遗传学原生质体培养及融合配色
细胞工程___第四章原生质体与细胞融合用
五.原生质体鉴定
1)低渗爆破法：无壁吸水向外膨胀直至胀破，是无形 的。有部分细胞壁，则原生质体从破碎后留下的残 迹仍保持半圆形的细胞壁。
2)荧光染色法:将原生质体放大离心管中，加入0·7mo l/L甘露醇配置的0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染 色5-10Min ，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光 显微镜下观察(波长3600-4400A0)。绿色光显示纤维 素的存在，发出红色光的没有纤维素的真正的原生 质体。
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质 体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细胞分裂等。
常用质膜稳定剂有：
葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl•2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid 2-( N-吗啉代)乙磺酸
作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调 节pH值。
(4)氧电极法:有活力的原生质体在光照下会进行光合 作用而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸而 耗氧。因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来原 生质体是否具有活力。
第二节 细胞融合
一、细胞融合的概念
细胞融合，也称原生质体融合，或体细 胞杂交。是指两种异缘（种间、属间）原生 质体，在诱导剂诱发下或电冲击下，发生膜 融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞， 进一步发育成杂种植物体。
甘露醇
0.6 M
CaCl•2H2O
0.5%
MES
5.0 mM
pH
5.8
6、原生质体的游离与纯化(以叶为例)
1）、原生质体的游离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无 菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表 皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉， 留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
原生质体无菌分离培养与融合
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4） 和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。 加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
原生质体融合的操作流程和程序
原生质体融合的操作流程和程序下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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原生质体融合育种
（二）原生质体融合的影响因素 １、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合 钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线
热 药物
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种 三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒
第一节 微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等
第二节 微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并产生重组子的过程。
细菌原生质体融合步骤
细菌原生质体融合实验步骤一、实验目的了解原生质体融合技术的原理。
学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。
二、实验原理原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。
1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。
由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。
(一)、原生质体融合的优点(1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。
由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。
(2)、基因重组频率高，重组类型多。
原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。
原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。
(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。
(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。
(二)、原生质体融合步骤(1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。
(2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。
(3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。
聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。
在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。
(4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。
(5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。
(6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。
14.4原生质体融合的方法
原生质体融合的方法原生质体融合又叫体细胞杂交，是指将不同来源的植物原生质体进行融合，再经培养获得杂种植株的过程。
一、盐类融合法1909年，Kuster用低渗NaNO溶液引起原3生质体的融合。
融合方法获得1972年，Carlson等用NaNO3了第一株体细胞杂种，即烟草与其野生种间体细胞杂种（粉蓝烟草与郎氏烟草）。
原理：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NaCl、CaCl2等。
通过改变细胞膜表面的理化特性，增加细胞的内吞作用，而实现融合。
应用最早的融合法，但由于异核体形成率低，且对细胞有毒害，目前已不太应用。
二、高钙-高pH融合法1973年，Keller和Melchers用强碱性的高浓度钙离子（5mM CaCl2·2H2O，pH10.5）溶液融合烟草叶肉原生质体，获得种内及种间体细胞杂种。
原理：CaCl 2•2H 2O 0.05mol /L ，pH9.5-10.5，可使质膜表面特性发生改变，而发生融合。
异核体形成率有所提高，但对细胞有一定毒害，目前已不太应用。
三、聚乙二醇（PEG）融合法1974年，Kao和Michaylub用聚乙二醇(PEG)作融合剂，明显提高了异核体的形成率，且对细胞的毒性很低。
因此，该方法迅速展开。
1978年，用PEG法，成功获得了西红柿与马铃薯第一个属间体细胞杂种。
薯番茄或番茄薯PEG融合原理：短时间内，细胞质膜粘连，形成分子桥，进行融合。
四、PEG 、高钙-高pH 相结合的融合法PEG 融合液PEG600030%Ca(NO 3)2•4H 2O0.1M 甘露醇0.4-0.6M pH 10.0五、电融合法开发较晚，1979年，Senda发现电融合方法。
由于对细胞无毒害，已广泛应用。
电融合必须有融合仪和融合板。
电融合仪融合板两个电极原生质体电融合的基本程序①细胞膜的接触：两极通以交变电流，使原生质体沿电场方向排列成串珠状；②膜的击穿：再给以瞬间的高强度电脉冲，使原生质体膜局部受损失而导致融合。
遗传学ppt课件第4章 原生质体培养及融合配色
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
植物原生质体的制备及融合
显微镜、低速台式离心机、水浴锅；直式漏斗、离心管；眼科镊等
▪ 试剂
洗涤液 混合酶液 PEG溶液 高钙高pH溶液 20%蔗糖溶液等
原生质体的分离制备
▪ 取新鲜花瓣，以蒸馏水清洗，用吸水纸吸干多余水分。 ▪ 用尖头镊剥取材料的下表皮（带有红色的叶肉细胞），将
下表皮创面朝下浸在酶液中，27℃酶解1hr（振荡）。
▪ 所用小平皿、离心管、漏斗、小镊子等自来水 冲洗并以蒸馏水洗干净后，控干
▪ 托盘及其中的其他物品用自来水冲洗干净
▪ 实验中
植物原生质体的 制备及融合
背景
▪ 原生质体分离 ▪ 细胞融合
▪ 病毒诱导融合（动物细胞） ▪ PEG诱导融合 ▪ 电融合
背景
▪ 融合过程
▪ 细胞的接触 ▪ 细胞质膜的融合 ▪ 细胞质的融合 ▪ 遗传物质的选择（异核体的核融合）
应用
▪ 杂交育种
▪ 单克隆抗体技术
实验器材、试剂等
▪ 材料
剑兰（唐菖蒲）花瓣
原生质体的分离制备
镜检，0 μm
50 μm
原生质体的分离制备
▪ 过滤，以去除大块组织。 ▪ 700rpm离心5分钟，弃上清。 ▪ 加入3mL洗涤液吹打均匀，700rpm离心5分钟，弃上清。 ▪ 加入少量洗涤液（一两百微升即可或由原生质体的量来决
定），悬浮原生质体。 ▪ 镜检，如果碎片较多，可采取蔗糖漂浮方法去除碎片。
▪ 比较分析实验组与对照组之间的差异及 原因
▪ 思考：原生质体制备和融合过程中各种 试剂的渗透压？
提醒
▪ 蔗糖漂浮
▪ 务必留下足够进行融合的细胞悬液 ▪ 使用5ml离心管 ▪ 配平
▪ 35mm dish用于酶解，60mm dish用于融合观察
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4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生 质体的稳定性，保持原生质体的活性，促进细胞壁 再生及细胞分裂等。
➢ 1971年，Takebe 等首次将烟草叶肉原生质体培 养成完整植株。
➢ 1985年，Fujimura 等获得第一例禾谷类作物，即 水稻原生质体的再生植株。
➢ 1986年，Spangenberg 等由甘蓝型油菜的单个 原生质体培养得到再生植株。（白菜型、芥菜型和甘蓝型 ）
BACK
随后，其它植物上也逐渐有原生质体再 生植株成功的报道，包括粮食作物、油料 作物、经济作物和一些药用植物。
3、利用原生质体培养中广泛发生的变异， 选育新品种。
4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可 以进行亚细胞水平的操作研究。如叶绿体、 线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄 取细胞器后进行培养，获得再生植株，根 据再生植株的表现，即可进行遗传分析， 研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
Hemicellulase H-2125 Sigma
Rhozyme HP-150
USA
4）蜗牛酶：分离孢粉素、胼胝质
各公司生产的酶的效果不尽 相同，使用时应予以注意。必须 控制好浓度、温度和处理时间， 例如：
Cellulase Onzuka R-10 Japan Cellulase Onzuka RS Japan （两种纤维素酶的活性大约差10倍）
Plants
Pre-treatment enzymolysis
Suspension cells
Purification Vigour test
Cuture and regeneration
三、原生质体的分离
1、取材：材料的类别对原生质体培养很重要
可采用离体培养植株、田间或温室植 株，利用其叶片、叶柄、茎段等均可分离原 生质体，但一定要选用幼嫩部分。
近年来，为了提高原生质体再生的频 率，最常用的是以下几类材料：
➢ 无菌试管苗的叶片 ➢ 上胚轴和子叶 ➢ 处于对数生长期的细胞悬浮系
2、酶的种类和作用
原生质体分离的效果主要取决于酶的 种类和浓度。
目前主要使用的酶有：
果胶酶类 纤维素酶类 半纤维素酶类和崩溃酶等 有时还会使用蜗牛酶。
1）果胶酶类
EA-867
中科院上海植生所
Cellulase Onzuka R-10 Japan
Cellulase Onzuka RS Japan（价格昂贵）
Meicelase P
Japan
Cellulase
USA
Driselase（崩溃酶，具多种活性） Japan
3）半纤维素酶
用于降解细胞壁中的半纤维 素，主要商品制剂有：
据1993统计，已有49个科，146个属的 320多种植物，都可经原生质体培养得到 再生植株。虽然大体上仍以农作物和经济 作物为主，但已从一年植物生向多年生植 物、从草本植物向木本植物、从高等植物 向低等植物扩展。
二、原生质体培养的意义
1、为细胞融合提供直接方法
2、为遗传转化提供新的途径
原生质体没有细胞壁，可以直接吸收 外源DNA，或通过电击穿孔法、PEG法等 方法，将基因导入原生质体，实现遗传转 化。
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
从根霉或黑曲霉中提取，能降解中胶层，使细 胞从组织中释放出来。
常用的果胶酶商品制剂：
Pectinase
Sigma
Macerozyme R-10 Japan
Pectolyase Y-23 Japan (价格昂贵)
2）纤维素酶类
从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂， 其作用是降解细胞壁中的纤维素，使原生质 体释放出来。常用的商品酶制剂：
细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
第一节 原生质须分离原生质体， 即去除细胞壁，得到完整的裸露细胞。
植物原生质体培养研究中几个重要的成就： ➢ 1880年，Hanstein首次提出原生质体(protoplast)
22h 3-5h
3、酶液的渗透压
原生质体的一个基本属性是渗透破 损性。因此，酶液、原生质体洗涤液及 培养基中都要加入适量的渗透压稳定剂。 常用的稳定剂分为两类：
1）糖溶液系统
2）盐溶液系统
1）糖溶液系统 多用甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，
目前广泛使用的是甘露醇和山梨醇。蔗糖因 对原生质体培养不利，很少使用。
➢ 小原生质体(miniprotoplast)：也称核质体 (nuclearplast)，具备完整细胞核，但只含有部分 细胞质。
➢ 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条 染色体的情况。
➢ 胞质体（cytoplast）：不含细胞核，只有细胞质。
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。 是指将植物的不同种、属甚至科间的原生质体， 通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使 其再生成为杂种植株的技术。
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
率极低，无法进行培养和再生。
甜菜 洋葱 萝卜 黄瓜
➢ 1960年，英国诺丁汉大学的Cocking教授首次使 用纤维素酶酶解法处理番茄的幼根，获得了大量 具有高度活性的原生质体。
➢ 1968年后，由于纤维素酶、离析酶投入了市场， 使原生质体分离技术日益发展和成熟，原生质体 培养也开始成为热门研究领域。
也可以通过细胞器的转移，使物种获 得相应的性状。
5、 用于理论研究
如细胞壁的生物合成、原生质膜的结 构与功能、激素的作用机理、病毒的侵染 机理等。
原生质体研究已在细胞生物学、生 物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒 学、育种学等领域得到广泛应用。
6、用于种质资源保存
A scheme of plant protoplast