细菌原生质体育种技术及其应用进展
3.原生质体技术
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2、 原生质体的分离
渗透压稳定剂
在配制酶液时，必须加入适量的渗透压稳定 剂，以代替细胞壁对原生质体所起的保护作用。 因为细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于低 渗透压的溶液中，就会立即破裂死亡。 甘露醇和山梨醇等糖醇是最常用的渗透压稳 定剂，有时也用葡萄糖。糖醇一般用于游离叶肉 等材料的原生质体。葡萄糖则常用于游离悬浮细 胞的原生质体。渗透压稳定剂的浓度因植物材料 不同而异，一般为0.3～0.7mol/L。
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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2、 原生质体的分离
试管苗的子叶、胚轴以及培养的悬 浮细胞具有无菌、不受生长季节影响等 特点。 许多试验结果指出，利用试管苗作 为供体材料时，苗龄对分离原生质体及 其后培养的效果影响较大。另外，培养 的悬浮细胞，如果经过多次的继代培养， 常常会出现再生植株能力减退和遗传上 的不稳定性等现象。
1.原生质体的研究概况
原生质体
核质体
植物细胞
胞质体
中南林业科技学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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1.原生质体的研究概况
1.2 原生质体的研究进展
1、1863年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast) 一词。 2、1892年，Klercker用刀片细切植物组织机械分离 出原生质体。 3、1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质 体获得成功。 4、1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质 体培养的再生植株。 5、1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水 稻原生质体培养再生植株。 6、1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养 再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。
杂交育种
酵母细胞的接合过程
杂种的获得
利用营养缺陷性作为遗传标记
杂种的获得
2、质粒 独立于细菌染色体外能进行自主复制的小型环状裸露的DNA 分子，位于细胞质中。 质粒可以从细胞中人为地取出或自行脱落，这些对细菌自 身的生活影响不大。但它在细菌的杂交过程中有十分重要的作 用。
质粒基因可编码很多重要的生物学性状： 1、致育质粒（fertility plasmid,F质粒）
2、耐药质粒（resistance plasmid,R质粒）
真核微生物
有性生殖 生殖细胞融合或接合 准性生殖 体细胞接合
细菌常规杂交育种
一、细菌的繁殖和遗传结构
（一）细菌的生长繁殖方式 • 个体生长繁殖方式
1、繁殖方式——二分裂(binary fission)
2、在适宜的人工培养条件下，多数细菌繁殖速度极快，每20-30分钟分裂 一次（一代）。
（二）细菌的遗传结构 1、细菌的染色体 细菌的染色体大都是环状裸露的双链DNA分子，DNA分子不 像真核生物那样与组蛋白结合，也不形成核小体结构，位于细 胞核（拟核）中 。
物染色体的环状特性。
原理：接合试验的DNA转移过程存在着严格的顺序性，在接合进行中采用
定时人为中断的方法，可以获得呈现不同数量Hfr性状的F–接合子，据此，
可以选定几种有特定整合位点的Hfr菌株，使之与F–菌株进行接合，并在不
同时间使其中断，最后，根据F– 中出现Hfr菌株中各种形状的时间顺序 （分钟），可以绘出较为完整的环状染色体图（chromosome map）。
大片段DNA的过程成为接合（有时也称“杂交”）,特点是 遗传物质单向转移，由供体菌到受体菌，不可逆向转移。
转化：受体菌直接吸收了来自于供体菌的DNA片段，通过交 换，把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部 分遗传性状的现象。转化后的受体菌，成为转化子（感受 态细胞）。
《原生质体育种》课件
化学诱变
使用化学诱变剂处理原生 质体，诱发基因突变，筛 选具有优良性状的新品种 。
细胞融合
将不同物种或同一物种不 同品系的原生质体进行融 合，以获得具有杂种优势 的新品种。
原生质体育种的应用
培育抗逆性强的新品种
改良作物的品质
通过原生质体育种技术，可以筛选出具有 较强抗逆性的新品种，如抗旱、抗寒、抗 盐碱等。
详细描述
物理法包括电融合、激光融合等，这些方法利用物理能量来诱导原生质体的融 合。化学法则是利用化学物质如聚乙二醇等诱导原生质体的融合。这些方法的 选择取决于实验条件和目的。
原生质体融合的应用
总结词
原生质体融合在植物育种、基因工程和生物技术等领 域有广泛的应用。
详细描述
在植物育种方面，原生质体融合可以用于创造新的植物 品种，通过将不同亲本的原生质体融合，可以产生具有 优良性状的杂种细胞，进而培育出新的植物品种。在基 因工程领域，原生质体融合可以用于基因转移和基因编 辑，通过将外源基因导入原生质体，可以实现基因的转 移和表达。此外，原生质体融合还可以用于研究细胞融 合的机制和细胞生物学特性，为生物技术的发展提供重 要的理论支持和实践经验。
现植物的遗传改良。
细胞融合
02
将不同植物的原生质体进行融合，创造新的植物品种或改良现
有品种。
细胞培养生产有用次生代谢产物
03
利用原生质体培养生产具有药用、工业或其他用途的次生代谢
产物。
02
原生质体融合
原生质体融合的定义
总结词
原生质体融合是将两种或多种植物细胞原生质体通过物理或化学方法融合，形成一个杂种细胞的技术 。
原生质体育种
目录
• 原生质体培养 • 原生质体融合 • 原生质体育种技术 • 原生质体育种的优势与挑战 • 原生质体育种案例分析
食用菌育种技术的研究进展
食用菌育种技术的研究进展作者：桂明英等来源：中国食用菌，2006（5）随着人们对食用菌营养价值和药用价值认识的提高以及食用菌生产所带来的经济效益的增加。
食用菌育种工作也成为食用菌科技工作者关注的热点之一。
现对食用菌育种工作的研究进展进行综述，以期为食用菌的育种工作提供参考。
一、野生食用茵驯化育种野生食用菌驯化栽培．是食用菌育种的重要内容．栽培的食用菌品种绝大部分是由野生食用菌驯化而来的。
例如：阿魏蘑的驯化工作．是中国科学院新疆生物土壤沙漠研究所于1983年开始的．当时曹玉清、牟川静、陈忠纯等在研究驯化分布于新疆托里地区的野生阿魏侧耳fP／eurotu~retainel时，对其形态特征、分类地位、氨基酸含量、生活条件(包括营养、pH值、温度、湿度、光照和通风)、菌丝培养特征、驯化栽培等进行了研究。
观察到分离的野生菌株K001、K002与K005在培养特征上的差异。
1986年他们又在新疆木垒采集到Kill标本．在进一步研究中发现．K005、Klll在子实体外部形态与菌丝培养特征上与阿魏侧耳显著不同。
经研究定名为阿魏侧耳托里变种[Pieurotus ervngii(DC．ex． Fr)0ueI．var．tuolie nsis Mou．n var]。
他们1983年对 K001、K002、K005菌株驯化栽培中．发现在有无寄主植物阿魏根屑添加在培养基中的情况下．用棉籽壳、云杉木屑、麸皮等原料组成的培养基上都相继长出了子实体．阿魏侧耳及托里变种自此得到推广．首先在新疆开始人工栽培。
已成为近年来大面积进行商业性栽培的一种食用菌新品种。
其菇体肥大、颜色洁白、菌肉细腻、质地脆嫩、久炖不绵、清爽滑润、味美可口、营养丰富．投入市场后深受人们的青睐。
目前我国引进和驯化栽培成功的食用菌已达80多个种。
二、孢子分离育种单孢分离就是将采集到的孢子群单个分开培养，让其单独萌发成菌丝而获得纯培养的方法。
曹裕汉通过对草菇有性分离选育种研究．表明草菇孢子分离菌株在菌丝形态、生长速率、产厚垣孢子能力、出菇、产量等性状上存在较大的差异。
诱变育种方法在微生物育种中的应用概述
诱变育种方法在微生物育种中的应用概述摘要：在现代发酵工业中，诱变技术（无论是物理还是化学诱变）对于促进微生物发酵从而提高利用反应底物的能力和高产率仍然起着至关重要的作用。
本文主要从工业生产中对于微生物的诱变育种的方法（物理、化学诱变育种等）进行了综述，以及通过几种常见的诱变方式来介绍在微生物育种方面的相关研究进展。
关键词：微生物；诱变育种；物理诱变；化学诱变一、前言现代发酵工程技术的最终产物，一般都是由微生物生产得到的，且通过微生物的发酵生产所取得的效益已经得到了全世界的瞩目和认可。
对工业微生物菌种的优化选育是提高产量和质量的一条有效途径。
以突变和筛选为中心的传统育种技术在工业微生物发展到现在规模的过程中始终起着重要作用。
70年代以来，重组DNA技术和原生质体融合技术开始用于菌种选育。
各种外源基因在原核生物、真核细胞的克隆和表达研究取得了重大成果，使工业微生物育种技术进入了真正意义的分子水平育种时代[1]。
常规的诱变育种方法主要为物理诱变和化学诱变两种。
微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选出产量高、性状优良的突变株，并找出这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适条件下合成有效产物。
以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大和方法简单等优点，是菌种选育的一个重要途径，在发酵工业菌种选育上具有卓越的成就，迄今为止，国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱变选育出来的[2]。
理想的工业化菌种必须具备遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存、能经诱变产生变异和遗传、生产能力具有再现性、具有高产量和高收率等特性。
而从自然界分离的野生菌种，不论是在产量上还是在质量上，均难适合工业化生产的要求。
但诱变筛选方法相对简便，是菌种选育的基本、常规和经典方法。
特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是必不可少。
原生质体融合技术简介
(1)渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不 仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶 和底物的结合。渗透压稳定剂多采用Kcl、NaCl等 无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有 机物。菌株不同，最佳稳定剂也有差异，在细菌 中多用蔗糖，丁二酸钠、NaCl等；在酵母菌中多 用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。 稳定剂的使用浓度一般均在o．3一o．8mol/L之间。
在链霉菌原生质体融合育种方面
邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新留素产生菌 的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产 生原养型重组体的频率为10-4。其中有58% 产生巴龙霉素，并从中获得了产量比原始菌 株(300ug/ml)提高5—6倍的融合子。
杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定 霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株 进行融合，以自身抗生素抗性为标记选择种 间融合子，从而获得了一株正定霉素产量较 亲株提高了2.6倍的融合子。
另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是 菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境
(1) 菌体的前处理 为了使酶的作用效果更好一些， 可对菌体作一些前处理，主要是在培养基中加入 一些物质，加入这些物质的目的，就是使菌体的 细胞壁对酶的敏感性增加。例如：青霉素能干扰 甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D—丙氨酸之间的联 结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的 细壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。
原生质体融合技术简介
一 原生质体融合
定义：原生质体融合就是将两个亲株的细 胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在 高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的 球状原生质体。然后将两个亲株的原生质 体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融， 使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发 生两次基因组之间的接触、交换、遗传重 组，在再生细胞中获得重组体。
原生质体融合技术及其在果酒酵母育种上的应用
第１第 期 ２０ ９ ０年９ ３ 月 卷
ｌ ６３ ＝＝ Ｉ
原生质体融合技术及其在 果酒酵母育种上的应用
陈娟 阚建全 杨蓉生 杜木英 ， ， ， （． １西南 民族 大学生命科学 与技术 学院 ， 四川 成都 ６０ ４ ； ． １０ １２西南大学食品科学学 院 ， 重庆 ４ ０ １ ） ０ ７ ５
原 生质体 融合技 术 （ｒ ｏ ｌ ｔｕｉ ） 称为 细胞 ｐｏ ｐ ｓｆｓ ｎ 又 ｔ ａ ｏ 融合技术 ， 是指用 酶法 去除细胞 壁 ， 制成 由原生质膜包 被 的原生质体 ， 然后采用 物理 、 学或生物学方 法诱 导 化
了细胞融 合技术 的发展 ，使该技 术跃上 了新 的阶段 。
摘 要 ： 原 生质 体 融 合技 术 的研 究 进展 进 行 概 括 ， 述 该 技 术 的 重 要 环 节 ， 对 论 包括 遗 传 标 记 选择 、 生 质 体 制 备 、 生 原 再
和融合 以及融合子的鉴定等。通过分析其在降酸、 增香 、 嗜杀活性和抗氧化性等优 良性状整合上 的研 究结果， 表明原
作 中 ， 大地 推动了微生物研究的进程 。 极 ２ 原 生质体 融合技术
生质体 ， 并提 出了原生质体 的概念 。Ｅ ｄ ｄｙ和 Ｅ ｍ ｒ ｎ ｍ ｅｓ ｏ
又 以酶法相 继 制备 出 了酵母 菌 和丝状 真 菌细胞 的原
生质体 ， 为微生物 的细胞融合开辟 了道路 。１７ ９ ４年 ， 加 拿大籍华人高 国楠发现 聚乙二醇（ Ｅ 在 ｃ 参与下 Ｐ Ｇ） ａ 能促进植 物细胞原 生质体融合 ， 这一发 现极 大地促进
时首次发现了细胞融合现象 。１６ 年 ， 本 的 Ｏ ａ ａ ９０ 日 ｋ ｄｔ
利用原生质体融合技术选育微生物菌种_谭周进
文章编号:100028551(2005)012075205综 述利用原生质体融合技术选育微生物菌种谭周进1 杨海君2 林 曙3 吴 铁3(11湖南农业大学生物安全科技学院,湖南长沙 410128;21湖南农业大学植物保护学院,湖南长沙 410128;31湖南农业大学动物科学院,湖南长沙 410128)摘 要:对原生质体融合技术的遗传标记筛选、原生质体的制备与再生、原生质体融合等的方法,以及原生质体融合技术在提高抗生素生产效价、酵母菌工程菌株的构建、多功能菌株的选育以及污水处理工程菌的构建等方面的研究情况进行了综述。
就原生质体融合技术在微生物育种技术上的应用前景进行了分析。
关键词:原生质体融合;菌种选育;生物技术PR OTOP LAST FU SION TECHN OLOG Y AN D MICR OBIA L BREE DINGT AN Zhou 2jin 1 Y ANG Hai 2jun 2 XI AO Qi 2ming 2 LI N Shu 3 W U T ie3(11College o f Bio 2safety Science and Technology ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,Hunan ,410128;2.College o f Plant Protection ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,Hunan ,410128;31College o f Animal Science ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,Hunan ,410128)Abstract :Researches on selecting of genetic marks ,preparation and regeneration of protoplast ,protoplast fusion ,and the application of protoplast fusion technique in microbial breeding were reviewed.The antibiotics strain im provement ,construction of yeast engineer strain ,breeding of multi 2functional strain and construction of engineer strain to coping with waste water were als o included.The application of protoplast fusion technology in microbial breeding was analysed.K ey w ords :protoplast fusion ;strain breeding ;biotechnology收稿日期:2003211209作者简介:谭周进(1969-),男,博士,副教授,主要研究方向为微生物生态学与发酵工程。
微生物育种学的主要原理和技术
微生物育种学的主要原理和技术摘要微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。
微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等，育种技术的不断成熟，大大提高了微生物的育种效果。
本文将讲述微生物育种学的主要原理和技术。
关键词：微生物育种原理方法技术1.微生物育种学的主要原理微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。
其原理如下：生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制→不会有代谢产物的积累→解除或突破微生物的代谢调节控制→目的产物积累→微生物育种的目的2.微生物育种学的主要技术2.1 自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。
一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量效应和互变异构效应。
所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。
互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。
自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。
为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。
自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。
但是自然选育的效率低，因此经常要与诱变育种交替使用，以提高育种效率。
由于DNA的半保留复制以及校正酶系的校正作用和光修复、切除修复、重组修复、诱导修复等作用，使得自发突变几率极低，一般为10-6～10–10。
所以常规育种时间较长，工作量较大。
通过常规育种提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低，效果不明显。
难栽培食用菌原生质体融合技术研究进展
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ｔ ｉｄ ｓ ｉａ ｌ ｕｔ ｒ ｄｕ ．Ｉ ｓｉ ｏ ｓｂ ｅｔ ａｎ ｆｕｔｎ — ｂ ｄ ｆｔ ｅｅ ｉ ｌ ｕ ｇ． Ｔｈ Ｏ ｆ ｕｔｂ ｅｃ ｌ ｅｍｅ ｉｍ ｎ ｕ ｔｉ ｍｐ ｓ ｉｌ Ｏ ｇ ｉ ｒ ｉｉｇ ｏ ｙ ｏ ｈ ｄｂ ｅｆ ｎ ｉ ｅ
ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ｆｐ ｏｏ ｌｓ ｕ ｉｎ ｂ ｌｎ ｓｔ ｅｌ ｅ ｇ ｎ ｅ ｉｇｂ ｅ ｄｎ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｏ ｒ ｔ ｐａ ｔｆ ｓｏ ｅｏ ｇ Ｏｃ ｌ－ ｎ ｉｅ ｒｎ ｒ ｅ ｉｇ－ｗｈｃ ｅ ｅｏ ｅ ａ ｉ ｌ ｉｈｉ ｄ ｖ ｌｐ ｄ ｒ ｐｄ ｙ ｓ
・ 收 稿 日期 ： ０ ５ １ — ３ ２０— ０ １ 基金项 目： 哈尔滨市科技攻关项 目 （ｏ ２ ２ ０ ＡＱ） ０ ） ｃ ８ Ｊ
１ 原 生质 体 的制备
１５ 年 Ｅ ｒｏ ｄ等 人用 蜗牛酶 和半纤 维素 酶 ９７ ｍｅｓｎ
得 到 了丝 状真 菌的 原 生质 体 ， 而 奠 定 了真 菌 原 生 从