综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养
8原生质体的分离、培养和融合
酶解液的组成
• 酶的混合液：
纤维素酶（1-2% 浓度）、果胶酶（0.2- 0.5%浓度）等。
• 渗透稳定剂：
促进酶解，保持原生质体的完整性。 甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等， 适宜的浓度为450800 m mol/L。 • 盐类
氯化钙 50 -100m mol/l，磷酸二氢钾(0.7m mol/l)等。
KH2PO4
KNO3 CaCl2.2H2O
27.2
101.0 1480.0
KI
CuSO4.5H2O （PH5.7）。
0.16
0.025
MgSO4.7H2O
246.0
(Cocking和Peberdy,1974)。
2、漂浮法：
利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液做离心液，将经过镍 网初筛的过滤液置于蔗糖溶液的顶部，在100g下离心10分钟， 离心后，碎屑沉淀，纯净的原生质体将出现在蔗糖溶液和原 生质体冲洗液的界面上。 利用移液管将原生质体吸出，转移到另一个离心管中，用冲 洗液冲洗3次。 离心液的蔗糖浓度为20-21%。 3、梯度离心法
有些悬浮培养的细胞，细胞壁难以用目前的酶制剂降 解，可以在培养基中加入生长素、含硫氨基酸、还原剂或 重金属离子培养细胞，有时可以改变细胞壁的组成。 生长素对细胞壁的可塑性和延长是一个重要的影响因 子，含硫氨基酸和还原剂可以影响细胞壁的双硫键，对细 胞壁的降解有利。 经常进行继代培养的细胞、或培养基中蔗糖浓度较低 的悬浮培养细胞，分离原生质体时的得率高，细胞碎片少。
可以容易地获得可育的后代
4、体细胞融合中的不对称杂种 只带有一个亲本的染色体和另一个亲本的部分染色体或基 因的融合后代。 是体细胞融合的主要产物之一
二、融合的方法和技术 原生质体可以自发地发生融合，但融合频率极低，在体细 胞杂交中没有意义。 在体细胞杂交中，通常都是采用物理的和化学的方法人工 诱导产生融合
实验六_植物原生质体分离及融合
原生质融合
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与 水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当 PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使 之粘连。 PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团
原生质体融合的作用：
(1) 可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性 杂交配子不亲合性； (2) 可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种， 且获得的遗传变异范围极广； (3)一次操作可实现两个以上亲本的融合作用 (4) 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种； (5) 可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；
5.沉淀中加入0.16M氯化钙溶液1—2ml于沉淀， 轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自离 心管底部轻轻地加入6—8ml 22%蔗糖溶液， 使之形成界面。 6.静置待原生质体形成一条带时弃去上、下 液及残渣，用吸管收集原生质体。 7.用.0.24M 氯化钙溶液洗涤一次，离心吸取 上清液。 8.沉淀中加入1—2ml.0.16M氯化钙溶液悬于 沉淀，用血球计数板计数，使原生质体密 度为200000个/ml。
实验六
植物原生质体分离及融合
实验目的
了解植物原生质体分离、融合基本原理。
掌握植物原生质体分离、融合基本过程。
实验原理
植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的 意义，它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成 为作物改良的有力工具之一。
植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸
实验五植物原生质体的分离和培养
实验五植物原⽣质体的分离和培养实验四植物原⽣质体的分离和培养实验⽬的掌握植物原⽣质体分离和培养的基本⽅法，并对培养的结果进⾏初步观察。
实验原理原⽣质体是除去细胞壁的裸露细胞。
在适宜的培养条件下，分离的原⽣质体能合成新壁，进⾏细胞分裂，并再⽣成完整植株。
植物的幼嫩叶⽚、⼦叶、下胚轴、未成熟果⾁、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原⽣体的材料来源。
分离愿⽣厦籀萨采⽤酶解法。
其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制⽽成的溶液对细胞壁成分的降解作⽤，⽽使原⽣质体释放出来。
原⽣质体的产率和活⼒与材料来源、⽣理状态、酶液的组麟，以及原⽣质体收集⽅法有关。
酶液通常需要保持较⾼的渗透压，以使原⽣质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。
渗透剂常⽤⽢露醇，⼭梨醇，葡萄糖或蔗糖。
酶液中还应含⼀定量的钙离⼦，来稳定原⽣质膜。
游离出来的原⽣质体可⽤过筛⼀低速离⼼法收集，⽤蔗糖漂浮法纯既，然后进⾏培养。
实验⽤品⼀、材料1.烟草幼苗的叶⽚、或向⽇葵⽆菌苗的叶⽚、⼦叶或下胚轴等。
2.胡萝⼘根切⽚诱导的松软愈伤组织。
⼆、器材超净⼯作台、台式离⼼机或⼿摇离⼼机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、⾎细胞计数板、⽯蜡膜带等。
细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300⽬不锈钢⽹筛及配套的⼩烧杯、解剖⼑、尖头镊⼦、注射器(5、10m1)和12号长针头、带⽪头的刻度移液管(5、10ml，上部管⼝加棉塞)、培养⽫(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、⼤培养⽫、吸⽔纸等、使⽤前需经过灭菌。
三、试剂1. 70％酒精。
2. 0.1％升汞⽔溶液，并滴⼊少许TWeen 80。
3. 灭菌蒸馏⽔。
4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。
5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。
实验十四 原生质体的分离融合
1、取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片 上，静置l0分钟，使原生质体沉淀在载玻片上。 2、在两滴悬液之间加1滴30％PEG液，使3滴淀液 相连，室温下(15℃一20℃)作用5一l0分钟， 在显微镜下观察原生质体粘连情况。
实验原理
而原生质体融合是实现上述目的的一个 极为重要的手段。同种或异种原生质体可在 聚乙二醇(PEG)诱导下产生异核体，实现体细 胞杂交，实现广泛的遗传重组，创造新的生 物类型。
实验原理——酶解分离法
常用的细胞壁降解酶种类：
纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等。
——优点：可获得大量原生质体，几乎所有的植 物及其器官组织都可使用。 ——缺点：酶制剂中均含有蛋白酶、核酸酶、过 氧化物酶等及酚类物质，影响获得的原生质体 的活力。
实验方法 (一)原生质体的分离收集：
5、沉淀中加入0．16M CaCl2·2H20溶液1—2ml于 沉淀，轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自 离心管底部轻轻地加入6—8ml22％蔗糖溶液， 使之形成界面。 6、静置待原生持体形成一条带时弃去上、下液 及残渣，用吸管吸取收集原生质体。
实验方法
(一)原生质体的分离收集：
实验用品
(一)材料：植物叶片（菠菜叶片）
取材容易，易用酶解法分离。
(二)用品：倒置显微镜，离心机，
过滤筛(100目)， 漏斗，烧杯，吸管，长注射针， 注射器(5—10m1)等 。
实验用品
(三)试剂： （1)纤维素酶MCaCl2·2H20和0．1％ MES中，PH调至5．6—6．0。
7、用0.24M CaCl2·2H20溶液洗涤一次，离心， 吸去上清液。 8、沉淀中加入l-2ml O．16M CaCl2·2H20溶液悬 浮沉淀，用血球计数板计数，使原生质体密度 为2×105个／ml。 9、取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体的 纯度和完整性，也可用荧光显微镜检查。
植物原生质体的分离与融合
实验七植物原生质体的分离与融合一、实验目的：1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。
二、实验原理：PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。
三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤：Ι 植物原生质体的分离与纯化1、将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8,去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解0。
5小时。
2、用200目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。
3、在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。
红辣椒800转/分离心5分钟。
加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心，弃上清液。
加1ml 13%CPW洗液悬浮。
4、蔗糖漂浮法去除碎片。
** 蔗糖漂浮方法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面).(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心（镜检决定是否需要离心），离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。
Ⅱ细胞融合1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。
原生质体培养与融合
飘浮法
采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯 化方法。 优点： 可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 用不同浓度和不同离心速度分次 漂浮的方法。
影响原生质体培养的因素
培养条件
温度，光照
植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
供体细胞的生长同步性
原生质体再生过程
原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质 体在适当的培养方法和良好的培养条件下， 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细 胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分 化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生
胡萝卜培养 6d 细胞
8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体
矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d
10
马铃薯子叶 48h 46.1 马铃薯花粉 2h
2周后形成20~25 个细胞的细胞团 15d形成细胞团 28d愈伤组织 9~10d形成16个 细胞的细胞团 15d形成细胞团
影响原生质体培养的因素
原生质体的活力
原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生
质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能 分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率 常显著提高。
渗透压稳定剂 培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 培养基为基础 改进的。
渗透压稳定剂
植物原生质体的分离实验
植物原生质体的分离实验实验一植物原生质体的分离与培养一．教学目标：熟悉植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，熟悉原生质体活性鉴定的原理。
掌握分离与培养原生质体的技术、方法与原理。
掌握细胞活性的检测方法。
掌握细胞计数的原理与方法。
二．重点：掌握分离与培养原生质体的技术、方法与原理。
掌握细胞活性的检测方法。
掌握细胞计数的原理与方法。
三．难点：分离与培养原生质体的技术。
四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或者具体指导。
五．教学内容:实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。
其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁要紧由纤维素、半纤维素与果胶质构成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶与果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,务必保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或者蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳固原生质膜。
其次,还应当考虑取材、酶的种类与纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂与再生植株。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
细胞计数通常用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。
从理论上讲，植物体的任何一部分都能够通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。
但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。
因此，为了制备健康的原生质体，通常选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或者次生加厚的外壁，则不能被酶降解。
第五章 植物原生质体的分离与培养
八. 原生质体融合
（二）杂种细胞的选择与细胞杂种的鉴定 1. 杂种细胞的选择方法 （1）培养基促进异核体生长的选择方法 （2）叶绿素缺失互补选择法 （3）机械分离，肉眼分辩法 （4）双突变系选择法 （5）荧光标记选择法
八. 原生质体融合
2. 体细胞杂种的鉴定
这种鉴定不但在于确认细胞杂种的杂种
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
原生质体的融合过程
八. 原生质体融合
原生质体的融合过程
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
（一）原生质体融合的方法 1. 无机盐诱导融合 用来做融合剂的无机盐是硝酸钠，1972年
Carlsony就是用它来融合烟草的原生质体，并 首次获得种间的体细胞杂种。其原理是硝酸钠 的作用是中和了质膜的负电荷，使原生质体不 再相互排斥，而紧密结合在一起，但硝酸钠对 原生质体有害作用，且诱导频率也很低，所以 目前很少有人采用。
二. 植物原生质体的基本特点与作用
5.植物原生质体为研究细胞壁的生物合成
提供了方便。 6.植物原生质体为研究细胞膜与信息的传 递，能量的转换，物质的运输等基本现 象之间的密切联系提供了可能。 7.植物原生质体不但是良好的受体，同时 又是分离细胞内各种细胞器，如细胞核、 叶绿体、线粒体等的好材料。 见图1：
融合技术要点：
P1 P2
混合静止1min
P1 P2
加入PEG
选 择
培 养
高Ca2+高pH
加入培养基
融 合
洗 涤
电场下形成原生质体凝聚体
八. 原生质体融合
3. 电融合技术
就是使用电融合仪，其优点在于避免了
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综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养
植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义,在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。
它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。
植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。
1954年，植物单细胞培养才获得成功。
Mllir培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；I960年Jones等建立了微室培养法。
同年，Cocking 应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。
随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，现在常用的原生质体培养方法有：液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等。
实验目的
了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程实验原理
植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞。
是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。
高Ca高pH法和电融合法：
PEG作为一种高分子化合物，20〜50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗.使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醛键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可昨为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥, 因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱.这样将•引起电荷的紊乱和再分布.从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。
其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。
［实验内容］
1.原生质体分离
2.原生质体融合
3.原生质体及融合体的培养实验材料与用品
三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镶子、培养皿、滤纸、0.21im滤膜、滤器、培养瓶(注：以上用品要进行高压灭菌)、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台实验步骤
1.
（5）黄瓜种子萌发与生根培养基（固体）：1/2MS（注：MS无机成份减半，蔗糖0.2%,琼脂0.7%）（6）黄瓜原生质体形成愈伤组织培养基（固体和液体）:MS+0.05mg/L NAA+lmg/L BA（MS成份见常用数据）⑺黄瓜原生质体愈伤组织分化培养基（固体）：MS+5mg/L NAA
（8）无菌蒸储水⑼ 0.1%HgC12
注：以上（1） - （4）溶液均要用孔径0.2um滤膜过滤以除去细菌。
（5） - （8）培养基等要进行高压灭菌.黄瓜无菌苗的培养
精选饱满的黄瓜种子，浸种20〜30min后，用0.1% HgC12表面消毒8〜lOmin,无菌水洗涤4〜5次，剥皮，种子接入1/2MS培养基中。
置于温度25±2℃,光照度lOOOLx,光照14〜16h/d的条件下培养。
培养时间约1周。
2.原生质体的分离
取黄瓜无菌苗子叶，切成薄片后，置于酸液中和摇床上（60〜70rpm）,在25〜28℃黑暗条件下，酶解5〜7h,用200目网过滤除去未完全消化的残渣。
在lOOOrpm条件下离心5 分钟，弃上清。
加入3〜4ml I3%CPW洗液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml 洗液。
用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸也，轻轻铺于20%蔗糖溶液上（5ml离心管装3ml20%蔗糖溶液），在lOOOrpm条件下离心5—10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与13% CPW之间，破碎的细胞残渣沉入管底。
用200 W移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中.力U 4mli3%CPW洗液，lOOOrpm离心2-5分钟，弃上清.用血球计数板调整原生质体密度为105 — 106/ml （请参考细胞计数）之间。
3.原生质体融合
将1-2滴原生质体混合物（密度分别为105 — 106/ml）滴入小培养皿，静置8—10分钟。
相对方向加入2滴40%的PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml 含13%甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗1 — 2次即可进行培养：5.观察
两种原生质体加入PEG融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生膜融合,核融合通常于融合体第一次有丝分裂过程中发生。
6.培养（培养基的配制方法）
将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基（固体）上进行浅层培养，在温度
25±2℃,光照度lOOOLx,光照14〜16h/d的条件下培养，经1-2个月后在培养基上出现肉眼可见的细胞团。
细胞团长到2〜4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导分化芽和根，长成小植株。
实验结果实验报告
将原生质体培养分化过程进行显微摄影，并分析结果。
1.简述植物原生质体融合培养研究的实践意义;.哪些因素会影响原生质体融合？。