第九章：原生质体培养与体细胞杂交

优点： 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高； 愈伤组织 融合过程不受物种限制。
不定芽 缺点： 融合过程繁琐 根形成 PEG 可能对细胞有毒害。
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诱导融合方法
（二）电融合法：利用改变电场来诱导原生
质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜 发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。
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2、培养方法
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液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄 层，封口后进行培养。 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易 于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质 体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发 育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情 况。
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1、原生质体的纯化方法
（3）梯度离心法：利用比重不同的溶液，经离心 后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间， 而细胞碎片等杂质则沉于管底。用这种方法可以 获得更为纯净的原生质体。
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原生质体的纯化步骤

用300-400目不锈钢网过滤酶解材料,弃去残渣
600rpm, 5-10min

吸去上清 原生质体重悬于0.16mol/L CaCl2· 2H2O溶液中
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机理：

1、NaNO3诱导融合
原生质体表面带有负电荷(-10～-30mV)，同性 质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法靠近到足 以融合的程度。 NaNO3中的钠离子能中和原生质体表面的负 电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进 细胞融合.

融合率 0.1%-4%。
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2、PEG（聚乙二醇）与高pH、 高Ca2+相结合诱导融合

PEG，能与水、蛋白质、糖等具有正极性基团的极 性物质形成氢键，在相邻原生质体表面间作为分子 桥，使原生质体发生粘连

当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新
分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可
能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，
导致原生质体融合。
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2、PEG（聚乙二醇）与高pH、 高Ca2+相结合诱导融合


在容器底部缓慢注入20%蔗糖溶液
600rpm, 5-10min

收集两层液面之间的纯净的原生质体
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Leaves were cut in thin stripes and digested in an enzyme solution
Purification of protoplasts
Purified protoplasts
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1978年，Melchers获得了第
一个属间细胞杂种（番茄＋
马铃薯）；
Tomato+Potato= Pomato
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二、研究意义

◆杂交优势：两个遗传基础不同的植物或动物 进行杂交，其杂交后代所表现出的各种性状均 优于杂交双亲，比如抗逆性强、早熟高产、品 质优良等。
性，使有性杂交根本无法获得的种间、属间、 科间远缘杂种成为现实。
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Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa)
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四、融合细胞的筛选

互补选择法:指利用两个亲本具有不同遗传和
生理特性, 在特定培养条件下,只有发生互补作用 的杂种细胞才能生长的选择方法。

抗性互补选择法 叶绿体缺失互补选择法 营养代谢互补选择法 生长互补选择法
矮Байду номын сангаас牛+爬山虎融合体的选择
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抗性互补选择
抗A不抗B 型细胞 融合体
抗B不抗A 型细胞
含A、B 培养基
杂种细胞
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白化互补选择法
以矮牵牛为例： 白化苗原 生质体1
融合
杂种细胞
限定培养基
白化苗原 生质体2
绿色愈伤组织 或幼苗杂种
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营养缺陷型互补选择
Gly-型细胞 融合 Pro-型细胞
培养
Gly-、Pro-培 养基
融合效率高。
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3、电融合的基本过程
细胞膜的接触：当原生质体臵于 电导率很低的溶液中时，电场通 电后，电流即通过原生质体而不 是通过溶液，其结果是原生质体 在电场作用下极化而产生偶极子 ，从而使原生质体紧密接触排列 成串；
原生质体成串
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膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给 予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从 而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
琼脂糖珠培养
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸 管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿， 待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床 上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体 培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于 其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了 培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质 体的分裂和细胞团的形成。


作用：改变细胞和细胞壁的生理状态；增加细 胞膜的强度；减轻酶溶液中杂酶对原生质膜的 损伤。 方法：暗处理；预培养；预质壁分离；
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（三）原生质体的分离方法
1、机械法：
原生质体得率 极低，难以大 量制备
2、酶法：
大量获得植物 原生质体的有 效方法
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（1）酶的类型
A. 纤维素酶，如Onozuka R-10及RS，国内常用的为EA3867，其中含少量果胶酶，0.5-2.0％ ；
B.半纤维素酶，如Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆 科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离; C.果胶酶，如Macerozyme R-10 又叫离析酶，主要含果 胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2％，作用 时间长有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y-23，也叫离 析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0.1-1.0％，悬浮 细胞为0.05％； D.崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素 酶及果胶酶活性；
第九章 原生质体培养 与体细胞杂交
第一节 原生质体培养
一、 原生质体概述
（一）定
原生质体(protoplast)—
义
脱去细胞壁、裸露的植
物细胞。原生质体是为
质膜所包围的裸露细胞。
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（二）原生质体特点
原生质体无细胞壁障碍，便于 进行有关遗传操作；在诱导条件 下易发生融合，形成杂种细胞； 具全能性,能再生细胞壁,能进
固体平板培养
即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖与原生 质体融化混合，将含有原生质体的培养基铺于 培养皿底部，封口后进行培养。 优点： 可以跟踪观察单个原生质体的发育情 况，易于统计原生质体分裂频率。 缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌 握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力， 温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合 均匀。
原生质体的分离与纯化录相
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五、原生质体的活力测定
1、目测法
根据形态待征判断
其活力：原生质
体呈绿色（若来
源于叶片）及圆 而鼓者为活原生 质体。
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2、染色法
（1）FDA （荧光素双 醋酸酯, ）染色法(0.01%) 原理:FDA本身无荧光，
无极性，能自由穿越细胞
质膜，在活细胞内，FDA 被酯酶裂解，分解形成荧 光素，荧光素不能自由穿 越细胞质膜。
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（2）酶液的pH值
酶液pH值相当重要，纤维素酶及果胶酶 单独使用时，其pH分别以4.0-5.0及5.8为宜； 混合使用时pH5.8-pH6.0为宜，降至4.8以下
则原生质体破裂。酶液配制后需以0.45μm微
孔膜过滤除菌，而不可采用加热灭菌法。
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四、原生质体的纯化
1、原生质体的纯化方法
采用40-300μm的网筛过滤细胞混合液，除去未消化的细胞、 细胞团、碎片， 收集滤液，进行以下纯化方法。 （1）沉降法：在适当溶剂内低速离心使原生质体下沉于 离心管底部，细胞碎片留在上清液中，如此收集得到的原 生质，反复3-4次。 （2）漂浮法：原生质体比重较小，能在具有一定渗透压 的溶液（如25%的蔗糖溶液）中漂浮，然后用吸管收集。
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1、电融合法的原理
在直流电脉冲的诱导下，原生质体质 膜表面的电荷和氧化还原电位发生改 变，使异种原生质体黏合并发生质膜 瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到 闭和成完整的膜形成融合体。
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2、电融合法的优点
与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：
不存在对细胞的毒害问题；
融合技术操作简便；
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液体-固体双层培养
在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基， 再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。 优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到 液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一 定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一 些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的 形成。 缺点：不易观察细胞的发育过程。
3、植板密度

初始植板密度一般为: 1×104/ml~ 1×105/ml
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4、原生质体再生植株的过程
细胞壁再生
细胞分裂与生长
愈伤组织或胚状体的形成 再生植株
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A-D当归(Angelica sinensis(Oliv) Diels)原生质体培养成再生苗 E-H,红豆草(Onobrychis vicaefolia Scop) )原生质体培养再生植株

钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生 质体膜的结合； 高pH又能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合,但对

细胞有毒害；

在高Ca2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分 子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调，从而提高融合的
几率。

融合率10-50%
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培养过程：