶尔森氏菌是重要的食源性致病菌，如何有效地检测该菌是预防和减少食品安全问题的关键环节。
本文较为系统地介绍了利用常规分离鉴定、免疫学、分子生物学和生物质谱等技术手段检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，最后对小肠结肠炎耶尔森氏菌检测技术的现状进行分析，并对发展趋势进行了预测。
关键词：耶尔森氏菌；分离鉴定；免疫学技术；分子生物学技术；生物质谱技术Abstract：Yersinia enterocolitica is an important food borne pathogen， how to effectively detect the bacteria is the key to prevent and reduce food safety issues. This paper systematically introduces the method of using conventional isolation and identification， immunology， molecular biology and biological mass spectrometry techniques to detection of Yersinia enterocolitica systematically， analyses the status of Yersinia enterocolitica detection techniques and predicts the development of future finally. enterocolitis Yersinia enterocolitica， the final status of enterocolitis Yersinia enterocolitica detection technology are analyzed， and the development trend.Key words：Yersinia； Isolation and identification； Immunological technique； Molecular biology technology； Biological mass spectrometry中图分类号：TS207.4小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）是一种广泛分布的细菌，可存在于生鲜蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品等食品中。
检验小肠结肠炎耶尔森菌(腹泻粪便中)的临床价值观察
检验小肠结肠炎耶尔森菌（腹泻粪便中）的临床价值观察发表时间：2018-07-27T15:50:48.733Z 来源：《航空军医》2018年9期作者：杜丹曹军[导读] 相较于培养法而言，采用RT-PCR法检验腹泻粪便中小肠结肠炎耶尔森菌效果更加突出，值得临床推广应用。
（郴州市第一人民医院生殖医学中心 423000）摘要：目的观察腹泻粪便中小肠结肠炎耶尔森菌的检验方法与效果。
方法收集2015年3月——2017年12月我院感染性疾病科收治的腹泻50例患者临床资料，回顾性分析培养法与RT-PCR法在本组小肠结肠炎耶尔森菌的检验结果。
结果RT-PCR法阳性检出率明显（24.00%）明显高于培养法（8.00%），差异具有统计学意义（P＜0.05）。
结论相较于培养法而言，采用RT-PCR法检验腹泻粪便中小肠结肠炎耶尔森菌效果更加突出，值得临床推广应用。
关键词：小肠结肠炎；耶尔森菌；腹泻；检验价值小肠结肠炎是一组临床严重肠道感染疾病，耶尔森菌属（Yersinia）是本病主要传染病菌，患者多伴有胃肠道炎症与腹泻症状，疾病的进展可出现呼吸道、骨骼等病理表现，增加了败血症发生几率[1]。
培养法与RT-PCR法检测小肠结肠炎耶尔森菌的主要方法，但就二者机体体检验效果，仍需临床研究证实[2]。
本文收集2015年3月——2017年12月我院感染性疾病科收治的腹泻50例患者临床资料，观察腹泻粪便中小肠结肠炎耶尔森菌的检验方法与效果，现报道如下，供临床参考。
1资料与方法1.1一般资料收集2015年3月——2017年12月我院感染性疾病科收治的腹泻50例患者临床资料；本组患者年龄5个月~75岁，平均年龄（31.05±8.48）岁，其中男性32例，女性18例；患者入院均表现排便次数增加，每日排便次数超过3次以上，且粪便可见其形状明显发生改变；本次研究内容获得院方伦理会批准，患者及其家属均知情并自愿签署同意书。
1.2方法所有患者均接受耶尔森菌的培养法与RT-PCR法检测，采集患者粪便样本，加入Cary-Blair保存液，取得0.5g粪便，置入生理盐水4.5ml，将其混合后置于增菌液中培养；随后采取RT-PCR检测，将粪便样本置放于16℃环境内予以保存，在培养18h后，取出200μg混合物，提取其DNA液，反应体系包括BSA、探针、模板、引物、反应混合液等；扩增产物长度为154bp，于95℃环境下反应；培养法检验中，将采集的分辨标本置入16℃环境下保存，在培养18h后取出5.0μg混合物，在CIN平板上接种，随后调整培养条件，即温度为25℃，培养24h，将其中可疑菌落筛出，随后予以标准菌株完成比对，判定阴性。
5 食物中毒性细菌及其检验
大肠杆菌的生物学特性
基本形态：
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约 0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成
双，但不呈长链排列。约50%的菌株有
选择性增菌 生鲜食物、严 重污染的食品 和动物饲料 分离培养 生化鉴定
血清学
35℃、24h 43℃、24h（水浴培养） 含菌量高 含菌量低 划线接种 选择性培养基（BS、XLD、HE） 35℃、24~48h（BS） 每个平板挑取至少2个可疑菌（包括典型和非典型各2个） 接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面（LIA高层深4cm） （松盖以保持有氧条件防止产生过多H2S） 35℃、24±2h 弃去 尿素酶试验 卫矛醇、 氰化钾、丙二酸钠、吲哚试验 阳性 阴性 血清学试验——沙门氏菌的分类
败血症型：常见的致病菌为猪霍乱或鼠伤寒沙门氏菌。 多见于婴幼儿儿童
感冒型：
霍乱型：可出现严重脱水以至循环衰竭。
沙门氏菌主要来源是患病人和动物(牛、猪、羊、家禽等)的肠 道、血液、粪便、尿液，一般情况下肠道带菌率较高。
预防中 毒措施
防止食品原料和成品被污染 控制生长繁殖 食前彻底加热杀菌
WHO则将其定义为“凡是通过摄食 进入人体内的各种致病因子引起的、 通常具有感染性质或中毒性质的一 类疾病”。
食物中 毒的来 源
食物被某些病原微生物污染 进食被毒物污染的食品 食物本身含有天然有毒成分 摄入外形与普通食物相似，而实际含有毒成分 的某些动植物 此外，在食品中滥加营养素，对人体也有害 食物发生生物性或物理化学性变化而产生或增 加了有毒物质
沙门氏菌检验选择性分离培养
HE琼脂：
FDA BAM——典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色
中国小肠结肠炎耶尔森菌流行现状及其研究进展
中国小肠结肠炎耶尔森菌流行现状及其研究进展陈邬锦【摘要】小肠结肠炎耶尔森菌在我国分布广泛,存在一定的地域、人群、时间等流行病学差异.随着我国分子流行病学的发展,许多基于分子、核酸水平的新技术及新方法不断被运用在小肠结肠炎耶尔森菌的病原生物学研究中.本文针对目前我国小肠结肠炎耶尔森菌的人群间、动物间及不同时间、地区间的流行病学差异、病原生物学研究、主要分子分型及毒力基因研究进行综述.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2015(031)004【总页数】5页(P380-384)【关键词】小肠结肠炎耶尔森菌;流行现状;分子分型;毒力基因【作者】陈邬锦【作者单位】大理学院公共卫生学院,大理 671000【正文语种】中文【中图分类】R378.2耶尔森氏菌属中致病性菌主要有鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌以及小肠结肠炎耶尔森菌[1]。
其中小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica，简称Y．e)是一种人兽共患病原细菌，广泛分布于自然界，可感染家畜、家禽、啮齿类动物、鸟类及昆虫等，也是少数能在冷藏温度下生长的肠道致病菌之一。
该菌主要通过粪口途径传播。
海产品、蛋类、鲜(生)奶及市售糕点、饮料、速(冷)冻食品中均曾检出小肠结肠炎耶尔森菌[2-3]；在家用、餐馆及医院冰箱中也曾检出小肠结肠炎耶尔森菌[4]。
该菌不仅能引起腹泻等消化道疾病，还能引起呼吸系统、心血管系统、骨骼、结缔组织和全身性疾病。
中国在20世纪80年代曾有过两次小肠结肠炎耶尔森菌的流行[5]，第1次于1986年发生在兰州市某奶牛厂，发病107人，从患者排泄物和食物中分离出的小肠结肠炎耶尔森菌为生物3型、血清O∶3型。
另一次于1987年发生在沈阳市某中学学生食堂，造成500余人被感染，从352名患者排泄物和食物中分离出的小肠结肠炎耶尔森菌为生物3型、血清O∶9。
1.1 宿主分布小肠结肠炎耶尔森菌病作为一种人兽共患病其动物宿主广泛，目前已发现30多种动物携带小肠结肠炎耶尔森菌[6]。
感染性腹泻的诊断标准及处理原则GB1701中国疾病预防控制中心
感染性腹泻的诊断标准及处理原则GB 17012—1997~`前言感染性腹泻广义系指各种病原体肠道感染引起之腹泻。
本标准则仅指除霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒以外的感染性腹泻。
为《中华人民共和国传染病防治法》中规定的丙类传染病。
主要包括细菌、病毒、原虫等病原体引起之肠道感染，较常见的如沙门菌肠炎、肠致泻性大肠杆菌肠炎、致泻性弧菌肠炎、空肠弯曲菌肠炎、小肠结肠炎耶尔森菌肠炎、轮状病毒肠炎、蓝氏贾第鞭毛虫肠炎等。
其临床表现均可有腹痛、腹泻，并可有发热、恶心、呕吐等症状；处理原则亦相似，但不同病原体引起之腹泻，在流行病学、发病机理、临床表现及治疗上又有不同特点。
有的为炎症型腹泻，有的为分泌型腹泻，最后确诊须依赖病原学检查。
感染性腹泻是我国的常见病和多发病，尤以夏秋季更为多见，制定本标准对本组病的防治有重要意义。
根据《中华人民共和国传染病防治法》和《中华人民共和国传染病防治法实施办法》的规定，制定本组疾病的诊断标准及处理原则。
本标准的附录A是提示的附录。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。
本标准由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所及北京医科大学第一医院负责起草。
本标准主要起草人：张树波、陈晶晶、肖东楼、沈宝铨、王勤环。
本标准由卫生部委托技术归口单位中国预防医学科学院负责解释。
1 范围本标准规定了除霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒以外的感染性腹泻的诊断标准及处理原则。
本标准适用于各级医疗卫生防疫机构对此范围的感染性腹泻的诊断及防治依据。
2 定义本标准采用下列定义。
2．1 炎症型腹泻inflammatory diarrhea指病原体侵袭肠上皮细胞，引起炎症而导致的腹泻。
常伴有发热，粪便多为粘液便或脓血便，镜检有较多的红白细胞，如侵袭性大肠杆菌肠炎、弯曲菌肠炎等。
2．2 分泌型腹泻secretory diarrhea指病原体刺激肠上皮细胞，引起肠液分泌增多和／或吸收障碍而导致的腹泻。
病人多不伴有发热，粪便多为稀水便。
镜检红白细胞不多，如肠产毒大肠杆菌肠炎、轮状病毒肠炎等。
《小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》编制说明
《食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》编制说明一、标准起草的基本情况2011年原卫生部（现国家卫生计生委）牵头组织开展食品卫生微生物学标准的修订工作，小肠结肠炎耶尔森氏菌的测定方法被列入修订。
本标准起草单位为江苏省疾病预防控制中心，起草人包括袁宝君、唐震、沈赟、庄凌、乔昕、王艳梅、巢国祥、徐勒、郑东宇。
二、标准的重要内容及主要修改情况（一）标准主要修改的内容1. 修改了标准的中文名称；2. 修改了典型菌落的形态描述；3. 删除了生化鉴定中的商品化名称；4. 修改了附录A。
（二）修改依据及说明1．修改了标准的中文名称按照食品安全国家标准编制的规范要求将标准的中文名称进行了修改，将原来的《食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》修改为《食品安全国家标准食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》。
2．修改了典型菌落的形态描述根据征求意见函中专家建议及结合2008版国标近几年的使用情况,在本次修订过程中增加了CIN-1琼脂平板的典型菌落形态描述，形态描述结合FDA BAM( 2007)及GB/T 4789.8-2008的描述方式由原来的“红色牛眼状菌落”修改为“深红色中心，周围具有无色透明圈（红色牛眼状菌落）,菌落大小为1-2mm”，通过对典型菌落形态的详细描述有利于国将“Vitek GNI 全自动微生物生化分析仪”修改为“生化鉴定试剂盒标使用者在分离该菌的过程中能够较易查找并发现目标菌，提高对本菌的检出率。
3. 删除了生化鉴定中的商品化名称或全自动微生物生化鉴定系统删除“4.11 API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK GNI+生化鉴定卡”。
传统的微生物鉴定主要参考《伯杰式细菌鉴定手册》和《真菌鉴定手册》，鉴定过程繁琐耗时长，容易出错，对经验要求非常高。
商品化的自动微生物系统有效地解决了这个问题，目前自动微生物鉴定系统从原理上包括以下几种：1)基于表型的鉴定方法；2)基于基因型的鉴定方法； 3)基于蛋白的鉴定方法；三类方法各有优缺点，理论上不冲突，应该互为补充，基于系统生化仍是国际上微生物鉴定的金标准，所以本标准仍然将基于表型的鉴定方法之一的系统生化鉴定作为微生物鉴定的确证方法。
粪便中分离出1株小肠结肠炎耶尔森菌
文 章 编 号 ： ６ ２９ ５ （ ０ ９ ０ ０ １０ｌ １ ７ ４ ５ ２ ０ ） 卜０ ６ －
血 小 板 计 数 结 果 的准 确 性 直 接 影 响 临 床 诊 断 和临 床 治 疗 ， 不 同于 其 他 血 液 细 胞 ， 小 板 本 身 是 一类 较脆 弱 易 破 坏 的 血 细 血
ｍ ｕｎ ｐ ｎ ｙ ｃ ｈａ ａｃｅ ｉａ ｉ ｏ ｐ ｄｉｔ ｉ ａｎ ａ ｏ ｈｅ ｏｔ ｐｉ ｃ ｒ ｔ ｒｚ ｔｏｎ ｆ ｅ ａ ｒｃ ｄ ｄｕｌ ｔ ｍ ｉ ｍ ａ ｌ ｄ ｆｅ ｅ ｔａ ｅ ａ ｕｔ ｍ ｙ ｌ ｉ ｌ ｕ ｍ ｉ （Ａ Ｍ Ｉ一 ｎｉ ｌｙ ｉｆ ｒ ｎ ｉｔ ｄ ｃ ｅ ｅ ｏｄ ｅ ｋｅ ａ
参 考 文 献
巨脾 、 中海 贫 血 收 人 普 通 外 科 ， 院 后 做 了血 红 蛋 白 电 泳 和 地 人
血 液 常 规 检 查 。 血 红 蛋 白 电 泳 结 果 为 ： 红 蛋 白 Ｈ（ Ｈ） 血 Ｈｂ
１． （ 常 为 ０ ） Ｈｂ 包 涵 体 ７ ． （ 常 为 ０ ５ ） 二 ３５ 正 ， Ｈ １５ 正 — ， 者结 果 显 示 明 显 增 高 ， Ａ ８ ．２ （ 常 为 ９ ．９ 一 Ｈｂ ３ 正 ４ ９ ． ％） 显 示 下 降 。 入 院 后 先 后 做 了 ５次 全 血 细 胞 分 析 ， 血 ７６ ， 其 小板 计 数 结 果 如 下 ， ０日 人 院 首 次 检 查 用 血 细 胞 计 数 仪 做 全 ２
显 微 镜 计 数 结 果 为 ８ × ｌ 。 Ｌ， 时将 全 血 标 本 涂 片 显微 镜 下 ７ Ｏ／ 同
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食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验1 范围本标准规定了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的检验方法。
本标准适用于食品和食源性疾病样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB／T 4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验3设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 冰箱：2℃～5℃。
3.2 恒温培养箱：26℃±l℃、36℃±l℃。
3.3 显微镜：l0×～l00×。
3.4 均质器或灭菌乳钵。
3.5 天平：感量0.1g。
3.6 灭菌试管：16 mm×160 mm、15 mm×100 mm。
3.7 灭菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。
3.8 灭菌锥形瓶：200 mL、500 mL。
3.9 灭菌培养皿：直径90 mm。
3.10全自动细菌生化鉴定仪，如VITEK。
4培养基和试剂4.1 改良磷酸盐缓冲液：见第A.1章。
4.2 CIN-1培养基：见第A.2章。
4.3 改良Y培养基：见第A.3章。
4.4 改良克氏双糖培养基：见第A.4章。
4.5 糖发酵管：见第A.5章。
4.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基：见第A.6章。
4.7 半固体琼脂：见第A.7章。
4.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V—P试验用]：见第A.8章。
4.9 碱处理液：见第A.9章。
4.10 尿素培养基：见第A.10章。
4.11 API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK GNI+生化鉴定卡。
5 检验程序小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。
图1 小肠结肠炎耶尔森氏茵检验程序6 操作步骤6.1 增菌以无菌操作称取25g(或25 mL)样品放入含有225 mL改良磷酸盐缓冲液的无菌均质杯或均质袋中，以8 000 r／min均质l min或拍击式均质器均质1 min。
液体样品或粉末状样品，应振荡混匀。
于26℃±l℃增菌48 h～72 h。
6.2 碱处理除乳及其制品外，其他食品的增菌液0.5 mL与碱处理液4.5 mL充分混合l5s。
6.3 分离将乳及其制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种CIN-1琼脂平板和改良Y 琼脂平板，于26℃±l℃培养48 h±2 h，典型菌落在CIN-1琼脂平板上为红色牛眼状菌落，在改良Y琼脂平板上为无色透明、不粘稠的菌落。
6.4 改良克氏双糖试验分别挑取上述可疑菌落3个～5个，接种改良克氏双糖斜面，于26℃±l℃培养24 h，将斜面和底部皆变黄不产气者做进一步的生化鉴定。
6.5 尿素酶试验和动力观察将改良克氏双糖上的可疑培养物接种到尿素培养基上，注意接种量要大，挑取一接种环，振摇几秒钟，于26℃土l℃培养2 h～4 h，然后将阳性者接种两管半固体，分别于26℃±l℃和36℃±l℃恒温培养箱中培养24 h。
将26℃有动力的可疑菌落接种营养琼脂平板，进行革兰氏染色和生化试验。
6.6 革兰氏染色镜检小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌，有时呈椭圆或杆状，大小为(0.8µm～3.0 µm)×0.8µm。
6.7 生化鉴定6.7.1 常规生化鉴定：从营养琼脂平板上挑取单个菌落做生化试验，所有的生化反应皆在26℃±l℃培养。
小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生化特性以及与其他菌的区别见表1。
表1 小肠结肠炎耶尔森氏茵与其他相似茵的生化性状鉴别表6.7.2生化鉴定系统可选择使用两种生化鉴定系统(APl 20E或VITEK GNI+)中任一种，代替常规的生化鉴定。
6.7.2.1 API 20E：从营养琼脂平板上挑取单个菌落，按照API 20E操作手册进行并判读结果。
6.7.2.2 VITEK全自动细菌生化分析仪：从营养琼脂平板上挑取单个菌落，按照VITEK GNI+操作手册进行并判定结果。
6.8血清型鉴定除进行生化鉴定外，可选择做血清型鉴定。
具体操作方法按GB／T 4789.4中沙门氏菌0因子血清分型。
7 结果报告综合以上生化特性报告结果，报告25g(或25 mL)样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。
附录 A(规范性附录)培养基和试剂A.1 改良磷酸盐缓冲液A.1.1 成分磷酸氢二钠8.23g磷酸二氢钠 1.2g氯化钠 5.0g三号胆盐 1.5g山梨醇20gA.1.2 制法将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中，再加入三号胆盐及山梨醇，溶解后校正pH为7.6，分装试管，于121℃高压灭菌15 min，备用。
A.2 CIN-1培养基A.2.1 基础培养基：胰胨20.0g酵母浸膏 2.0g甘露醇20.0g氯化钠 1.0g去氧胆酸钠 2.0g硫酸镁0.01g琼脂l2.0g蒸馏水950 mLpH7.5±0.1将基础培养基于121℃高压灭菌15 min，备用。
A.2.2 Irgasan：以95％的乙醇作溶剂，溶解二苯醚，配成0.4％的溶液，待基础培养基冷至80℃时，加入1 mL混匀。
A.2.3 冷至50℃时，加入：中性红(3 mg／mL) 10.0 mL结晶紫(0.1 mg／mL) 10.0 mL头孢菌素(1.5 mg／mL) 10.0 mL新生霉素(0.25 mg／mL) 10.0 mL最后不断搅拌加入l0.0 mL的10％氯化锶，倾注平皿。
A.3 改良Y培养基A.3.1 成分蛋白胨15.0g氯化钠 5.0g乳糖l0.0g草酸钠 2.0g去氧胆酸钠 6.0g三号胆盐 5.0g丙酮酸钠 2.0g孟加拉红40 mg水解酪蛋白 5.0g琼脂17g蒸馏水 1 000 ml.A.3.2制法将上述成分混合，校正pH7.4±0.1。
于121℃高压灭菌15min，待冷至45℃左右时，倾注平皿。
A.4 改良克氏双糖培养基A.4.1 成分蛋白胨20g牛肉膏3g酵母膏3g山梨醇20g葡萄糖1g氯化钠5g柠檬酸铁铵0.5g硫代硫酸钠0.5g琼脂12g酚红0.025g蒸馏水 1 000 mlpH7.4A.4.2 制法将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。
加入0.o2％的酚ETJ(溶液l2.5 mL，摇匀，分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层。
l21℃高压灭菌15 rain，放置高层斜面备用。
A.5糖发酵管A.5.1 成分牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠3g磷酸氢二钠2g0.2％溴麝香草酚蓝溶液12 mL蒸馏水 1 000 mLpH7.4A.5.2制法A.5.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5％加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15 min。
A.5.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶l00 mL，121℃高压灭菌15 min。
另将各种糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌。
将5 mL糖溶液加入100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
A.5.3试验方法从琼脂斜面上挑取少量培养物接种于26℃±l℃培养，一般观察2 d～3 d。
迟缓反应需观察14 d～30 d。
A.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基A.6.1 成分蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g蒸馏水 1 000 mL1.6％溴甲酚紫-乙醇溶液1 mLL-鸟氨酸或DL-鸟氨酸0.5g／100 mL或1g／100 mLpH6.8A.6.2 制法除鸟氨酸以外的成分加热溶解后，分装，每瓶l00 mL，分别加入鸟氨酸。
L-鸟氨酸按0.5％加入，DL-鸟氨酸按1％加人。
再校正pH至6.8。
对照培养基不加鸟氨酸。
分装于无菌的小试管内，每管0.5 mL，上面滴加一层液体石蜡，ll5℃高压灭菌10 min。
A.6.3试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于26℃±l℃培养18 h～24 h，观察结果。
鸟氨酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基呈紫色。
阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。
对照管为黄色。
A.7半固体琼脂A.7.1 成分蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化钠0.5g琼脂0.35g～0.4g蒸馏水100mLpH7.4A.7.2 制法按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH。
分装小试管，121℃高压灭菌15 min，直立凝固备用。
注：供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。
A.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和V—P试验用)A.8.1 成分磷酸氢二钾5g多胨7g葡萄糖5g蒸馏水 1 000 mLpH7.0A.8.2 制法溶化后校正pH，分装试管，每管1mL，121℃高压灭菌15 min。
A.8.3 甲基红(MR)试验自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于26℃±l℃培养2 d～5 d，哈夫尼亚菌则应在22℃～25℃培养。
滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。
鲜红色为阳性，黄色为阴性。
甲基红试剂配法：l0 mg甲基红溶于30 mL 95％乙醇中，然后加入20 mL蒸馏水。
A.8.4 V-P试验用琼脂培养物接种本培养基中，于26℃±l℃培养2 d～4 d。
哈夫尼亚菌则应在22℃～25℃培养。
加入6％α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL和40％氢氧化钾溶液0.2 mL，充分振摇试管，观察结果。
阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36℃土l℃培养4 h再进行观察。
A.9碱处理液A.9.1 0.5％氯化钠溶液氯化钠0.5g蒸馏水100 mLA.9.2 0.5％氢氧化钾溶液氢氧化钾0.5g蒸馏水100 mLA.9.3制法将0.5％氯化钠及0.5％氢氧化钾等量混合。
A.10尿素培养基A.10.1 成分尿素20.0g酵母浸膏0.1g磷酸二氢钾0.091g磷酸氢二钠0.095g酚红0.Olg蒸馏水1000 ml.A.10.2制法将上述成分于蒸馏水中溶解，校正pH为6.8±0.2。
不要加热，过滤除菌，无菌分装于灭菌小试管中，每管为约3 mL。
A.10.3试验方法挑取琼脂培养物接种在尿素培养基，26℃±l℃培养24 h。
尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。