黄颡鱼小肠结肠炎耶尔森氏菌16SrDNA及系统发育分析
黄颡鱼免疫球蛋白 M基因的克隆与组织表达分析
第28卷第6期大连海洋大学学报Vol.28No.6 2013年12月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Dec.2013文章编号:2095-1388(2013)06-0515-07黄颡鱼免疫球蛋白M基因的克隆与组织表达分析叶仕根,费阳春,李强,李华(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023)摘要:根据GenBank中登录的免疫球蛋白M(IgM)基因编码氨基酸的保守序列以及鱼类密码子的偏好性设计简并引物,提取黄颡鱼Peltebagrus fulvidraco脾脏总RNA,经RT-PCR扩增首次获得了黄颡鱼IgM的部分序列(675bp)㊂以β-actin为内参基因,通过Real-time PCR法分析了黄颡鱼IgM基因的组织分布特点㊂结果表明,在黄颡鱼肝胰脏㊁脾脏㊁头肾㊁中肾㊁鳃㊁肌肉㊁皮肤和肠道中均检测到IgM基因的表达,头肾和脾脏是IgM表达的主要部位,肾脏㊁鳃㊁皮肤㊁肠道和肝胰脏等组织中表达量居中,肌肉中表达量最低㊂经鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluri胞外产物免疫后,头肾㊁脾脏和肝胰脏中IgM基因表达呈现不同的变化规律㊂关键词:黄颡鱼;IgM;克隆;组织分布中图分类号:Q786 文献标志码:A 免疫球蛋白(Immunoglobulins,Ig)是有颌类脊椎动物所特有的介导体液免疫的重要效应分子,在脊椎动物特异性免疫系统中起着关键作用㊂Ig 分子包括重链和轻链两部分,根据重链恒定区化学结构的差异,可将Ig划分为多种类型㊂不同动物所拥有的Ig种类不同,目前已报道的硬骨鱼类Ig 有IgM㊁IgD㊁IgZ/T和IgM-IgZ嵌合体等几种类型[1-5]㊂有报道指出,病原菌感染可明显提高鳜鱼IgM的表达水平,而IgD和IgZ无明显变化[6],内毒素刺激则可增加鲤IgM-IgZ嵌合体基因的转录[5],这说明不同类型的Ig有不同的免疫应答机制㊂在这些Ig分子中,IgM存在于所有有颌类脊椎动物中,其重链代表了从软骨鱼类到哺乳类的一个连续进化的过程[7]㊂同时,IgM也是鱼类最先表达的抗体,在体液免疫尤其是抵抗细菌性抗原侵扰方面起着重要作用[8-9]㊂目前,已有多种鱼类IgM 重链基因被克隆鉴定,诸如模式鱼类斑马鱼Danio rerio[10]和一些重要的经济鱼类[11-17]㊂这些研究结果显示,不同鱼类的IgM重链之间存在基因数目差异和序列特异性,同时不同鱼类IgM基因的组织分布也存在差异㊂黄颡鱼Peltebagrus fulvidraco是重要的经济鱼类之一,然而对其IgM基因的研究至今尚未见报道㊂本研究中,作者根据GenBank数据库中登录的黄颡鱼近缘物种的IgM重链序列信息,通过设计简并引物克隆IgM重链基因的部分片段,同时采用Re⁃al-time PCR方法研究黄颡鱼IgM重链基因在各组织中的表达情况以及经胞外产物(OMPs)免疫刺激后的变化规律,以期为黄颡鱼的抗感染机制和免疫防治技术研究提供理论依据,对了解鱼类免疫应答的分子机制以及免疫系统的起源与进化等具有重要意义㊂1 材料与方法1.1 材料试验用黄颡鱼体质量为35~50g,购自辽宁营口某黄颡鱼养殖场,驯养一周后用于试验㊂Trizol总RNA提取试剂盒㊁M-MLV反转录酶㊁荧光定量PCR试剂盒SYBR®Green SuperMix-UDG 试剂盒等购自上海Invitrogen公司;pMD18-T载体㊁Taq DNA聚合酶㊁DNA Marker均购自宝生物(大连)工程有限公司;引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成㊂1.2 方法1.2.1 IgM重链基因核心序列的扩增 黄颡鱼暂 收稿日期:2013-03-13 基金项目:国家 十二五”科技支撑计划项目(2011BAD13B03) 作者简介:叶仕根(1976-),男,副教授㊂E-mail:yedlsy@ 通信作者:李华(1958-),女,教授㊂E-mail:lihua@养一周后,随机挑选2尾,取其脾脏,按照试剂盒说明书方法提取黄颡鱼脾脏总RNA㊂选用经电泳和紫外分析检测条带清晰㊁完整性好的RNA用于后续的反转录和PCR扩增㊂取4μL(约2μg)总RNA悬液,使用M-MLV反转录酶和oligo(dT) 18于37℃下进行反转录,所得cDNA于-20℃下保存备用㊂根据NCBI中已登录的鱼类免疫球蛋白重链恒定(CH)区氨基酸保守序列设计简并引物[13],正向引物F′为5′CCNACNCARACNGAY⁃ATHGAY3′,反向引物R′为5′NYTNACNTGYTAY⁃GTNAARGA3′,其中N为G㊁A㊁T或C;Y为T 或C;R为G或A,W为A或T㊂在此基础上,参照鱼类密码子偏好性[18]对引物做进一步修改,去掉一些鱼类较少使用的密码子,针对性地降低引物的简并度㊂修改后的正向引物IgM-F为5′CCAAC⁃CCAAACAGAMATAGAC3′,反向引物IgM-R为5′TCTTTWACATAGCAAGTCAGG3′,引物简并度由1 536㊁4096下降至2㊂以cDNA第一链为模板进行PCR扩增,将所得目的条带回收纯化并与PMD-18T载体连接,转化至DH5α中,经菌落PCR和酶切鉴定后,送北京六合华大基因科技股份有限公司测序㊂1.2.2 序列分析 参照李颖等[19]的方法,将测序得到的序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm. /blast)进行相似性搜索和比对,并提交GenBank㊂采用Expasy网站的Prosite在线工具(ht⁃tp:///prosite.html)进行编码蛋白质的保守结构域分析,用Clustal X1.8和DNA6.0程序进行氨基酸序列同源性分析和作图㊂1.2.3 IgM重链基因组织表达量的检测 随机选取3尾黄颡鱼,分别取肝胰脏㊁脾脏㊁头肾㊁肾脏㊁鳃㊁肌肉㊁皮肤和肠等8个组织,液氮速冻后按上述方法提取各组织总RNA并反转录得到cDNA㊂根据 1.2.1”和 1.2.2”节中获得的IgM重链基因序列设计实时定量PCR引物,正向引物IgM-F1为5′AGAGCCAGAAGTGAGCATTA 3′,反向引物IgM-R1为5′CTTGGCAGGTGTATGT⁃GG3′㊂根据黄颡鱼β-actin基因的序列(GenBank 登录号:EU161066.1)设计实时定量PCR内参引物,正向引物ACTIN-F为5′GATCCGGTATGTG⁃CAAGGCT3′,反向引物ACTIN-R为5′TGC⁃CAGATCTTCTCCATATCA3′(表1)㊂引物合成后,以cDNA第一链为模板进行PCR扩增,经E.B染色,用15g/L琼脂糖电泳检验其特异性㊂表1 基因克隆与组织表达分析所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in the gene cloning and tissue expression引物primer 序列sequence产物长度length/bp 用途application IgM-F5′CCAACCCAAACAGAMATAGAC3′675IgM基因克隆的上游简并引物IgM-R5′TCTTTWACATAGCAAGTCAGG3′675IgM基因克隆的下游简并引物IgM-F15′AGAGCCAGAAGTGAGCATTA3′216IgM Real-time PCR上游引物IgM-R15′CTTGGCAGGTGTATGTGG3′216IgM Real-time PCR下游游引物ACTIN-F5′GATCCGGTATGTGCAAGGCT3′203ACTIN Real-time PCR上游引物ACTIN-R5′TGCCAGATCTTCTCCATATCA3′203ACTIN Real-time PCR下游引物 荧光定量PCR参照刘俊等[20]的方法,并作适当修改㊂采用2 △△CT法计算基因在各组织中的表达量: △△CT=(CT IgM x-CT actin x)-(CT IgM0-CT actin0),其中:CT为样品管中荧光强度达到特定阈值时的扩增循环数;x表示8个待测组织中的任一组织; 0表示8个待测组织中相对表达量最低的组织㊂用SYBR Green qPCR试剂盒,在Step one定量PCR仪上进行实时定量扩增㊂首先将反转录获得的cDNA 模板以及引物浓度进行优化,将CT值调整为20左右㊂扩增反应程序为:95℃下预变性2min;95℃下变性30s,62℃下退火30s,共进行40个循环㊂每个样品均进行IgM和β-actin表达量的测定㊂每个样本同时设立3个平行管,每次反应均设置熔解曲线分析,以验证扩增反应的特异性㊂反应完成后,系统软件将自动给出每个样本扩增的IgM和β-actin基因的CT值,在此基础上进一步进行基因表达差异的分析㊂1.2.4 鮰爱德华菌OMPs免疫对IgM基因表达的影响 取大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室分离保存的黄颡鱼病原菌鮰爱德华菌A86,经扩大培养后,参照李强等[21]的方法提取OMPs㊂调整OMPs浓度为1mg/mL,与弗氏完全佐剂等体积混合后腹腔注射免疫黄颡鱼30尾(100μL/尾)㊂分别于免疫接种后第4㊁8㊁14㊁21和28天随机选取3尾鱼,取其肝胰脏㊁脾脏和头肾组织,液氮速冻后按照上述方法提取各组织总RNA 并反转录得到cDNA㊂另随机选取3尾未免疫鱼,取其肝脏㊁脾脏和头肾组织作为免疫前对照㊂采用IgM-F1/R1进行IgM基因表达的实时定量扩增,615大连海洋大学学报 第28卷ACTIN-F /R 用作内参基因扩增引物,试验方法和数据计算同 1.2.3”节㊂2 结果2.1 脾脏RNA 质量和定量PCR 引物特异性验证黄颡鱼脾脏总RNA 经甲醛变性凝胶电泳分析,可见28S RNA 和18S RNA 两条清晰条带,亮度在2∶1左右,用核酸紫外分析仪检测样品的OD 260nm /OD 280nm 值为1.8~2.0,表明RNA 质量较好,无蛋白质㊁酚等污染(图1)㊂对黄颡鱼IgM 基因表达分析引物IgM-F1/R1和内参基因β-actin 引物ACTIN-F /R 扩增产物的熔解曲线分析表明,均呈现单一峰值(84.38㊁84.97℃),说明PCR 产物单一,无非特异性扩增,引物特异性强(图2)㊂图1 黄颡鱼脾脏总RNA 琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the total RNA inspleen of the yellow catfish2.2 黄颡鱼IgM 重链基因恒定区的基因克隆以脾脏总RNA 反转录得到的cDNA 为模板,以IgM-F /R 为引物进行PCR 扩增,扩增产物经凝胶电泳检测得到一条约为700bp 且与预期扩增片段大小相符的条带(图3)㊂条带经切胶回收后连接pMD-18T 载体,再经PCR 扩增和酶切鉴定初步确认后送交测序,最终获得一段675bp 的序列并提交GenBank (GenBank 登录号:JQ067604.1)㊂2.3 黄颡鱼IgM 重链基因恒定区的序列分析分析发现,黄颡鱼IgM 重链基因恒定区序列共编码225个氨基酸残基(GenBank 登录号:AEY79771),包含4个保守的半胱氨酸残基(图4,第15㊁74㊁120㊁172位,加框表示)㊂进一步分析发现,黄颡鱼IgM 重链基因恒定区第15㊁74㊁120㊁172位半胱氨酸残基的分布符合IgC (免疫球蛋白恒定区)结构域的特征(C-X(n)-C,X 为任意氨基酸残基),可分别形成两个二硫键,组成两个包含89个氨基酸残基的IgC 结构域(图4,第1~89位和第98~176位氨基酸残基,下划线表示)㊂经Blast 搜索和序列比对分析显示,其编码氨基酸与瓦式黄颡鱼㊁大鳍鳠㊁斑点叉尾鮰㊁草鱼和斑马鱼等鱼类IgM 重链基因编码氨基酸序列的相似度为56%~88%(表2,图5),与鱼类IgM 基因具有较高同源性㊂表2 黄颡鱼IgM 部分序列与其他鱼类IgM 氨基酸序列的一致性和相似度比较Tab.2 Similarity and identity of deduced amino acid se⁃quence of IgM in yellow catfish Peltebagrus ful⁃vidraco ,with other fishes 物种 species一致性/%identity相似度/%similarity黄颡鱼Peltebagrus fulvidraco --瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachellii 7588大鳍鳠Hemibagrus macropterus 6275斑点叉尾鮰Ictalurus punectatus 4867草鱼Ctenopharyngodon idella 3956斑马鱼Danio rerio37562.4 黄颡鱼IgM 基因的组织表达以β-actin 为内参基因,黄颡鱼肝胰脏㊁脾脏㊁头肾㊁肾脏㊁鳃㊁肌肉㊁皮肤和肠道等8个组织中IgM 基因表达情况如图6所示㊂从图6可见,IgM基因在黄颡鱼各检测组织中均有表达,但各组织间的表达水平存在较大差异㊂各组织中表达量由高到低依次为头肾㊁脾脏㊁肾脏㊁鳃㊁皮肤㊁肠道㊁肝胰脏和肌肉,头肾和脾脏中IgM 基因的表达量明显高于其他组织,分别为表达量最低的肌肉组织的10.3和10.1倍;肾脏㊁鳃㊁皮肤㊁肠和肝胰脏中IgM 基因的表达量居中,分别为肌肉组织的5.3㊁3.7㊁3.0㊁2.7和2.2倍㊂2.5 OMPs 免疫对黄颡鱼IgM 基因表达的影响由于样品保存不当(从液氮取出时,装有样品的EP 管因温差过大炸裂),免疫前的黄颡鱼肝胰脏㊁脾脏和头肾组织样品未能用于IgM 基因表达的定量检测㊂因此,各组织IgM 基因表达变化情况均采用免疫后(第4天)首次取样为初始表达水平,并以此为基准进行比较㊂以β-actin 为内参基因,经OMPs 免疫后,黄颡鱼肝胰脏㊁脾脏和头肾组织(使用专用冻存管保存于液氮中)IgM 基因的表达情况如图7所示㊂从图7可见:黄颡鱼肝胰脏㊁脾脏和头肾中IgM 基因的表达呈现出不同的变化规律,与脾脏和头肾相比,肝胰脏中IgM 基因表715第6期 叶仕根,等:黄颡鱼免疫球蛋白M 基因的克隆与组织表达分析达在整个取样过程中变化不太明显,最高表达(免疫后第21天)和最低表达(第14天)分别为初始水平的1.06㊁0.81倍;3个组织中,头肾和脾脏中IgM 基因表达变化规律较为相似,均为短暂图2 Real-time PCR 扩增产物的熔解曲线分析Fig.2 Melting curves of the PCR products of IgM-F1/R1and ACTIN-F /R注:M 为DL 2000DNA Marker;1~8分别为8对不同简并引物扩增的PCR 产物,其中第6道(引物为IgM-F /R)有特异性扩增产物Note:M,DL 2000DNA Marker;Lane 1-8,PCR products by dif⁃ferent degenerate primers,nes 6,PCR of IgM se⁃quence in yellow catfish products by degenerate primers IgM-F /R图3 用简并引物扩增黄颡鱼IgM 序列的PCR 产物电泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products ofIgM sequence by degenerate primers in yellowcatfish图4 黄颡鱼IgM 部分序列编码氨基酸的分析Fig.4 Deduced amino acid sequences by IgM from yellow catfish Peltebagrusfulvidraco图5 黄颡鱼IgM 部分序列与其他鱼类IgM 重链氨基酸序列的比较分析Fig.5 Comparison of multiple amino acid sequences of IgM in yellow catfish Peltebagrus fulvidraco ,with other fishes815大连海洋大学学报 第28卷注:1)Hp 肝胰脏;Sp 脾脏;Hk 头肾;Ki 肾脏;Gi 鳃;Sk 皮肤;In 肠;Mu 肌肉㊂2)使用β-actin 为内参,数据分析采用2 △△CT 法处理,图中相对表达倍数指各组织以最低表达量组织为基准的表达倍数,下同Note:1)Hp,hepatopancreas;Sp,spleen;Hk,head kidney;Ki,kidney;Gi,gill;Sk,skin;In,intestine;Mu,muscle.2)Expression levels were assessed using the β-actin as endogenous con⁃trol,and measured on the basis of the minimum in tissues by2△△CTmethod,et sequentia图6 Real-time PCR 检测黄颡鱼IgM 基因的组织分布Fig.6 Expression levels of IgM gene in various tissuesdetected by Real-timePCR图7 OMPs 免疫对黄颡鱼各组织IgM 表达的影响Fig.7 Expression levels of IgM gene in various tissuesof yellow catfish challenged by OMPs detected by Real-time PCR下降(第8天)后再升高,最高表达分别出现在第14天和21天;脾脏IgM 基因表达的最高值和最低值分别为初始水平的2.90和0.71倍,头肾IgM 基因表达的最高值和最低值分别为初始水平的2.21和0.82倍;脾脏和头肾组织中IgM 基因表达自免疫后第14天到第28天试验结束时均维持了较高的表达水平,分别为初始表达水平的1.84~2.90和1.92~2.21倍㊂3 讨论本研究中,通过RT -PCR 方法首次成功克隆了黄颡鱼IgM 重链基因恒定区部分cDNA 序列㊂该序列编码氨基酸中包含4个保守的半胱氨酸残基,可分别形成两个二硫键,组成两个IgC (Ig 恒定区)结构域㊂同源性分析发现,其编码氨基酸与瓦式黄颡鱼㊁大鳍鳠㊁斑点叉尾鮰㊁草鱼和斑马鱼等鱼类的IgM 重链基因编码氨基酸序列的相似度为56%~88%,具有较高的同源性㊂在获得黄颡鱼IgM 重链基因部分序列的基础上,采用Real -time PCR 方法检测了IgM 重链基因在黄颡鱼不同组织中的表达情况以及经OMPs 免疫后其在各组织中表达的变化规律,为黄颡鱼乃至其他鱼类的抗感染机制和疾病防治研究等提供了理论依据㊂在新基因的克隆中,根据近缘物种相关蛋白氨基酸序列的保守区域设计简并引物是常用的方法之一㊂但由于密码子的简并性和摇摆性,常常使得设计出来的引物简并度非常高,不利于PCR 扩增反应的进行㊂张晓峰等[18]研究发现,鱼类密码子与其他生物一样具有明显的偏好性,即编码同一种氨基酸的密码子在翻译成蛋白质时并非均一使用,通常是某些密码子被优先使用,某一物种或某一基因通常会倾向于使用一种或几种特定的同义密码子,即所谓的最优密码子,此现象被称为密码子偏性㊂本研究中,参照鱼类密码子偏好性对引物进行了针对性修改,使两条引物的简并度分别由1536㊁4096下降至2,提高了引物的扩增效率,成功克隆到黄颡鱼IgM 基因重链恒定区的部分cDNA 序列㊂Real-time PCR 分析表明,黄颡鱼头肾和脾脏是IgM 基因mRNA 的主要分布组织,其表达量显著高于其他组织㊂本研究结果与李春涛等[22]对大鳍鳠以及王欣欣等[23]对草鱼IgM 基因mRNA 分布情况的研究结果类似㊂胡瑜兰[24]和彭博[25]研究发现,斑马鱼和鲫的头肾中免疫球蛋白具有较高表达水平㊂头肾和脾脏中较高的IgM 基因mRNA 或免疫球蛋白表达水平与其抗体产生细胞发生的主要器官的功能是相适应的,这从侧面证实了头肾和脾脏是鱼类免疫的主要场所[26-27]㊂值得注意是,作为鱼类造血器官之一,黄颡鱼肾脏中也有较高的IgM 基因mRNA 表达水平,为头肾和脾脏的50%左右㊂但这与欧洲鳗鲡[16]和大鳍鳠[22]肾脏中IgM 基因mRNA 表达水平高于脾脏中的研究结果有一定差异㊂这可能与物种差异㊁动物机体状况㊁环境等因915第6期 叶仕根,等:黄颡鱼免疫球蛋白M 基因的克隆与组织表达分析素有关,如季节变化会影响鱼体内免疫球蛋白的表达水平,夏季高于冬季;运输会影响斑点叉尾鮰对抗原刺激的应答反应[28-29]㊂上述结果表明,头肾㊁脾脏和肾脏是鱼类IgM基因mRNA和免疫球蛋白表达的主要场所㊂此外,本研究中还发现,黄颡鱼肌肉组织中IgM基因mRNA的表达水平是所有被检测组织中最低的,这与对欧洲鳗鲡的研究结果一致㊂肌肉组织中IgM低表达可能与肌肉组织中MHC表达量较低有关[30]㊂因为MHC在免疫应答的启动和免疫调节中发挥重要作用,肌肉组织中较低的MHC表达量使得其自身难以具备产生免疫反应的分子基础[31]㊂由于样本保存的原因,本研究中免疫前样品未能用于IgM基因表达的定量分析㊂研究表明,鳜和大鳍鳠经嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后以及剑尾鱼经溶藻弧菌灭活疫苗免疫后,其IgM基因表达水平在第6~10天后显著升高,但在前期如第3天(剑尾鱼)㊁第4天(鳜)和第5天(大鳍鳠)变化并不十分明显[22,32-33]㊂因此,本研究中免疫后(第4㊁8㊁14㊁21天)样品中的IgM基因表达情况仍能反映出其变化规律㊂经OMPs免疫后,黄颡鱼脾脏和头肾中IgM基因表达变化趋势相似,均为先小幅降低(第8天)后升高,且自第14天起维持在较高表达水平㊂这与嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后,大鳍鳠脾脏和头肾中IgM基因表达持续升高并维持在较高的表达水平的结果一致[22]㊂但与鳜经嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后,头肾和脾脏中转录水平峰值出现在第7天,至第28天时鳜头肾中转录水平下降到免疫前水平而脾脏仍维持在较高表达水平的研究结果有一定差异[33]㊂这可能与物种和取样时间长短有一定关系㊂Zilberg等[34]研究发现,对斑点叉尾鮰注射鮰爱德华菌后,其血细胞㊁脾脏和头肾中IgM基因表达量在13d内均显著增加㊂Raida等[35]研究发现,对虹鳟注射鲁氏耶尔森氏菌Yersinia ruckeri后,其脾脏和头肾中IgM基因表达量在21d内都有增加㊂这些结果表明,鱼类IgM 分子在3周内可以识别细菌抗原[6]㊂尽管在未经免疫刺激的情况下,肝胰脏中IgM基因表达水平较低(仅为头肾或脾脏的1/4左右),作为鱼类重要的代谢器官,肝脏组成细胞参与肝脏免疫调节[36],其仍然可能在免疫防御中发挥重要作用㊂然而,本研究结果表明,经OMPs免疫后黄颡鱼肝胰脏中IgM基因表达量无明显变化㊂作者的另一研究发现,经鮰爱德华菌OMPs免疫可显著提升黄颡鱼肝胰脏中CAT㊁AKP和SOD活性(另文发表)㊂这些结果表明,鱼类特异性免疫防御更多的是与脾脏㊁头肾等组织相关,肝胰脏更多的是通过增加一些免疫酶的活性来发挥免疫防御作用,主要参与机体的非特异性免疫防御,但其详细机制仍有待于进一步探讨㊂综上所述,本研究中成功克隆到了黄颡鱼IgM 基因的部分序列,并检测了其组织分布模式和经OMPs免疫后的变化规律,研究结果将有助于对黄颡鱼IgM结构与功能的理解,为鱼类的免疫防治技术和分子免疫应答机制研究提供了基础资料㊂参考文献:[1] Pilstrom L,Bengten E.Immunoglobulin in fish-genes,expressionand structure[J].Fish&Shellfish Immunol,1996,6:243-262.[2] Saha N R,Suetake H,Kikuchi K,et al.Fugu immunoglobulin D:ahighly unusual gene with unprecedented duplications in its constant region[J].Immunogenetics,2004,56:438-447.[3] Danilova N,Bussmann J,Jekosch K,et al.The immunoglobulinheavy-chain locus in zebrafish:identification and expression of a previously unknown isotype,immunoglobulin Z[J].Nat Immnol, 2005,6(3):295-302.[4] Hansen J D,Landis E D,Phillips R B.Discovery of a unique Igheavy-chain isotype(IgT)in 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13455097_胡子鲶致病性摩氏摩根菌的分离鉴定与致病性研究
中国畜牧兽医 ２０１７，４４（１）：２２１ ２２６犆犺犻狀犪犃狀犻犿犪犾犎狌狊犫犪狀犱狉狔牔犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犕犲犱犻犮犻狀犲ｄｏｉ：１０．１６４３１／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７１ ７２３６．２０１７．０１．０３１胡子鲶致病性摩氏摩根菌的分离鉴定与致病性研究韦阳道１，易 弋１ ，黎 娅１，石征宇１，伍时华１，梁建荣２（１．广西科技大学生物与化学工程学院，柳州５４５００６；２．广西科技大学广西糖资源绿色加工重点实验室，柳州５４５００６；３．广西科技大学广西高校糖资源加工重点实验室，柳州５４５００６；４．柳州市鱼家乐饲料有限公司，柳州５４５００２）摘 要：本研究从患病胡子鲶体内分离得到一株菌，通过菌体形态观察、生理生化试验、１６ＳｒＤＮＡ分析及构建系统发育树对其进行分析，得出该致病菌为摩氏摩根菌。
人工感染试验结果显示，该致病菌对胡子鲶具有较强的致病能力，同时对罗非鱼、泥鳅和禾花鲤也有很强的致病能力。
药敏试验结果显示，ＫＤ０１菌株对青霉素Ｇ、氨苄青霉素和新生霉素等药物有高度的耐药性，对复方新诺明、恩诺沙星和环丙沙星等药物敏感。
本试验结果对胡子鲶出血性肠道坏死疾病研究提供有力的依据，同时可指导养殖户合理用药。
关键词：胡子鲶；摩氏摩根菌；１６ＳｒＤＮＡ；分离鉴定中图分类号：Ｓ９４７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１ ７２３６（２０１７）０１ ０２２１ ０６收稿日期：２０１６ ０６ ０８基金项目：广西科学基金（２０１５ＧＸＮＳＦＢＡ１３９０６８）；广西柳州市中小企业创新基金（２０１４Ｆ０３０６１８）作者简介：韦阳道（１９８９ ），男，安徽阜阳人，硕士生，研究方向：微生物分子生物学，Ｅ ｍａｉｌ：ｗｙａｎｇｄａｏ＠ｏｕｔｌｏｏｋ．ｃｏｍ 通信作者：易 弋（１９７９ ），男，广西柳州人，教授，研究方向：微生物学，Ｅ ｍａｉｌ：ａｉｒｈｆｈ＠１６３．ｃｏｍ犐狊狅犾犪狋犻狅狀，犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犘犪狋犺狅犵犲狀犻犮犻狋狔犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犕狅狉犵犪狀犲犾犾犪犿狅狉犵犪狀犻犻犻狀犆犾犪狉犻犪狊犳狌狊犮狌狊ＷＥＩＹａｎｇ ｄａｏ１，ＹＩＹｉ１ ，ＬＩＹａ１，ＳＨＩＺｈｅｎｇ ｙｕ１，ＷＵＳｈｉ ｈｕａ１，ＬＩＡＮＧＪｉａｎ ｒｏｎｇ２（１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犅犻狅犾狅犵犻犮犪犾犪狀犱犆犺犲犿犻犮犪犾犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵，犌狌犪狀犵狓犻犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犔犻狌狕犺狅狌５４５００６，犆犺犻狀犪；２．犌狌犪狀犵狓犻犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犌狉犲犲狀犘狉狅犮犲狊狊犻狀犵狅犳犛狌犵犪狉犚犲狊狅狌狉犮犲狊，犌狌犪狀犵狓犻犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犔犻狌狕犺狅狌５４５００６，犆犺犻狀犪；３．犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犳狅狉犘狉狅犮犲狊狊犻狀犵狅犳犛狌犵犪狉犚犲狊狅狌狉犮犲狊狅犳犌狌犪狀犵狓犻犎犻犵犺犲狉犈犱狌犮犪狋犻狅狀犐狀狊狋犻狋狌狋犲狊，犌狌犪狀犵狓犻犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犔犻狌狕犺狅狌５４５００６，犆犺犻狀犪；４．犔犻狌狕犺狅狌犆犻狋狔犑犻犪犾犲犉犻狊犺犉犲犲犱犔犻犿犻狋犲犱犆狅犿狆犪狀狔，犔犻狌狕犺狅狌５４５００２，犆犺犻狀犪）犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｗｅｉｓｏｌａｔｅｄａｓｔｒａｉｎｆｒｏｍｄｉｓｅａｓｅｄ犆犾犪狉犻犪狊犳狌狊犮狌狊．Ｔｈｒｏｕｇｈｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｓｔｓ，１６ＳｒＤＮＡａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈ ｏｄ，ｉｔｗａｓｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｗａｓ犕狅狉犵犪狀犲犾犾犪犿狅狉犵犪狀犻犻．Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｈａｄｓｔｒｏｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｔｏ犆犾犪狉犻犪狊犳狌狊犮狌狊，ａｎｄａｌｓｏｈａｄｓｔｒｏｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｔｏｔｏｔｉｌａｐｉａ，ｌｏａｃｈａｎｄｃａｒｐ．ＴｈｅｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＫＤ０１ｓｔｒａｉｎｓｈａｄｈｉｇｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏ６ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧ，ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ，ａｎｄｓｏｏｎ．Ａｎｄｉｔｈａｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｔｈｅ１５ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｈｅｍｉｔｒｉｍ，ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎａｎｄｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ａｎｄｓｏｏｎ．Ｔｈｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｎｅｃｒｏｓｉｓｄｉｓｅａｓｅｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｄａｓｔｒｏｎｇｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆ犆犾犪狉犻犪狊犳狌狊犮狌狊，ａｌｓｏｃｏｕｌｄｇｕｉｄｅｆａｒｍｅｒｓｔｏｔｈｅｒａｔｉｏｎａｌｕｓｅｏｆｄｒｕｇｓ．犓犲狔狑狅狉犱狊：犆犾犪狉犻犪狊犳狌狊犮狌狊；犕狅狉犵犪狀犲犾犾犪犿狅狉犵犪狀犻犻；１６ＳｒＤＮＡ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ 胡子鲶别名革胡子鲶、塘角鱼、过山鳅等，属于辐鳍鱼纲、鲇形目、胡子鲶科。
黄颡鱼“红头病”一种新的细菌性传染病
理变化，因此，可初步确定该病是由这一革兰 氏阴性短 杆菌引起 的。
三、临床症状 、病理变化及诊断 该病在临床上可分为两种类型：急性败血症型及慢
目前国内外报道的对黄颡鱼造成危害的疾病主要有 肠 炎病 、出血性水肿病、水霉病、鳃 霉病 以及一些原 虫、线虫等引起的寄生虫病等。在辽宁、四川等地发生 的“ 红头病 ”与这些常见疾病在流行规律 、症状及病理 变化等方面都不完全一致，特别是病鱼头顶部充血、出
性“ 红头病 ”型。急性型发病急，死亡率高，多在水温 迅速升高、水质恶化的条件下发生 。从开始出现症状到 大量鱼发病死亡只需３ 天。发病初期病鱼离群独游、 ～５
反应迟钝，食欲减退或废绝 。病鱼出现头朝上尾朝下， 悬垂于水中的特殊姿势 ，有时呈螺旋状游动，最后沉入 水底死亡 。病鱼腹部膨大，鳍条基部、下颌 、鳃盖、腹 部可见到细小的充血、出血斑，肛门及生殖孔充血、出 血 、外突。剖开腹腔 ，内有大量含血的或清亮的液体 ， 腹水不易凝固，肝肿大，颜色变淡 ，上有出血点或出血 斑，肾脏充血 、肿大，脾脏肿大呈紫黑色。肠道扩张， 充血、发炎，肠腔 内充满气体和淡黄色水样液体。部分
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近年来，人工养殖的黄颡鱼发生了一种新的疾病，
与 目前已报道 的黄颡鱼疾病在流行规律 、症状和病理变 化等方面都不完全一致。此病传染性强，死亡率高，防 治困难。随着养殖规模的扩大，其造成的损失也日益增 大 ，据不完全统计 ，其直接经济损失 已达 １ ０ ０ 万元左 右。本文就该病的病原、流行规律、症状与病理变化、 诊断及防治措施等作一初报。
由于该病在急性发生时发病突然 、死亡率很高，而 在慢性时初期往往无明显临床表现，到后期时已无治疗 价值 。因此对该病应注重预防，在发病季节投喂抗菌药
金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治
D O I :10.3969/j.i s s n .1003-0972.2024.02.015 文章编号:1003-0972(2024)02-0228-06金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治姜芳燕1,2,谢浪萍2,杨 宁2,黄 海2*(1.琼台师范学院热带生物多样性与资源利用实验室,海南海口571127;2.海南热带海洋学院热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室,海南三亚572022)摘 要:从具有肠道糜烂㊁肛门突出体外病症的金鲳鱼(T r a c h i n o t u s o v a t u s )体内筛选致病菌株,分离纯化获得菌株05A ㊂通过活菌注射金鲳鱼腹腔回归感染试验,确定菌株05A 为致病菌株㊂经单菌落形态特征㊁生理生化指标以及16S r R N A 分子鉴定,确定其为哈维氏弧菌(V i b r o h a r v e yi )㊂中草药的体外抑菌实验表明,大蒜㊁儿茶㊁五倍子和石榴皮等4种中草药对病原菌05A 有较好的抑菌效果,其次是仙鹤草㊁黄连㊁黄芩㊁甘草㊁大黄㊁五味子和诃子㊂关键词:金鲳鱼;肠炎;哈维氏弧菌;分离鉴定;中草药防治中图分类号:S 965.3 文献标识码:A开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o n a n d C h i n e s e H e r b a l M e d i c i n e C o n t r o l o fE n t e r i t i s P a t h o ge n i c B a c t e r i af r o m T r a c h i n o t u s O v a t u s J I A N G F a ng y a n 1,2,X I E L a n g p i n g 2,Y A N G N i n g 2,H U A N G H a i 2*(1.T r o p i c a l B i o d i v e r s i t y a n d B i o r e s o u r c e U t i l i z a t i o n L a b o r a t o r y ,Q i o n g t a i N o r m a l U n i v e r s i t y,H a i k o u 571127,C h i n a ;2.K e y L a b o r a t o r y o f U t i l i z a t i o n a n d C o n s e r v a t i o n f o r T r o p i c a l M a r i n e B i o r e s o u r c e s o f M i n i s t r y of E d u c a t i o n ,H a i n a n T r o p i c a l O c e a n U n i v e r s i t y ,S a n ya 572022,C h i n a )Ab s t r ac t :S t r a i n 05A w a s i s o l a t ed f r o m T r a c h i n o t u s o v a t u s s pe c i m e n s w i t h i n t e s t i n a l e r o s i o n a n d a n a l o u t b r e a k .C h a l l e n g e e x p e r i m e n t s u s i n g s t r a i n 05A o n h e a l t h y T .o v a t u s a n d b a c t e r i a l r e -i s o l a t i o nf r o m c h a l l e n ge d d i s e a s e d g o l d e n p o m p a n o s h o w e d t h a t t h e b a c t e r i a s t r a i n n a m e d 05A i n d u c e d i d e n t i c a l p a t h o l o g i c a l s y m pt o m s ,i n d i c a t i n g t h a t i t i s t h e c a u s a t i v e p a t h o g e n o f t h e d i s e a s e .A c c o r d i n g t o t h e m o r p h o l o gi c a l c h a r a c t e r i s t i c s ,p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s ,a n d 16S r R N A s e qu e n c e s ,t h e i s o l a t e 05A w a s i d e n t i f i e d a s V i b r o h a r v e yi .B a c t e r i o s t a t i c t e s t o f C h i n e s e h e r b a l m e d i c i n e r e v e a l e d t h a t g a r l i c ,c a t e c h u ,g a l l n u t a n d p o m e g r a n a t e p e e l h a d g o o d b a c t e r i o s t a t i c e f f e c t o n t h e s t r a i n 05A ,f o l l o w e d b y A g r i m o n i a p i l o s a ,C o pt i s c h i n e n s i s ,S c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i s ,G l y c yr r h i z a u r a l e n s i s ,R h e u m p a l m a t u m ,S c h i s a n d r a c h i n e n s i s ,a n d T e r m i n a l i a c h e b u l a .K e y wo r d s :T r a c h i n o t u s o v a t u s ;E n t e r i t i s ;V i b r o h a r v e y i ;i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n ;C h i n e s e h e r b a l m e d i c i n e c o n t r o l0 引言金鲳鱼学名卵形鲳鲹(T r a c h i n o t u s o v a t u s ),属暖水性鱼类,在中国㊁美洲热带㊁东南亚㊁澳大利亚㊁日本和温带大西洋海岸均有分布[1-2]㊂金鲳鱼的体表光滑,鳞细小㊁形体颜色鲜艳美丽㊁鱼肉多刺收稿日期:2023-06-20;修回日期:2023-12-11;*.通信联系人,E -m a i l :j j i a n g f y2005@126.c o m ;H u a n h a i 74@126.c o m 基金项目:国家自然科学基金项目(32160861);琼台师范学院高层次人才科研启动项目(30030007040);2021年度海南热带海洋学院科研启动资助项目(R H D R C 202101);广东省海洋经济发展(海洋六大产业)专项资金项目(粤自然资合[2022]23号)作者简介:姜芳燕(1984 ),女,浙江衢州人,副教授,博士,主要从事水产病害防治的研究;黄海(1974 ),男,海南三亚人,研究员,博士,主要从事水产养殖的研究㊂引用格式:姜芳燕,谢浪萍,杨宁,等.金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治[J ].信阳师范学院学报(自然科学版),2024,37(2):228-233.J I A N G F a n g y a n ,X I E L a n g p i n g ,Y A N G N i n g,e t a l .I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o n a n d C h i n e s e h e r b a l m e d i c i n e C o n t r o l o f E n t e r i t i s P a t h o g e n i c B a c t e r i a f r o m T r a c h i n o t u s o v a t u s [J ].J o u r n a l o f X i n y a n g N o r m a l U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ),2024,37(2):228-233.822信阳师范学院学报(自然科学版)J o u r n a l o f X i n y a n g N o r m a l U n i v e r s i t y第37卷 第2期 2024年4月N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n V o l .37N o .2A pr .2024少,鱼肉中含有不饱和脂肪酸和硒㊁镁等微量元素,鱼肉质细嫩㊁味道鲜甜,带有鲳鲹鱼类特殊的香味,是高档食用海洋养殖鱼类,深受人们喜爱,是海南㊁广东沿海城市主要高档海水养殖品种之一[3]㊂细菌性疾病是金鲳鱼养殖中主要的病害之一,一旦防控不当,常常导致金鲳鱼大规模死亡,造成严重的经济损失,成为制约金鲳鱼养殖产业发展的主要障碍之一[4]㊂哈维氏弧菌是海洋生物常见的细菌性病原菌,可导致三疣梭子蟹蟹足腐烂[5];长牡蛎闭壳缓慢或不闭壳[6];方斑东风螺患 翻背症 ,背腹面颠倒,壳口朝上,腹足发黑[7];抗红鳍东方鲀表皮溃烂,伴随全身性出血,肝脏等组织严重坏死[8];珍珠龙趸鱼体烂身,肾脏和脾脏肿大[9];圆眼燕鱼鳍条末端颜色变浅,头部呈现充血和局部溃烂[10];海水杂交罗非鱼鳃内出血[11];花鲈内脏有明显的出血症状[12]等㊂涂志刚等[13]从深海人工养殖网箱患烂身病的金鲳鱼分离到哈维弧菌Q T520,发现利福平㊁庆大霉素和多西环素等9种抗生素对哈维弧菌Q T520敏感㊂丁泽昊等[14]从海南临高网箱养殖患腹水症的金鲳鱼分离到海豚链球菌(S t r e p t o c o c c u s i n i a e),研究表明其对庆大霉素㊁红霉素和氨苄西林等25种抗生素高度敏感㊂王一帆等[2]从湛江特呈岛深水网箱养殖患链球菌病的金鲳鱼分离到4株链球菌,结果表明,这些菌株对恩诺沙星㊁头孢曲松㊁头孢吡肟等6种抗生素高度敏感㊂以上几种金鲳鱼细菌性疾病发生后,仍以抗生素治疗为主,而抗生素的使用则会影响金鲳鱼自身的抗病能力,并且造成环境污染和病原抗药性的增加㊂在我国,为加强抗菌药物管理,遏制细菌耐药,制定出台了‘遏制细菌耐药国家行动计划(2016 2020年)“[15]㊂自2020年1月1日起,我国饲料中全面禁止添加抗生素,减少滥用抗生素造成的危害,维护动物源食品安全和公共卫生安全[16]㊂基于此,本研究对患肠炎病的金鲳鱼进行病原菌分离纯化㊁分子测序鉴定和中草药体外抑菌实验,为金鲳鱼绿色㊁健康养殖提供理论指导㊂1材料与方法1.1材料及试剂患病的金鲳鱼由海南省三亚市崖州湾某养殖户提供,鱼平均体质量约60g,感染实验采用同体质量㊁健康的金鲳鱼,取自热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室养殖水族箱㊂儿茶㊁五倍子㊁黄连㊁石榴皮和大蒜等18种中草药购于当地的中药药店,其他化学试剂均为国产分析纯㊂1.2实验方法1.2.1金鲳鱼肠炎病病原菌的分离选择患病腹部肿大的金鲳鱼个体,75%乙醇酒精棉严格擦拭消毒㊂超净工作台中,使用剪刀㊁镊子等工具解剖金鲳鱼,接种环酒精灯火焰上烧红冷却后,从糜烂肠道取样,接种于L B固体培养基平板上,置于生化培养箱中,30ħ培养24h㊂在培养基上出现单菌落后,用接种环挑取优势单菌落,反复进行划线分离纯化2次,直至获得纯化后菌株,4ħ短期储存备用,用15%甘油洗菌株保种,-80ħ超低温冰箱冷冻保存备用㊂1.2.2人工感染实验将健康的金鲳鱼在水族箱中暂养1周后,选择健康的金鲳鱼个体用于感染试验,设实验组3组和对照组3组㊂每组用金鲳鱼10尾,将分离到的细菌用0.9%生理盐水稀释成1ˑ108C F U/m L菌悬液,每尾金鲳鱼腹腔注射0.1m L菌悬液,对照组注射同剂量的无菌生理盐水㊂试验期间水族箱正常投饵,充气,每天更换水族箱中一半的水,记录7 d内水族箱中各组金鲳鱼的死亡情况㊂死亡的个体需及时捞出,以免污染水质,观察死亡个体的症状,并对其糜烂肠道进行细菌分离,比较分离获得的细菌是否与初筛病原菌形态特征一致㊂1.2.3病原菌的形态观察和生理生化特征观察观察培养24h后L B固体培养基上的菌落特征,根据革兰氏染色试剂盒的操作步骤对细菌进行染色,100倍油镜下显微观察细菌形态特征㊂对病原菌进行生理生化实验,对照产品说明书,判断生化鉴定管细菌生化反应阴阳性,结合相关文献及查阅‘伯杰细菌鉴定手册“和‘常见细菌系统鉴定手册“等[17-18],对病原菌进行初步鉴定㊂1.2.4病原菌的16S r R N A分子鉴定按照细菌基因组试剂盒的说明书,提取细菌基因组㊂病原菌的16S r R N A分子鉴定参照参考文献[19]方法进行㊂P C R产物送至深圳华大基因有限公司进行测序㊂16S r R N A序列分析及系统发育树构建参照文献[20]方法进行㊂1.2.5中草药药液的制备中草药药液的制备方法参照文献[21]进行,18种中草药原药液质量浓度为100g/L㊂1.2.6中草药抑菌实验所分离菌株的中草药抑菌实验采用常规琼脂922姜芳燕,谢浪萍,杨宁,等.金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治扩散(K -B )法,具体操作和敏感性判定标准参照文献[21]进行㊂以无菌水作为阴性对照,以氯霉素作为阳性对照,共测定18种中草药对病原菌05A 的抑菌效果㊂2 结果与分析2.1 金鲳鱼肠炎病原菌的分离患肠炎病的金鲳鱼,其病症表现为鱼体腹部肿大,身体其他部位无病灶,轻轻按压鱼体腹部,肛门有黄色流体流出(图1a),解剖鱼体发现肠道糜烂,有黄色积液的腹水(图1b )㊂从糜烂的肠道中分离较杂的细菌群落,挑取优势菌落,进行分离纯化培养,获得1株优势菌株,并命名为菌株05A㊂图1 金鲳鱼肠炎病的发病病症F i g .1 T h e c l i n i c a l s y m pt o m s o f T .o v a t u s e n t e r i t i s 2.2 人工感染试验在水族箱中,以纯培养的菌株05A 菌悬液,采用腹腔注射法感染健康金鲳鱼,对照组注射无菌生理盐水㊂3个实验组7d 内死亡率均为100%,死亡金鲳鱼症状表现为腹部肿大,鱼体其他部位无病灶,解剖鱼体发现肠道糜烂,有黄色积液的腹水,感染实验金鲳鱼发病症状与采样获得的患病金鲳鱼相似㊂对照组无发病现象㊂从人工感染发病的金鲳鱼中再次分离纯化获得病原菌,从菌落形态特征上判断与菌株05A 为同种细菌,因此判断菌株05A 是金鲳鱼肠炎病的病原菌㊂2.3 病原菌05A 的鉴定在无菌条件下,取保存备用的菌株05A 于T C B S 培养基上接种活化,30ħ恒温培养24h 后,T C B S 培养基上菌落的颜色为黄色,菌落的直径大小为1.5~2.5mm ,呈圆形,周边较规则不透明,菌苔湿润光滑不发光㊂革兰氏染色显微观察,该菌株为革兰氏阴性菌,钝形,呈短杆状,油镜下观察大小约2.0μmˑ0.8μm ㊂根据其生理生化特征结果,21项指标中15项生理生化特性与标准哈维氏弧菌(V i b r o h a r v e yi )完全一致(表1),初步鉴定菌株05A 为哈维氏弧菌㊂致病菌05A 的16S r R N A 序列扩增产物电泳结果,16S r R N A 目的片段约为1500b p,测序结果显示扩增产物的片段为1350b p,利用M E G A 6.0软件中M a x i m u m L i k e l y h o o d 方法构建05A 菌的系统发育树(图2),以嗜水气单胞菌(A e r o m n a sh y d r o p h i l a )为外类群,构建系统发育树㊂结果表明05A 菌与哈维氏弧菌(V i b r i o h a r v e yi )的同源性为100%,鉴定菌株05A 为哈维弧菌(G e n B a n k :O N 892077)㊂表1 菌株05A 的生理生化特征T a b .1 P h y s i o l o gi c a l a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f s t r a i n 05A项目生理生化特征05A V i b r oh a r v e yi 尿素--葡萄糖--阿拉伯糖--硫化氢--半乳糖-67%蔗糖-83%水杨素--七叶苷+-果糖-N D木糖--棉子糖--项目生理生化特征05A V i b r oh a r v e yi 甘露糖-40%乳糖--甘露醇-+纤维二糖-+肌醇--山梨醇--卫茅醇-N D 麦芽糖++鼠李糖--亚硝酸盐-N D注: + 代表阳性, - 代表阴性,百分数代表阳性所占百分率,N D 表示未检测㊂图2 基于菌株05A 的16S r R N A 序列所构建的系统发育树F i g .2 P h y l o ge n e t i c t r e e c o n s t r u c t e d b a s e d o n t h e 16S r R N A s e qu e n c e o f s t r a i n 05A 金鲳鱼肠炎病由V .h a r v e yi 05A 引起,其致死率较高,给金鲳鱼养殖业造成重大的经济损失㊂更为严峻的是哈维弧菌还表现出了较强的耐药性㊂32第37卷 第2期信阳师范学院学报(自然科学版) h t t p ://j o u r n a l .x yn u .e d u .c n 2024年4月蒋魁等[22]对南海沿岸鱼类养殖水域中采集到90株哈维弧菌进行抗生素耐药分析,结果表明这些菌株具有复杂多样的耐药谱,给哈维弧菌病的防治带来了极大的挑战㊂此外,抗生素的使用也会影响养殖鱼类自身的抗病能力,而且抗生素残留还会污染养殖水域,将严重威胁人类的健康㊂2.4 中草药对病原菌05A 的抑菌效果本研究通过单因素实验,考察儿茶㊁五倍子㊁黄连㊁石榴皮和大蒜等18种中草药对菌株05A 的抑菌效果(表2)㊂结果表明大蒜㊁儿茶㊁五倍子和石榴皮等4种中草药有较好的抑菌效果,对菌株05A 表现为高度敏感,抑菌圈直径为21~33mm ㊂其次是仙鹤草㊁黄连㊁黄芩㊁甘草㊁大黄㊁五味子和诃子,抑菌圈直径为10~20mm ㊂而其余7种中草药则完全没有抑菌效果㊂18种中草药的抑菌效果最好的是大蒜,其对病原菌05A 的抑菌效果略高于氯霉素的效果㊂表2 不同中草药对菌株05A 的抑菌效果T a b .2 A n t i b a c t e r i a l e f f e c t o f d i f f e r e n t C h i n e s e h e r b a lm e d i c i n e o n t h e s t r a i n s 05A中草药抑菌圈直径/mm 敏感性儿茶21+++五倍子22+++黄芪0-马齿苋0-仙鹤草13++黄连14++黄芩14++甘草14++断血流0-C K无菌水0-中草药抑菌圈直径/mm敏感性半边莲0-地锦草0-大黄15++五味子10++诃子14++石榴皮21+++线椒0-大蒜33+++急性子0-C K氯霉素30+++ 注: +++ 代表高度敏感; ++代表中度敏感; + 代表敏感; -代表不敏感㊂中草药富含多种活性物质,既可以抑菌杀菌也能增强机体的免疫力,而且价格低廉,取材方便,具有无抗药性㊁无残留和无染污等特性,已成为水产养殖动物防治病害的理想药物[23]㊂樊英等[20]考察16种中草药对中国对虾致病菌哈维氏弧菌(V .h a r v e yi T C B S -G )的抑制效果,黄芪和地锦草对病原菌T C B S -G 表现出了极强的抑制效果,其抑菌圈均达到25mm ㊂王洪彬等[24]测定24味中草药对哈维氏弧菌的体外抑菌效果,结果表明黄芩㊁连翘㊁女贞子㊁乌梅㊁苏木㊁夏枯草这6种药物抑菌效果较好㊂在本研究中,黄芪和地锦草对哈维氏弧菌(V .h a r v e yi 05A )无抑菌作用,黄芩对病原菌05A 为中度敏感㊂而大蒜㊁儿茶㊁五倍子和石榴皮等4种中草药对病原菌05A 有较好的抑菌效果㊂其中大蒜对病原菌05A 的抑菌效果略高于氯霉素的效果,且未表现出耐药性㊂分析原因,可能是与哈维弧菌菌株的不同来源以及中草药的制备方式等相关㊂与常规的抗生素相比,大蒜㊁儿茶㊁五倍子和石榴皮均为天然药食用成分,完全可以通过金鲳鱼自身进行代谢,无药物残留,同时也不会污染金鲳鱼养殖水环境,而且来源方便,价格低廉,是可用于金鲳鱼病害防治的理想药物㊂3 结束语本研究从患肠炎病的金鲳鱼肠道㊁腹水中分离纯化获得致病菌05A ,通过显微镜观察细菌的形态特征㊁生理生化特征以及16S r R N A 分子鉴定,确定其为哈维弧菌(V .h a r v e yi 05A )㊂通过单因素实验考察儿茶㊁五倍子㊁黄连㊁石榴皮和大蒜等18种中草药对菌株05A 的抑菌效果㊂结果表明,大蒜㊁儿茶㊁五倍子和石榴皮等4种中草药有较好的抑菌效果,为高度敏感㊂为了进一步提高这4种中草药对哈维弧菌的抑菌效果,本课题组将通过响应面优化实验获得它们的复方制剂㊂此外,目前尚未弄清这几种中草药对哈维弧菌的抑菌机理,还要做进一步的研究和开发,才能更好地减少哈维弧菌对金鲳鱼养殖行业的影响,从而为金鲳鱼的养殖生产实践提供一种安全㊁健康㊁环保的养殖方式㊂参考文献:[1] 虞为,李欣,林黑着,等.不同密度的卵形鲳鲹与凡纳滨对虾混养效果研究[J ].水产学杂志,2021,34(2):86-93.Y U W e i ,L I X i n ,L I N H e i z h a o ,e t a l .E f f e c t s o f d i f f e r e n t d e n s i t i e s o f g o l d e n p o m pa n o T r a c h i n o t u s o v a t u s o n e c o n o m i c a n d e c o l o g i c a lb e n e f i t s i n p o l yc u l t u r e o f p a c i f i c w h i t e l e g s h r i m p L i t o pe n a e u s v a n n a m e i w i t h g o l d e n p o m p a n o [J ].C h i n e s e J o u r n a l of F i s h e r i e s ,2021,34(2):86-93.[2] 王一帆.北部湾海域深水网箱养殖卵形鲳鲹链球菌病的流行病学研究及环境驱动因素分析[D ].湛江:广东海洋大学,2022.132姜芳燕,谢浪萍,杨宁,等.金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治第37卷第2期信阳师范学院学报(自然科学版)h t t p://j o u r n a l.x y n u.e d u.c n2024年4月WA N G Y i f a n.E p i d e m i o l o g i c a l s t u d y a n d e n v i r o n m e n t a l d r i v i n g f a c t o r s o f s t r e p t o c o c c o s i s i n d e e p-w a t e r c a g e c u l t u r e o f T r a c h i n o t u s o v a t u s i n B e i b u g u l f s e a[D].Z h a n j i a n g:G u a n g d o n g O c e a n U n i v e r s i t y,2022.[3]农业农村部渔业渔政管理局,全国水产技术推广总站,中国水产学会.中国渔业统计年鉴 2023[M].北京:中国农业出版社,2023.F i s h e r i e s a n d F i s h e r i e s A d m i n i s t r a t i o n o f t h e M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n d R u r a l A f f a i r s,N a t i o n a l A q u a t i c T e c h n o l o g yP r o m o t i o n S t a t i o n,C h i n a S o c i e t y o f F i s h e r i e s.C h i n a f i s h e r y s t a t i s t i c a l y e a r b o o k:2023[M].B e i j i n g:C h i n aA g r i c u l t u r e P r e s s,2023.[4]李安.患刺激隐核虫病卵形鲳鲹的继发细菌疾病研究[D].海口:海南大学,2020.L I A n.S t u d y o n s e c o n d a r y b a c t e r i a l d i s e a s e s o f T r a c h i n o t u s o v a t u s w i t h c r y p t o c a r y o n i a s i s[D].H a i k o u:H a i n a n U n i v e r s i t y,2020.[5]周永强,李登峰,彭姣,等.养殖三疣梭子蟹体内哈维氏弧菌的分离与致病性鉴定[J].应用海洋学学报,2013,32(2):215-221.Z HO U Y o n g q i a n g,L I D e n g f e n g,P E N G J i a o,e t a l.I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f p a t h o g e n i c V i b r i o h a r v e y i f r o m s w i mm i n g c r a b,P o r t u n u s t r i t u b e r c u l a t u s[J].J o u r n a l o f A p p l i e d O c e a n o g r a p h y,2013,32(2):215-221. 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对两种不同投料方式的大黄鱼肠道菌群结构分析
0 引言 大黄鱼被誉为国鱼，大黄鱼产业的兴起带动了数以千亿的
产业。2017 年，全国大黄鱼总养殖产量将近 18 万 t，其中福建 地区的养殖产量超过 15 万 t。但在大黄鱼养殖中，长期投喂冰 鲜饵料已经带来的一系列问题。另一方面，浮性膨化饲料具有 不容易造成水体污染，不易流失营养成分等优点。但在实际生 产中养殖户仍然以冰鲜饲料投喂为主，浮性膨化饲料在高温季 节作为补充饲料进行投喂。
DNA 的提取： 采用 MOBIO 的 ＲNA PowerSoil DNA Elution Accessory Kit 提取样品 DNA。利用超微量核酸分光光度计 检测 DNA 浓度及纯度。
16srDNA 的 PCＲ 扩增： 用细菌 16S rＲNA 基因 通 用 引 物 338F： 5 ’－ ACTCCTACGGGAGGCAGCA － 3 ’和 806Ｒ： 5 ’－ GGACTACHVGGGTWTCTAAT － 3 ’对 肠 道 内 容 物 DNA 进 行
畜禽业
试验研究
门水平上的物种柱状分布图
属水平上的物种柱状分布图
图 1 在生物学上门、属水平上的物种柱状分布图
试验研究
LIVESTOCK AND POULTＲY INDUSTＲY
No． 3，2019
对两种不同投料方式的大黄鱼 肠道菌群结构分析
柯 翎，李素一，张丽娟，研究所，福建 福州 350001）
黄颡鱼养殖技术要点
黄颡鱼养殖技术要点黄颡鱼由于肉质嫩、细刺少、味鲜美、营养价值高，在国内外市场上深受欢迎，特别是大规格的鲜活鱼供不应求。
而在自然水域中，黄颡鱼的生长速度缓慢，上市规格小，无法大批量满足市场的需求，因而黄颡鱼的人工养殖前景看好，养殖效益较高。
现将黄颡鱼的生物学特性及人工养殖技术要点介绍如下：一、生物学特性：1、黄颡鱼俗称黄姑、黄腊丁。
在分类学上属鲶形目，鮠科，黄颡鱼属。
广泛分布于长江、黄河、珠江及黑龙江各水域，多在静水或江河缓流处活动，营底栖生活，白天栖息于湖水底层，夜间则游到水上层觅食。
该鱼属温水性鱼类，生存温度0～38℃，最佳生长温度25～28℃，最适生长pH值为7.0～8.4，pH超过8.4则生长受影响。
耐低氧能力一般，水中溶氧在3mg/L以上时生长正常，低于2mg/L时出现浮头，低于1mg/L时会窒息死亡。
2、黄颡鱼属中与黄颡鱼相似的种类常见的有瓦氏黄颡鱼(又叫江黄颡鱼，个体一般在500克左右)、长须黄颡鱼、光泽黄颡鱼和细黄颡鱼。
目前人工养殖多是江黄颡鱼（成鱼个体一般在350克以上），少数为黄颡鱼。
黄颡鱼与其它几种黄颡鱼的主要区别是，其它几种黄颡鱼(除长须黄颡鱼外)胸鳍鳍棘外缘光滑，内缘有锯齿。
而黄颡鱼和长须黄颡鱼胸鳍鳍棘内外缘均有锯齿，但长须黄颡鱼体色青黄，须长且鼻须呈黑色。
另外，光泽黄颡鱼、江黄颡鱼、细黄颡鱼的鳍棘均有毒，人被刺后伤处红肿、剧痛，而黄颡鱼的鳍棘基本无毒。
3.黄颡鱼是以肉食性为主的杂食性鱼类，觅食活动一般在夜间进行，食物包括小鱼、虾、各种陆生和水生昆虫(特别是摇蚊幼虫)、小型软体动物和其它水生无脊椎动物，有时也捕食小型鱼类。
其食性随环境和季节变化而有所差异，在春夏季节常吞食其它鱼的鱼卵，到了寒冷季节，食物中小鱼较多，而底栖动物渐渐减少。
规格不同的黄颡鱼食性也有所不同，体长2—4cm，主要摄食桡足类和枝角类;体长5—8cm的个体，主要摄食浮游动物以及水生昆虫;超过8cm以上个体，摄食软体动物和小型鱼类等，人工养殖条件下可以摄食全人工饲料。
池塘养殖患病黄颡鱼病毒病原的电镜观察初报
Vol.34,No.5Oct. 2021第34卷第5期2021年10月水产学杂志CHINESE JOURNAL OF FISHERIES文章编号：1005-3832( 2021 )05-0028-04池塘养殖患病黄颗鱼病毒病原的电镜观察初报刘文枝1,薛明洋1,周勇1,李逸群I,范玉顶1,孟彦1,曾佳彳,曾令兵"(1冲国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 武汉430223;2华中农业大学水产学院，湖北 武汉430070)摘要:应用电子显微镜技术，对池塘养殖下颌出血的患病黄颖鱼P 必eob 昭"fiilvidraco 内脏组织进行超薄切片电镜观察。
在患病黄颖鱼的脾脏和肾脏组织中观察到大量球形无囊膜病毒样颗粒,直径约30~40nm;病毒粒子 分布在宿主细胞的细胞质中，有的由单位膜包裹在包涵体中,而正常黄颖鱼组织中未观察到球形样病毒颗粒。
关键词:黄颖鱼Pelteobagrus fidvidraco ;病毒病原;电镜观察中图分类号:S941.41文献标志码:APreliminary Observation of a Virus-like Particle in Diseased Pond-cultured Yellow Catfish{Pelteobagrus fulvidraco ) by Transmission Electronic MicroscopyLIU Wenzhi 1, XUE Mingyang 1, ZHOU Yong 1, LI Yiqun 1, FAN Yuding 1, MENG Yan 1, ZENG Jia 2,ZENG Lingbing 1*2(1. Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of F ishery Sciences, Wuhan 430223, China;2. College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)Abstract: The spleen, kidney and other organs were observed in the diseased yellow catfish {Pelteobagrus fuhidraco ) with mandibu lar hemorrhage resulted in a massive mortality in the pond-culture of y ellow catfish in Qianjiang, Hubei, China in April, 2020 by elec tronic microscopic technology. A large number of spherical non-enveloped virus-like particles with a diameter of about 30 ~ 40 nm were observed in the spleen and kidney tissues of diseased yellow catfish; the virus particles were distributed in the cytoplasm of thehost cells, and some were wrapped in the inclusion body by the unit membrane. While no spherical virus particles were observed in normal yellow catfish tissues. This finding is the first report on virus-like particles observed in diseased yellow catfish.Key words: yellow catfish {Pelteobagrus julvidraco); virus-like particle; electron microscopy observation黄颖鱼Pelteobagrus fulvidraco 肉质细嫩、营养 丰富、养殖方式多样(单养、混养、网箱养殖)，是我国广泛养殖的肉食性为主的杂食性小型名优经济 养殖鱼类山。
鲁氏耶尔森菌 qPCR 快速检测方法的建立和应用
中国水产科学 2017年11月, 24(6): 1254-1260 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2017-01-09; 修订日期: 2017-03-03.基金项目: 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资助项目(HSY201503); 新疆维吾尔自治区区域协同创新专项(2016E02052). 作者简介: 张枭(1989–), 男, 硕士研究生, 研究方向为水产动物医学. E-mail: zhangxiao0904@ 通信作者: 卢彤岩, 研究员. E-mail: lutongyan@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2017.17001鲁氏耶尔森菌qPCR 快速检测方法的建立和应用张枭1, 2, 李绍戊1, 王荻1, 曹永生1, 卢彤岩11. 中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所, 黑龙江 哈尔滨 150070;2. 南京农业大学 无锡渔业学院, 江苏 无锡 214081摘要: 鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri )是导致虹鳟(Oncorhynchus mykiss )肠炎红嘴病的病原。
本研究以鲁氏耶尔森菌毒力因子rupA 基因为靶标设计1对特异性引物, 以含有rupA 基因部分序列的重组质粒为标准品构建标准曲线, 优化建立检测鲁氏耶尔森菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR 检测方法, 并对腹腔注射鲁氏耶尔森菌菌悬液的虹鳟肝、肾、脾、血液样品进行检测。
结果显示, 设计的引物具有良好的种间特异性, 标准曲线线性方程为y = –3.3766x +40.012(R ²=0.9958); 最低检测限为57 copy/μL, 较常规PCR 的灵敏度高出约100倍。
应用检测结果表明, 本方法可准确检测被鲁氏耶尔森菌感染的虹鳟样品。
研究表明, 所建立的qPCR 方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点, 可用于快速诊断虹鳟肠炎红嘴病早期病症及定量检测鲁氏耶尔森菌。
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黄颡鱼小肠结肠炎耶尔森氏菌16SrDNA及系统发育分析苟小兰1，王利1*，黄艳青2（1.西南民族大学生命科学与技术学院动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室，四川成都610041 2. 中国水产科学研究院东海水产研究所，上海，200090）摘要：从发病黄颡鱼心脏中分离到1株细菌GM2402，对该菌株进行分离培养、形态学观察、生理生化试验与16S rDNA基因的PCR扩增及序列分析。
结果表明，菌株GM2402为革兰氏阴性杆菌，具动力性，V-P试验、水杨酸、过氧化氢酶、脲酶等阳性，不发酵鼠李糖、乳糖等，硫化氢、枸椽酸盐等阴性。
16S rDNA序列长1417bp，GenBank中的登录号是JX101598，且与数据库中小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）的相似性高达99.6%，系统发育树显示与小肠结肠炎耶尔森氏菌聚为一个分支。
综合菌株GM2402的生化特性及分子生物学分析结果，判定菌株GM2402为小肠结肠炎耶尔森氏菌,为水生动物致病菌的分子鉴定积累了参考资料。
关键词：黄颡鱼；小肠结肠炎耶尔森氏菌；16SrDNA；系统发育分析Phylogenetic Analysis and 16S rDNA of Yersinia enterocoliticaIsolated from Yellow Cartfish（Pelteobagrus fulvidraco）GOU Xiao-lan1, WANG Li1*, HUANG Yanqing2(1.Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education, College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities , Sichuan Chengdu 610041 2.East China Sea fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090)Abstract:One bacteria strain named GM2402 was isolated from the heart of natural diseasedyellow cartfish (Pelteobagrus fulvidraco), the strain was identified according to its morphologicalcharacteristics, physiology and biochemistry experiments, as well as, PCR amplification of 16SrDNA genes and sequence analysis. The results showed that strain GM2402 was Gram-negativebacterium, the ability to movement and MR-VP, salicylic acid, catalase and urease were positive,but L-rhamnose, Galactose, H2S and citrate salt were negative. 16S rDNA sequence of strainGM2402 was 1417bp and accession number was JX101598. Strain GM2402 shared 99.6%identity with Yersinia enterocolitica strains in GenBank database. Phylogenetic tree demonstratedthat strain GM2402 was gathered into one cluster with Y. enterocolitica. Both biochemicalcharacter and molecular analysis were proved that strain GM2402 was Y. enterocolitica. It willbenefit the identification of Y. enterocolitica in aquatic animals.Keywords:Pelteobagrus fulvidraco; Yersinia enterocolitica; 16S rDNA; phylogenetic analysis黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）又名黄腊丁，属鲶形目，鲿科黄颡鱼属，广泛分布在我国各种水域中，是重要的淡水经济鱼类。
黄颡鱼具肉质细嫩、肌间无刺、营养价值高等优点，在保健方面还有益脾肾、利尿消肿的药理作用，使其不仅深受消费者青睐，也引起了科技人员的极大关注。
近年来，国内外已有一部分学者对黄颡鱼开展了一系列研究，刘汉勤（2007）和马旭洲（2006）等对黄颡鱼的生长发育进行了探讨，吴旋（2011）研究了灵芝、黄芪多糖对黄颡鱼免疫细胞活性的影响，宋平（2001）与赵文学（2006）运用RAPD标记对黄颡鱼进行了分子鉴定及遗传多样性的分析。
目前，受养殖方式的集约化、水环境恶化等多因素的影响，使得黄颡鱼在养殖过程中面临的各种疾病问题日益凸显，邓先余(2008)与周冬仁(2010)等分别从患病黄颡鱼体内分离得到迟钝爱德华氏菌，黄钧(2012)从患体表溃疡病的鱼体中分离出了嗜水气单胞菌与温和气单胞菌，但尚未见到黄颡鱼小肠结肠炎耶尔森氏菌的相关报道。
本试验从自然发病黄颡鱼体中分离到菌株GM2402，在细胞形态学基础上，采用16S rDNA序列及系统发育分析等方法对分离菌进行了鉴定，以期望为黄颡鱼细菌性病原的分子鉴定积累科学资料。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物发病黄颡鱼于2012 年3 月采自成都市某养殖场，体长11.5cm，体重16.7g。
患病症状主要表现为头部及背、腹部局部皮肤溃烂，眼睛暗淡无光，下颚、腹鳍基部等充血，肛门轻微红肿并伴有少量淡黄色液体流出。
1.1.2 主要试剂及仪器营养琼脂培养基（Nutrient Agar，北京奥博星生物技术有限责任公司），蛋白胨（TRYPTONE OXOID.），牛肉膏粉（Beef Extract Powder），琼脂（Agar），生化鉴定用品等均购于杭州微生物试剂有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生化科技有限公司）。
PCR仪（Eppendorf Germany），电泳仪（BIORAD），凝胶成像系统（BioRAD Laboratories Segrate Italy）。
1.2 方法1.2.1 细菌分离与纯化无菌操作取黄颡鱼心脏组织，一部分剪碎后存放于LB肉汤培养基中，一部分划线接种到营养琼脂培养基上，28℃培养18h，选取形态均一的优势菌群，挑选单个菌落进行划线纯化。
观察、记录菌落形态特征，置4℃保存备用。
1.2.2 生理生化鉴定将纯化细菌穿刺接种于生化特性鉴定管中，进行动力性、H2S、枸椽酸盐、过氧化氢酶、七叶苷、乳糖、D-木糖、L-鼠李糖等理化测定试验。
结果参考《伯杰氏系统细菌鉴定手册》（Brenner et al，2005），对该菌株进行初步鉴定。
1.2.3 16S rDNA基因的PCR扩增模板DNA的制备：将细菌接种到LB液体培养基中，28℃振荡培养14h，离心收集菌体，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌总DNA。
细菌16S rDNA扩增的通用引物：正向引物5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTTAG -3＇，反向引物5＇-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3＇，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
PCR扩增及测序：在50ul反应体系中含有：模板4ul，上引物、下引物各2ul（引物浓度均为10μmol/L）， Mix 25ul，ddH2O 17ul。
PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃ 变性30s、复性60℃ 30s、72℃ 延伸4min，5个循环；转94℃ 3变性0s、55℃ 复性30s、72℃延伸 4min，5个循环；最后94℃ 变性30s、50℃复性 30s、72℃延伸 4min，30个循环。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并将阳性样品送交上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。
1.2.4系统发育树的构建及分析利用Blastn系统对分离菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中相关亲近物种进行同源性检索，找出相似性最高的菌株及同属菌株作建树内群，另选取肺炎克雷伯杆（K.pneumoniae）作建树外群。
采用DNAStar软件中的MegAlign程序分析分离菌株与耶尔森氏属其他细菌的同源性，再运用 ClustalX2.0软件进行多序列比对（王禄山，2008），结合MEGA5.0软件包中Neighbour-Joining法构建系统进化树，采用 Kimura-2-parameter作为校正模型估计遗传距离，用Bootstap法进行置信度检测，重复抽样1000次。
2结果与分析2.1细菌分离分离所得菌株在营养琼脂培养基上28℃ 恒温培养18h后，菌落呈现为圆形，直径1.0～3.2mm，乳白色向上隆起，边缘整齐，表面光滑湿润。
经革兰氏染色后发现，菌株为革兰氏阴性短杆菌，多单个散在分布或排列成堆。
2.2 生理生化鉴定菌株GM2402主要生理生化试验结果见表1，即表现为具动力性，V-P试验阳性、β-半乳糖苷酶、过氧化氢酶阳性，不利用枸椽酸盐，不分解蔗糖、葡萄糖，不发酵鼠李糖、棉籽糖、肌醇、七叶苷，还原硝酸盐为亚硝酸盐，产H2S。
结果参照《伯杰氏系统细菌鉴定手册》基本符合小肠结肠炎耶尔森氏菌的生化特性。
表1 菌株GM2402的生化鉴定结果Table 1 Results of biochemical experiment of strain GM2402鉴定项目小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株GM2402动力（Motility）+ +硫化氢（H2S production）- +硝酸盐还原酶（Nitrate reductase）+ +葡磷胨水（MR.VP）+ +β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase) + +葡萄糖（Glucose）- -蔗糖（Sucrose）- -棉籽糖（Raffinose）- -鼠李糖（Rhamnose）- -过氧化氢酶（Catalase）- +水杨酸（salicylic acid） [-] +七叶苷（Aesculin hydrolysis） d -肌醇（Inositol） d -枸椽酸盐（Citrate）- -侧金盏花醇（Adonitol）- +Note: “+” Positive; “-” Negative; “[-]” 11～25%Positive; “d” difference betwe en strains2.3 16S rDNA扩增及分析以菌株GM2402总DNA为模板，采用16S rDNA通用引物对其进行体外扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，最终扩增出长度大小约为1500bp的PCR产物，结果见图1。