第六章 原生质体培养(4 学时)
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细胞工程第六章 植物原生质体培养和体细胞杂交精品文档
缺点及补救措施：对离心力要求比较严格， 掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不 同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。
飘浮法
缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不好，原
生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同 离心速度分次漂浮的方法。
3、界面法
又称不连续梯度法，采用两种 密度不同的溶液形成不连续梯度， 通过离心使原生质体与破损细胞 分别处于不同液相中，从而纯化 原生质体的方法。
（3）崩溃酶：为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶 活性，主要用于一些细胞壁难降解的植物。
（4）蜗牛酶：主要用于花粉母细胞、四分体、小包子或 较老组织的原生质体分离。
（5）胼胝质酶：主要用于胼胝质的分解，常与蜗牛酶一 起用于成熟花粉粒、四分体、小孢子的原生质体分离。
4、原生质体的分离 （1）分离方法
第六章 植物原生质体培养和体 细胞杂交
主要内容： 第一节 原生质体的分离和纯化 第二节 原生质体培养 第三节 植物体细胞杂交
学习的目标与要求： 掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解
原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定 方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生质体 融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种 植株的鉴定方法。
植物细胞的融合过程
1978年德国科学家梅 歇尔斯等人把马铃薯 (potato)和番茄(tomato) 的原生质体融合获得了体 细胞杂种“泡马豆” （pomato)
一、原生质体的分离和纯化
（一）原生质体的分离 1、材料来源
植物幼嫩的叶片 无菌实生苗的子叶和下胚轴 外植体来源的愈伤组织和悬浮细胞系 花粉细胞
B、 酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混 合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细 胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方 法。 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维 素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶 酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。
第6章植物原生质体培养及体细胞杂交
胼胝质酶：
主要用于分离花粉小孢子的原生质体。
蜗牛酶：
从蜗牛胃液中分离的酶的粗制剂，含多种解离酶，对孢 粉素、木质素有一定的分解能力，用于分离花粉母细胞、 四分体细胞或从较老的组织分离原生质体。
崩溃酶：
是一种粗制酶，同时具有纤维素酶和果胶酶等多种酶的活 性，在与果胶酶混合使用时，对分离培养细胞及根尖细胞 有加速解离的效果。
在低速下离心后原生质体沉到管底,其余细胞碎 片等物多数漂浮在溶液中。
特点：简单方便，丢失少，但纯度不够高。
3.界面法（梯度离心法）
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大 于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密 度，经离心后使完整无损的原生质体处于两种溶液的界面 之间，而细胞碎片等杂质沉于管底，高度净化完整原生质 体可在这两相系统的界面上收集到。
酶液的配制及pH值
酶液的配制： 按已确定使用的酶和稳定剂的量称取酶和各种
稳定剂,并把它们逐步溶解，配制成酶液之后，酶 液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤灭菌后备用。 酶液的pH值：
分离原生质体时一般将酶液的pH调节在5～6之 间。
酶浓度和酶解时间
酶浓度： 纤维素酶：一般为0.5～5％ 果胶酶：一般为0.1％～1％ 蜗牛酶和胼胝质酶：一般为0.5～2.0％
温度：一般25～30℃。 湿度：100%。
4、原生质体发育和植株再生
10h以上
再生细胞壁
植株再生
诱导器官发生 诱导形成胚状体
圆变为 椭圆形
荧光增白剂 （卡氏白)
愈伤组织
第一次分裂 第二次分裂
肉眼可见的细胞团
第N次分裂
2~3周，植板率
小细胞团
5. 原生质体培养过程中的管理
主要用于分离花粉小孢子的原生质体。
蜗牛酶：
从蜗牛胃液中分离的酶的粗制剂，含多种解离酶，对孢 粉素、木质素有一定的分解能力，用于分离花粉母细胞、 四分体细胞或从较老的组织分离原生质体。
崩溃酶：
是一种粗制酶，同时具有纤维素酶和果胶酶等多种酶的活 性，在与果胶酶混合使用时，对分离培养细胞及根尖细胞 有加速解离的效果。
在低速下离心后原生质体沉到管底,其余细胞碎 片等物多数漂浮在溶液中。
特点：简单方便，丢失少，但纯度不够高。
3.界面法（梯度离心法）
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大 于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密 度，经离心后使完整无损的原生质体处于两种溶液的界面 之间，而细胞碎片等杂质沉于管底，高度净化完整原生质 体可在这两相系统的界面上收集到。
酶液的配制及pH值
酶液的配制： 按已确定使用的酶和稳定剂的量称取酶和各种
稳定剂,并把它们逐步溶解，配制成酶液之后，酶 液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤灭菌后备用。 酶液的pH值：
分离原生质体时一般将酶液的pH调节在5～6之 间。
酶浓度和酶解时间
酶浓度： 纤维素酶：一般为0.5～5％ 果胶酶：一般为0.1％～1％ 蜗牛酶和胼胝质酶：一般为0.5～2.0％
温度：一般25～30℃。 湿度：100%。
4、原生质体发育和植株再生
10h以上
再生细胞壁
植株再生
诱导器官发生 诱导形成胚状体
圆变为 椭圆形
荧光增白剂 （卡氏白)
愈伤组织
第一次分裂 第二次分裂
肉眼可见的细胞团
第N次分裂
2~3周，植板率
小细胞团
5. 原生质体培养过程中的管理
植物生物技术：第6章 原生质体培养
不被染色，死亡的被染上色。 • 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显
微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。
第2节、原生质体分离及纯化
四、影响原生质体分离的因素
➢ 从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质 体
➢ 但对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、 最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响
➢ 多数情况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及扩散 入原生质体的速度很慢的缘故，来保证一个稳定的渗透压
第2节、原生质体分离及纯化
➢ 叶肉细胞是常用的材料, 叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展 开的幼嫩叶片
➢ 愈伤组织或悬浮细胞，避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控 制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒
A
B
C
第2节、原生质体分离及纯化
2、酶液及酶解方法
➢ 用来分离植物原生质体的酶制剂 ➢ 纤维素酶、半纤维素酶：降解构成细胞壁的纤维素 ➢ 果胶酶：降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细 胞分开 ➢ 酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶 ➢ 离析酶（果胶酶）
➢ 纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶在0.1%-1%，但也有例外
第2节、原生质体分离及纯化
3.分离培养基
➢ 常用的配制分3 离渗原透生压质：体原酶生液质的体溶操 液作 以需 及要 洗涤在原一生定质渗体透的压溶存液在为下进行，
CPW液
分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原生质体的溶液为 盐成分为：
➢ CPW盐成分为
（3）分离原生质体
方法有二：
两步分离法
一步分离法
第2节、原生质体分离及纯化
微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。
第2节、原生质体分离及纯化
四、影响原生质体分离的因素
➢ 从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质 体
➢ 但对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、 最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响
➢ 多数情况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及扩散 入原生质体的速度很慢的缘故，来保证一个稳定的渗透压
第2节、原生质体分离及纯化
➢ 叶肉细胞是常用的材料, 叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展 开的幼嫩叶片
➢ 愈伤组织或悬浮细胞，避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控 制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒
A
B
C
第2节、原生质体分离及纯化
2、酶液及酶解方法
➢ 用来分离植物原生质体的酶制剂 ➢ 纤维素酶、半纤维素酶：降解构成细胞壁的纤维素 ➢ 果胶酶：降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细 胞分开 ➢ 酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶 ➢ 离析酶（果胶酶）
➢ 纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶在0.1%-1%，但也有例外
第2节、原生质体分离及纯化
3.分离培养基
➢ 常用的配制分3 离渗原透生压质：体原酶生液质的体溶操 液作 以需 及要 洗涤在原一生定质渗体透的压溶存液在为下进行，
CPW液
分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原生质体的溶液为 盐成分为：
➢ CPW盐成分为
（3）分离原生质体
方法有二：
两步分离法
一步分离法
第2节、原生质体分离及纯化
第六章 原生质体培养
为保持释放出的原生质体的活力和膜稳定性，要 求酶液满足以下条件： 1、酶液渗透压必须与处理细胞的渗透压相似 同一种植物，子叶和下胚轴游离原生质体时需要的渗透 压最高，愈伤次之，胚性悬浮细胞要求最低。 可用原生质体培养基做溶剂，其渗透压合适。 2、酶液添加CaCl2·2H2O, KH2PO4和葡聚糖硫酸钾以提 高原生质体膜的稳定性。还可加入AgNO3减少酶解产 生的乙烯，加入过氧化物歧化酶减轻O2‾自由基对细胞 膜损伤，从而提高原生质体植板率。 3、MES（吗啉乙基磺酸）作为pH缓冲调节剂对于保持 酶解物的酸碱环境起缓冲作用，增加原生质体的释放 量和稳定性。 4、酶溶液最适pH范围为5.4~5.8 酶液配好后，过滤灭菌备用。
原生质体制备
材料和酶液体积比：1：10 酶解时间因材料而异 酶解温度25～30℃ 黑暗或弱光下酶解 静置或摇床上酶解
原生质体活力检测方法
1、形态：来自叶肉细胞的活原生质体应该绿色，叶绿体 及细胞内小颗粒在不停运动；来自愈伤或悬浮细胞的 原生质体，可根据细胞质内原生质环流速度或颗粒状 内含物布朗运动快慢来判断。 2、染色：1％酚番红或伊文斯兰染色检测，活的原生质 体不着色，死的立即染色。 3、FDA（Fluorescein diacetate，荧光素双醋酸盐） 活体 染色：FDA能透过原生质体膜，在内酯酶作用下水解 为不能排出的，累积在质膜内的荧光素。在荧光显微 镜下观察时，凡发淡绿荧光的都是活的原生质体。 4、CFW（荧光增白剂）染色法：新细胞壁再生产生绿 色荧光
卵细胞的分离
※可先分离胚囊，从中分离卵细胞 ※也可直接从胚珠中分离卵细胞 ※周嫦和杨弘远首先建立胚囊分离技术－ 酶解振荡法。 ※生活胚囊的分离方法：胚珠放在酶液中， 酶液：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、 蜗牛酶或崩溃酶。 ※后发展为酶解－渗透压冲击法
原生质体制备
材料和酶液体积比：1：10 酶解时间因材料而异 酶解温度25～30℃ 黑暗或弱光下酶解 静置或摇床上酶解
原生质体活力检测方法
1、形态：来自叶肉细胞的活原生质体应该绿色，叶绿体 及细胞内小颗粒在不停运动；来自愈伤或悬浮细胞的 原生质体，可根据细胞质内原生质环流速度或颗粒状 内含物布朗运动快慢来判断。 2、染色：1％酚番红或伊文斯兰染色检测，活的原生质 体不着色，死的立即染色。 3、FDA（Fluorescein diacetate，荧光素双醋酸盐） 活体 染色：FDA能透过原生质体膜，在内酯酶作用下水解 为不能排出的，累积在质膜内的荧光素。在荧光显微 镜下观察时，凡发淡绿荧光的都是活的原生质体。 4、CFW（荧光增白剂）染色法：新细胞壁再生产生绿 色荧光
卵细胞的分离
※可先分离胚囊，从中分离卵细胞 ※也可直接从胚珠中分离卵细胞 ※周嫦和杨弘远首先建立胚囊分离技术－ 酶解振荡法。 ※生活胚囊的分离方法：胚珠放在酶液中， 酶液：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、 蜗牛酶或崩溃酶。 ※后发展为酶解－渗透压冲击法
4.原生质体培养与细胞融合(植物组织培养)
原生质体培养与细胞融合第一节原生质体培养一、原生质体的培养概况1、概念：植物的原生质体：指除去细胞壁以后的裸露细胞。
原生质体培养：是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功。
2、原生质体培养的意义①比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
②便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本科植物，高光效植物，高抗植物）③原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等3、原生质体培养程序取材→预处理→分离→纯化→活力检测→培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织→愈伤分化→再生植株取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、愈伤组织或悬浮细胞预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化1 原生质体的分离叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。
细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法（1）机械法①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状；②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。
（缺点）获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。
第六章 原生质体培养资料
第二节 原生质体分离
1、材料选择及预处理 双子叶植物的幼叶、子叶、根和下胚轴的 切段通常被用来制备原生质体 禾谷类植物，疏松易碎的愈伤或悬浮培养 的细胞是制备原生质体的理想材料 预处理目的：改变细胞和细胞壁的生理状 态，增加细胞膜的强度，提高酶解效率， 减少原生质体损有活力，并能继续分裂。 2、叶片萎蔫处理 有利于撕除下表皮和原生质体分离 3、叶片预培养 叶片撕掉下表皮，在诱导愈伤的培养基上预培养 一段时间，再酶解脱壁，原生质体分裂频率提高很多。 4、预先质壁分离处理 先在糖溶液中质壁分离，再酶解去壁，可加快原 生质体释放，提高其活力。 5、胚性愈伤和悬浮细胞系的预培养 新鲜培养基中预培养一段时间再分离原生质体， 质量好，分裂频率高。
制备原生质体的酶类
纤维素酶：自绿色木霉提取 果胶酶：自根霉提取，将植物组织解析为单个细胞 崩溃酶：同时具有纤维素酶和果胶酶活性，用于从 根尖细胞和培养细胞分离原生质体 半纤维素酶 蜗牛酶：对孢粉素和木质素均有一定分解能力，可 从花粉母细胞、四分体、小孢子或较老的植物组 织分离原生质体
酶溶液的配制
精细胞分离 ※三细胞花粉：禾本科与十字花科植物，花粉中含有
※二细胞花粉：茄科和百合科植物，花粉中有一个营
※三细胞花粉，可以直接从成熟花粉中分离精子；二
分离原生质体的方法
1、机械法 叶肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使细胞 发生质壁分离，原生质体收缩成球形，完全脱 离细胞壁。剪碎组织，可释放原生质体。 缺点：产量低，无法从分生组织分离原生质体。 2、酶法（在第二节详述） 1960，Cocking最先采用
原生质体培养的成果
1971，Nagata和Takebe从培养的烟草叶肉细 胞原生质体获得完整的再生植株 我国学者在50多种植物上首先获得原生质体 再生植株，并得到多种植物的细胞杂种 中科院植物所、遗传所、上海植物生理研究 所做出了重要贡献。
原生质体培养
酶解后的混合物包括：解离酶液中，有原生质体，有破 碎细胞的细胞器等，也有未解离的组织或细胞。而培养 只要干净的原生质体。所以要进行纯化。
净化的方法： A、清除较大碎屑：酶解后的混合物穿过一个镍丝网（50-
70um）
B、清除较小的物质：
1.沉降法 2.漂浮法 3.界面法
1.沉降法
镍丝网滤出液 置于离心管（离心2-3分钟，原生质 体沉于离心管底部，残液碎屑悬浮于上清液） 弃去 上清液 再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中（反 复3次）
酶液pH值：4.7-5.8，
酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。 用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5．0时， 原 生质体产生得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。 当pH值提高到6．0时，最初原生质体却产生少，但与pH 值为5．0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。 –高 活性低 –低 原生质体损坏多 –纤维素酶，p H5.4，果胶酶5.8，两种混合5.4~5.6
Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan
半纤维素酶
Rhozyme HP-150 黑曲酶 Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA
Hemicellulase 63178,USA
原生质体的培养
供体植物的选择
原生质体的培养基
培养条件
培养方法
细胞壁的形成
细胞分裂与愈伤组织形成
植株的再生
影响原生质体培养的因素
一、原生质体的培养基
1．在多数情况下原生质体所用的基本培养基为NT，KM， DPD、MS、B5
2．无机盐 大量元素浓度；（一般要低于愈伤组织培养基） NO3－和NH4+的比例；（降低NH4+ 、NO3－ 增加有机氮） Ca2+浓度（增加，适当的浓度，能提高分裂细胞的百分数） 3．有机成分 维生素、氨基酸、糖（常用葡萄糖，过滤灭菌）及糖醇等，
净化的方法： A、清除较大碎屑：酶解后的混合物穿过一个镍丝网（50-
70um）
B、清除较小的物质：
1.沉降法 2.漂浮法 3.界面法
1.沉降法
镍丝网滤出液 置于离心管（离心2-3分钟，原生质 体沉于离心管底部，残液碎屑悬浮于上清液） 弃去 上清液 再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中（反 复3次）
酶液pH值：4.7-5.8，
酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。 用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5．0时， 原 生质体产生得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。 当pH值提高到6．0时，最初原生质体却产生少，但与pH 值为5．0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。 –高 活性低 –低 原生质体损坏多 –纤维素酶，p H5.4，果胶酶5.8，两种混合5.4~5.6
Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan
半纤维素酶
Rhozyme HP-150 黑曲酶 Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA
Hemicellulase 63178,USA
原生质体的培养
供体植物的选择
原生质体的培养基
培养条件
培养方法
细胞壁的形成
细胞分裂与愈伤组织形成
植株的再生
影响原生质体培养的因素
一、原生质体的培养基
1．在多数情况下原生质体所用的基本培养基为NT，KM， DPD、MS、B5
2．无机盐 大量元素浓度；（一般要低于愈伤组织培养基） NO3－和NH4+的比例；（降低NH4+ 、NO3－ 增加有机氮） Ca2+浓度（增加，适当的浓度，能提高分裂细胞的百分数） 3．有机成分 维生素、氨基酸、糖（常用葡萄糖，过滤灭菌）及糖醇等，
(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
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(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
23
二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
23
二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
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Cell differentiation
Somatic genetics
Cell fusion
Regenerative ability Organogenesis Protoplast system
Ontogenic processes
Cell physioloy
Organella, DNA uptake
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形 成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为 微小原生质体(miniprotoplast)。
2．无机盐 大量元素浓度； NO3－和 NH4+的比例； Ca2+浓度
3．有机成分 维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。
4．激素 常用的激素：NAA、IAA、BA 与 2,4-D
5．pH 值
四、 原生质体培养方法
液体浅层培养
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学
文本教案(第六章)
主讲教师：柳俊博士、教授
第二节、原生质体的制备
1、 用于分离原生质体的材料准备
无菌试管苗叶片 上胚轴和子叶 培养细胞
2、 酶处理
原生质体分离常用的商品酶
酶 纤维素酶类 onozuka R–10 Cellulysin Driselase
来源
生产厂家
绿色木霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
Dudits 等（1991）用苜宿(Medicago sativa)不同基因型做了较深入的研究，认为有某个基 因型在离体培养时难以形成细胞胚。但是，如果将对激素调节有作用的发根农杆菌的 rolB 和 rolC 基因引入并表达，就可能促使其体细胞胚形成。
二、原生质体的来源
供体材料体类型 供体细胞的分化程度 供体细胞的生长同步性
固体培养 液体－固体双层培养 琼脂糖珠培养
五、 愈伤组织形成和植株再生
细胞分裂与细胞壁再生 愈伤组织形成 愈伤组织分化 植株再生
文本教案(第六章)
主讲教师：柳俊博士、教授
第四节、影响原生质体培养的主要因素
一、基因型
较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制的。
目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。
FDA 法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞 内，FDA 被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在 荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。
伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可 以通过细胞被染色与否确定活性。
Cell cloning
A scheme of plant protoplast
Tuber plants
Suspension cells
Epicoty
Pre-treatment enzymolysis Purification Vigour test Cuture and regeneration
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5、 影响原生质体活力的因素
分离材料的生理状态
酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压
分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间
环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
第三节、原生质体培养
一、培养基
1．渗透压 常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。 原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。
2．修复机理
原生质体分离时会丢失一些不同的细胞结构。使原生质体中细胞骨架的组分、结构、方 向发生变化，最常见的是引起细胞极性的改变(Simmond D H., 1991)，同时也会干扰质膜 的蛋白质系统。
原生质体修复其质膜及其中的蛋白质组分的能力，细胞壁再生的能力及细胞骨架的修复 修复和调整能力都对它们能否进一步发育有很大影响。
绿色木霉
Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA
Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan
果胶酶类
Macerozyme R-10 根霉
Pectinase
黑曲霉
Pectolyase Y-23 黑曲霉
Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan
三、起始培养密度与培养基
基本起始密度 培养基激素水平 密度与培养基营养成分完全性
四、原生质体培养中的一些生理问题
1．逆境反应
细胞壁降解酶是一种逆境诱导剂，因此可以产生活化氧引起脂类过氧化，减少细胞流度 同时伴随着细胞膜的渗漏(Ishii H.,1988)。
细胞的逆境反应一般是快速地产生涉及诱发不同代谢途径（例如苯基丙烷途径 phenylpropanoid route）的酶系统，结果形成了植物抗毒素(phyto-alexins)和如木质素一类的结 构多聚物。
通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是 2 个显性基因所决定的(Koornneef M et al.,1987).。Cheng 和 Veilleux(1991)对芙薯(S. Phureja)原生质体的培养能力也做过遗传分析，并证明从原生质体培养到形成愈伤组织是 受 2 个独立位点的显性基因所控制(Cheng et al., 1991)。
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有些逆境反应对原生质体制备和培养是不利的，例如在甜菜原生质体制备时由于某些酶 的活性增强使得形成类脂过氧化物(lipid peroxides)，结果引起原生质膜的氧化损伤。而 对马铃薯原生质体活力的损伤乃是由于乙烯产生所致(Perl Aet al.,1991)。
五、原生质体研究的趋势
低密度和单个原生质体培养； 原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利 用； 单倍配子体如花粉原生质体培养； 计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。
思考题 1．原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念。 2．为什么原生质体要培养在等渗培养基中？ 3．影响原生质体培养的主要因素。 4．原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点。 5．性细胞原生质体的种类、分化途径及应用领域。 6．为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？
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第六章 原生质体培养（4 学时）
教学Байду номын сангаас的与要求：
深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以及培养过 程中渗透压和激素的调控原理与技术。
第一节、原生质体研究概况
一、原生质体的概念
原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。
3．细胞脱分化与细胞分裂
分离的原生质体原来的细胞状态常常会影响脱分化的进行。 细胞在培养初期的一些变化，如液泡消失、细胞体积增加、细胞质变浓，核蛋白体增加
等，与此同时 DNA 开始复制，随后染色质变浓，原生质体脱分化成为类似分生组织状 态的细胞。 原生质体培养初期的细胞分裂至少涉及到以下多个因子：细胞壁的再生、细胞骨架的修 复与调整、原生质体分离时细胞所处的周期（G2 期细胞具有较高的分裂频率）。另 外，细胞壁的再生与 DNA 的合成协调与否也会影响细胞分裂。
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
二、原生质体研究进展
植物原生质体培养研究中几个值得提出重要成就：
1880 年，Hanstein 首次起用原生质体(protoplast)一词。 1960 年，Cocking 首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971 年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1985 年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。 1986 年，Spangenberg et al.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。
半纤维素酶 Rhozyme HP-150 黑曲酶 Hemicellulase 黑曲霉
Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA
酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 酶浓度及酶解时间
酶解时间
3、 原生质体的收集和纯化
酶浓度
酶解温度
飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。
沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用 Percoll 飘浮 一次。
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4、 原生质体活力检测
据统计，目前已有 49 个科，146 个属的 320 多种植物经原生质体培养得到了再生植株 （1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植 物向低等植物扩展。