植物组织培养第4章植物原生质体培养及细胞融合
细胞工程___第四章原生质体与细胞融合用
五.原生质体鉴定
1)低渗爆破法：无壁吸水向外膨胀直至胀破，是无形 的。有部分细胞壁，则原生质体从破碎后留下的残 迹仍保持半圆形的细胞壁。
2)荧光染色法:将原生质体放大离心管中，加入0·7mo l/L甘露醇配置的0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染 色5-10Min ，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光 显微镜下观察(波长3600-4400A0)。绿色光显示纤维 素的存在，发出红色光的没有纤维素的真正的原生 质体。
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质 体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细胞分裂等。
常用质膜稳定剂有：
葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl•2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid 2-( N-吗啉代)乙磺酸
作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调 节pH值。
(4)氧电极法:有活力的原生质体在光照下会进行光合 作用而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸而 耗氧。因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来原 生质体是否具有活力。
第二节 细胞融合
一、细胞融合的概念
细胞融合，也称原生质体融合，或体细 胞杂交。是指两种异缘（种间、属间）原生 质体，在诱导剂诱发下或电冲击下，发生膜 融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞， 进一步发育成杂种植物体。
甘露醇
0.6 M
CaCl•2H2O
0.5%
MES
5.0 mM
pH
5.8
6、原生质体的游离与纯化(以叶为例)
1）、原生质体的游离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无 菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表 皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉， 留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
04-植物原生质体的制备及融合-卢文
原生质体的制备及融合生31 卢文2003012377一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。
b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。
二、实验原理：详见讨论。
三、实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、盖玻片。
四、试剂：a)洗涤液：甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6b)酶混合液：纤维素酶1%果胶酶0.5-0.7%甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6c)PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖0.3mMpH=5.8d)高Ca，高pH洗涤液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇100mMpH=10.5e)蔗糖溶液：20%五、实验步骤：a)原生体的制备i.将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。
ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。
iii.酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。
iv.500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。
500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。
v.加8滴洗涤液，悬浮原生质体。
vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。
b)PEG融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。
ii.各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。
iv.镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。
4原生质体培养和融合
1、 离心沉淀法
原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原 生质体沉于底部。
步骤： • 第一步：原生质体溶液用400目网筛过滤。 • 第二步：离心（500~1000r/min离心5~6min）。 • 第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）
重新悬浮，再离心沉淀。如此2~3次。 • 第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生
对幼叶来说，酶浓度较低：0.5％-1％纤维 素酶，果胶酶(0.2％-0.5％); 酶量少
对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶 酶的浓度要提高到1％或2％。酶量大 酶液PH值：5.4 - 5.8
PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多
2.3 酶液渗透压
• 裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下， 才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。 因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁 对原生质体起保护作用。
•常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、 山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。
目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地 维持渗透浓度。而蔗糖等易被原生质体吸收利用， 降低渗透浓度，故不常用。
2.4 材料预处理 (暗处理，预培 养和低温处理)
在酶处理前，常把供体组织置于合适浓 度的稳压液中，预质壁分离约一小时后再用 酶液处理。
2-6 其它
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
2-7 原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
• 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
• 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
• 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6
原生质体融合操作方法
原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。
在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。
以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。
用酶类解除细胞壁以获得原生质体。
2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。
3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。
4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。
5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。
需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。
在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。
遗传学ppt课件第4章 原生质体培养及融合配色
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
4.原生质体培养与细胞融合(植物组织培养)
原生质体培养与细胞融合第一节原生质体培养一、原生质体的培养概况1、概念：植物的原生质体：指除去细胞壁以后的裸露细胞。
原生质体培养：是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功。
2、原生质体培养的意义①比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
②便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本科植物，高光效植物，高抗植物）③原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等3、原生质体培养程序取材→预处理→分离→纯化→活力检测→培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织→愈伤分化→再生植株取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、愈伤组织或悬浮细胞预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化1 原生质体的分离叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。
细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法（1）机械法①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状；②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。
（缺点）获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。
植物原生质体的制备及融合
显微镜、低速台式离心机、水浴锅；直式漏斗、离心管；眼科镊等
▪ 试剂
洗涤液 混合酶液 PEG溶液 高钙高pH溶液 20%蔗糖溶液等
原生质体的分离制备
▪ 取新鲜花瓣，以蒸馏水清洗，用吸水纸吸干多余水分。 ▪ 用尖头镊剥取材料的下表皮（带有红色的叶肉细胞），将
下表皮创面朝下浸在酶液中，27℃酶解1hr（振荡）。
▪ 所用小平皿、离心管、漏斗、小镊子等自来水 冲洗并以蒸馏水洗干净后，控干
▪ 托盘及其中的其他物品用自来水冲洗干净
▪ 实验中
植物原生质体的 制备及融合
背景
▪ 原生质体分离 ▪ 细胞融合
▪ 病毒诱导融合（动物细胞） ▪ PEG诱导融合 ▪ 电融合
背景
▪ 融合过程
▪ 细胞的接触 ▪ 细胞质膜的融合 ▪ 细胞质的融合 ▪ 遗传物质的选择（异核体的核融合）
应用
▪ 杂交育种
▪ 单克隆抗体技术
实验器材、试剂等
▪ 材料
剑兰（唐菖蒲）花瓣
原生质体的分离制备
镜检，0 μm
50 μm
原生质体的分离制备
▪ 过滤，以去除大块组织。 ▪ 700rpm离心5分钟，弃上清。 ▪ 加入3mL洗涤液吹打均匀，700rpm离心5分钟，弃上清。 ▪ 加入少量洗涤液（一两百微升即可或由原生质体的量来决
定），悬浮原生质体。 ▪ 镜检，如果碎片较多，可采取蔗糖漂浮方法去除碎片。
▪ 比较分析实验组与对照组之间的差异及 原因
▪ 思考：原生质体制备和融合过程中各种 试剂的渗透压？
提醒
▪ 蔗糖漂浮
▪ 务必留下足够进行融合的细胞悬液 ▪ 使用5ml离心管 ▪ 配平
▪ 35mm dish用于酶解，60mm dish用于融合观察
原生质体培养与融合
飘浮法
采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯 化方法。 优点： 可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 用不同浓度和不同离心速度分次 漂浮的方法。
影响原生质体培养的因素
培养条件
温度，光照
植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
供体细胞的生长同步性
原生质体再生过程
原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质 体在适当的培养方法和良好的培养条件下， 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细 胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分 化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生
胡萝卜培养 6d 细胞
8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体
矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d
10
马铃薯子叶 48h 46.1 马铃薯花粉 2h
2周后形成20~25 个细胞的细胞团 15d形成细胞团 28d愈伤组织 9~10d形成16个 细胞的细胞团 15d形成细胞团
影响原生质体培养的因素
原生质体的活力
原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生
质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能 分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率 常显著提高。
渗透压稳定剂 培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 培养基为基础 改进的。
渗透压稳定剂
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取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、 愈伤组织或悬浮细胞
预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、 和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化
1 原生质体的分离
原生质培养首先在烟草上获得成功Nagata&Takebe（1971），到1993 有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。
2、原生质体培养的意义
① 比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸 酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采 用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
界面法的优点：可收集到较大的纯净的原生质体， 同时避免收集过程中原生质体的破损。
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
原生质体分离纯化流程图
三、原生质体培养
1.原生质体的培养方法 (1) 固体培养法（平板法）：
将原生质体均匀固定于琼脂培养基上进行培养的方法。首先把制 备好的融化的琼脂培养基冷却至40℃，与等量原生质体悬浮液共同倒 入培养皿中，迅速而微轻摇动，使原生质体均匀铺在琼脂之中。 优点：
(2) 悬浮法（漂浮法）
原理：采用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后， 使原生质体漂浮于溶液表面，而残渣碎屑沉淀于底部。
过程：加0.5M蔗糖溶液，原生质体浮于表面，取出浮于表面 的原生质体，反复操作。
这种方法可收集较纯的原生质体，原生质大小较一致，但 获得原生质数量少，而且高渗溶液对原生质体有害，收集 较沉降法困难。
使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对 单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。
第四章 原生质体培养与细胞融合
第一节 原生质体培养
一、 原生质体的培养概况
1、概念：
植物的原生质体(Protoplast)指除去细胞壁以后的裸露细胞。 原生质体培养（Protoplast culture）是将植物细胞游离成原生质体， 在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成 细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完 整植株的过程。 原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便 于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍 可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。 细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法 （1）机械法： ①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁 分离（细胞失水），原生质体收缩成球状； ②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
步骤：取材→预处理→酶液配制（过滤灭菌，包含果胶酶和 纤维素酶及渗透调节剂和质膜稳定剂） →酶处理(10ml/g， 抽真空，摇床，40r/s，26℃ 2～8h) →过滤离心。
优点：可以获得大量的原生质体，适用于几乎所有植物和器 官，双子叶植物叶肉细胞比单子叶更易分离。
缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶及酚类物 质，会影响原生质体的活力。
(5) 渗透压的稳定剂种类:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖 等，如甘露醇一般为0.5-0.7M。
(6) 原生质膜稳定剂 (CaCl2：0.1mM,葡聚糖硫酸钾 0.20.3%；葡聚糖硫酸钾0.2%-0.3%)
(7) pH影响 5.4-6.0
酶解时间
酶浓度
酶解温度
3 原生质体的纯化（净化）
指将酶解后的溶液中的原生质体与组织残渣（如去未脱 壁的细胞、细胞碎片）分开的过程。
(1) 沉降法
原理：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中进行过 滤离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。
过程：首先将含有原生质体与酶混合液过网筛（44～ 169μm孔径），除去叶脉大组织块。然后低速离心 （900～4500r/min）收集沉于底部的完整的原生质体。
一般叶肉原生质体均采用沉降法，优点是采集方便，缺 点是不能完全除去少量的细胞和破碎的原生质体。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。 但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用（优点）。
液 泡
细胞溶质 质膜
植物细胞壁胞间层 初Fra bibliotek壁 次生壁（2）酶解法 采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。 常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、 蜗牛酶和胼胝质酶（成熟花粉粒、四分体小孢子）等。 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分 离原生质体的可能性。
2 影响原生质体数量与活力的因素
(1) 光:一般在黑暗静止条件下进行.
(2) 温度:酶解温度25-30℃,兼顾原生质稳定性及酶活性.
(3) 时间:几小时到几十小时,太长影响原生质活力,一般小 于24小时,如烟草叶片保温24小时叶肉细胞解离完毕.
(4) 细胞壁降解酶的种类和组合:一般植物细胞使用(纤维素 酶0.7-1%,果胶酶0.5-1%),花粉细胞和四分体小孢子,可 使用蜗牛酶和胼胝质酶。
(3) 界面法
原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处 于两液相的界面之中。
在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500 mmol/L蔗糖，一层溶于培养基中的140 mmol/L蔗糖和360 mmol/L山梨醇，最后一层加入悬浮于酶溶液中的原生质 体（含有300 mmol/L山梨醇、100 mmol/L CaCl2）,轻轻 混合，经5℃, 400g条件下，离心5min，完整的原生质体 悬浮在两层液体之间，叶绿体和破碎原生质体均在下面 液体中，取出界面中的原生质体，按上述方法再重复进 行一次。
② 便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物 界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本 科植物，高光效植物，高抗植物）
③ 原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植 物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物 合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等
3、原生质体培养程序