影响原生质体培养的因素
第九章++植物原生质体培养
（五）复杂有机物
在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物， 可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞 团的形成。 常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解 酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。
二、培养方法
原生质体培养一般采用液体培养的方法，因为： （一）液体浅层培养
（二）平板法培养
（三）悬滴法培养 （四）固液结合培养法
的压力。
（一）渗透压保护剂
（二应注意的问题
（一）渗透压保护剂
原生质体分离及培养过程中渗透压的调节通常 利用糖或糖醇来控制， 常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗 糖，其中甘露醇和山梨醇或其组合最常用。叶原生 质体分离时最常用的为甘露醇（浓度为 0.23~0.90M）。 有效的渗透浓度决定于原生质体分离期间叶细 胞的渗透压。内源细胞渗透压明显地受环境条件的 影响，并且能够用暗处理植株和幼叶组织等措施加 以控制。
三、酶处理
1、原生质体分离在很大程度上取决于所用酶的性质 和浓度 ，因此要做好酶种类、处理浓度的选择。 2、酶处理的适宜条件 （1）pH值 酶的活性与pH有关，用于分离原 生质体的大多数酶适宜的PH为4.7-6.0 。 （2）温度 对用来分离原生质体的酶类来说， 最适温度是40~50℃，但分离原生质体时以25~30℃ 为宜。 （3）光照 通常在黑暗或在低光强下分离原生 质体。
（二）应注意的问题
1、在酶处理液、原生质体清洗介质及原生质体 培养基中必须加入合适的渗透压保护剂。 2、原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中 稳定。较高水平的渗透压虽可阻止原生质体破裂， 但影响细胞的代谢、分裂和生长。 3、在分离原生质体时，可以使用电解质渗压剂， 但在原生质体培养时一般不用。 4、当用非电解质为渗压剂时，在酶液中加入某 些盐类，如Cacl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾，可以 提高质膜的稳定性。
原生质体制备
1.影响原生质体数量和活力的因素（1）细胞壁降解酶的种类和组合不同植物种类或同一植物种的不同器官以及它们的培养细胞，由于它们的细胞壁结构组成不同，分解细胞壁所需的酶类也不同。
例如，叶片及其培养细胞用纤维素酶和果胶酶，根尖细胞以果胶酶为主附加纤维素酶或粗制纤维素酶（Driselase酶），花粉母细胞和四分体期小孢子用蜗牛酶和胼胝质酶，成熟花粉用果胶酶和纤维素醇。
（2）渗造压稳定剂用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整原生质体的释放。
这种高渗液称为渗透压稳定剂。
常用的滲透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCI、MgSO4.7H2O）等。
在降解细胞壁时，渗透压稳定剂往往和酶制剂混合使用。
滲透压稳定剂中，用得最多的是甘露醇，常用于烟草、胡萝ト、柑橘、蚕豆原生质体制备；蔗糖常用于烟草、月季等；山梨醇常用于油菜原生质体制备。
滲透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物种类而异，例如胡萝ト用0.56mol ／L甘露醇，月季用14％蔗糖，柑橘用0.8mol／L甘露醇，蚕豆用0.7mol／L甘露醇，烟草的四分体用7％熊糖，烟草的成熟花粉用13％甘露醇。
（3）质膜稳定剂质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防止质膜破坏，促进原生质体胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。
如在分离烟草原生质体时，在酶液中加人入葡聚糖硫酸钾，一旦洗净确液进行培养，原生质体很快长壁并持续细胞分裂形成细胞团。
而未加葡聚糖硫酸钾的对照，原生质体经一周培养即解体。
常用的原生质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、氯化钙、磷酸二氢钾等。
（4）pH的影响分离原生质体时，酶液的pH是值得注意的问题。
因为降解酶的活力和细胞活力最适pH是不一致的低pH时（＜4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高时，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。
细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
(三) 渗透压稳定剂
➢ 常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和盐类 等。
➢ 不同物种原生质体分离时，所需的渗透压稳定 剂也不同。
➢ 原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更 为稳定。
➢ 较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和 出芽，但同时也可能会抑制原生质体的分裂。
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
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•马铃薯原生质体再生植株
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
四、原生质体培养过程中的遗传变异
• 适应性变异 为非遗传变异，会随着环境条件的改变丧失其变异 特征。
漂浮法 不连续梯度法
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
沉降法
• 方法：比重小的等渗溶液中，对酶解物先过滤， 再低速离心，使完整的原生质体沉降于管底。
• 渗透压调节剂：甘露醇。 • 筛网过滤：除去大的组织碎片和残渣，孔径
44~169μm，依原生质体大小来定。 • 离心：900~4500r/min。
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
（二）酶的种类、组合和酶解时间
• 草本植物：2~3种酶混合液。纤维素酶为 0.5%~3%，果胶酶为0.1%~1%。
• 木本植物 ：纤维素酶同草本，果胶酶更多。 • 成熟花粉粒和四分体小孢子：除纤维素酶类和果
胶酶类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质 酶，浓度为0.5%~2%。
➢ 温度： 一般为24~30℃，但不同物种间差异比较大。
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
三、原生质体再生过程
1、细胞壁再生 2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 3、植株再生
植物原生质体培养的影响因素分析
Ａｎ ｌ ｉ ｆｉ ｆｕ ｎ ｅｆ ｃ ｏ ｓ ｏ ａ ｏ ｏ ａ ｔｃ ｔ ｅ ａ ｙｓｓ ｏ ｎ ｌ ｅ ｃ ａ ｔ ｒ ｎ ｐｌｎｔｐｒ ｔ ｐｌ ｓ ｕｌｕｒ
Ｍ Ａ ｕｉｌｎ ＬＩＹｕ ｚ Ｈ —ｉ ｇ， — ｈｕ
（ ｌ ｇ ｆＰｒ ｔ ｃ ｌｕ ｅ Ｇａ ｓ ｒｃ ｌｕ ａ ｉｅ ｓ ｔ ， ｎ ｈ ｕ ７ ０ ７ Ｃｈ ｎ ） Ｃｏｌ ｅｏ ａ ａ ｕ ｔ ｒ ， ｎ ｕ Ａｇ ｉｕ ｔ ｒ ｌＵｎ ｖ ｒ ｉｙ Ｌａ ｚ ｏ ３ ０ ０， ｉａ ｅ
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用 ． 些 遗传 上异 源 的 或 多倍 体植 物 的 同一 个 体来 一 源 的体 细胞 中往往 产 生 无 性 分 离 的 现象 ， 同时 培养
过程 中发 生体 细胞 变 异 ， 生质 体 为 分离 其 中的有 原 用 变 异提供 了机 会 ． 正是 这 一特殊 性能 ， 使原生 质体
成 为植 物遗 传 育种 的一 个 理 想 的受 体 系 统． 在植 物
遗传 物 质 的导人 和表 达 的研究 及作 物优 良品种 的选
育 中 ， 物原 生 质体 培 养 技 术 发 挥 着其 独 特 而有 效 植
的作 用 ．
的条 件下 进行 准确 的操作 及进 行 转化 体和重 组体 的 分析 ． 植物 原生 质体仍 然保 留细胞 的全 能性 ， 能在控 制条 件下再 生成 完整植 株 ， 进行 无性 繁殖 ． 同植物 不 的原 生质体 可 以在诱 导 的条 件 下 彼 此 融合 ， 生质 原
生命 科学 的发 展 离 不 开新 技 术 的产 生 和 完善 ， 植物 原生质 体培 养和 体细 胞杂 交技 术促 进 了与之相 关领 域科 学研 究 的 进程 ． 物 原生 质 体 是 脱 去 了细 植 胞壁 的裸露 细胞 ， 由于无细 胞壁 ， 生质体 可 以摄人 原 细胞器 、 微粒 体 、 毒 以及一 些大 分子 物质 ， Ｄ 病 如 ＮＡ 等． 生质体 的这种 摄人 能力 ， 利 于人们 进行 遗传 原 有 物 质 的导 人和 表达 的广 泛 研究 ， 且 也 易 于在 控 制 而
微生物原生质体制备及再生的影响因素
文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093微生物原生质体制备及再生的影响因素谭文辉，李燕萍，许杨（南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047） 摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。
本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。
关键词：原生质体；制备；再生Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts ofMicroorganismTan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang(The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint ResearchInstitute, Nanchang 330047, China)Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research.Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
第八章植物原生质体培养
一、原生质体的分离 二、原生质体的纯化 三、原生质体的培养方法 四、影响原生质体培养的因素 五、原生质体再生
原生质体： 原生质体：指脱去植物细胞壁 后裸露的、有生活力的原生质团。 后裸露的、有生活力的原生质团。 和植物正常细胞相比，除了没有细 和植物正常细胞相比， 胞壁外，具有活细胞的一切特征。 胞壁外，具有活细胞的一切特征。
封口后，离心， 封口后，离心，原生质体漂浮在上面
用吸管收集原生质体液面， 用吸管收集原生质体液面，放入液体培养基 或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次 或甘露醇悬浮洗涤原生质体 次
将原生质体悬浮在液体培养基中备用
漂浮法的优点： 漂浮法的优点：原生质体纯度高。 缺点：原生质体收率低。 缺点：
3、不连续梯度法 、
（2）酶分离法 ）
两步法： 两步法：
果胶酶处理材料
优点：
所获得的原生质 体均匀一致、 体均匀一致、质 量好； 量好；
游离出单细胞
纤维素酶处理单细胞
缺点：
操作复杂， 操作复杂，已被 淘汰。 淘汰。
分离出原生质体
一步法
外植体
酶液配制：注意纤维素酶、 酶液配制：注意纤维素酶、果胶酶和渗 透压稳定剂（甘露醇）的配比及pH 透压稳定剂（甘露醇）的配比及 酶液离心 过滤灭菌后-20℃ 过滤灭菌后 ℃保存 外植体放入酶液， 外植体放入酶液，真空泵抽引渗透处理 26℃摇床振荡2-8小时 ℃摇床振荡 小时
3、原生质体的分离方法 、
首先对外植体进行预处理，有两种方法： 首先对外植体进行预处理，有两种方法：
低温处理：外植体放在4℃下，黑暗中1-2天。 外植体放在 ℃ 黑暗中 天 等渗溶液处理：外植体放在等渗溶液中数小时。 外植体放在等渗溶液中数小时。
组织培养——精选推荐
组培的基本操作1、培养基的主要成分①水分：构成培养基的绝大部分组分为水分。
在研究上，常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水。
②无机盐类：无机盐类中根据植物的需要量可以分为大量元素和微量元素。
植物从培养基中吸收的大量元素有N、P、K等。
它们是构成植物细胞中核酸、蛋白质以及生物膜系统等必不可少的营养元素。
微量元素包括Fe、Mn、Zn、B等，它们在培养基中的添加量虽然很少，但也是不可缺少的，这些元素是很多酶和辅酶的重要成分，直接影响着蛋白质的活性，铁又是叶绿素的重要成分。
③有机营养成分I、糖类物质：对于植物组织培养中幼小的外植体而言，由于其光合作用的能力较弱，培养基中的糖类物质就成了其生命活动中必不可少的碳源和能源。
除此之外，糖类的添加还有调节培养基渗透压的作用II、维生素类：维生素类物质的添加对愈伤组织和器官形成有促进效果。
维生素C还有防止组织褐变的作用III、氨基酸类：在培养基中常用的氨基酸有甘氨酸、酪氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天门冬胺等。
这些氨基酸类物质不仅为培养物提供有机氮源，同时也对外植体的生长以及不定芽、不定胚的分化促进作用。
④植物生长调节物质：植物生长调节剂在培养基中的用量虽然微小，但是其作用很大。
它不仅可以促进植物组织的脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不定胚的形成，最常用的有生长素和细胞分裂素，有时也会用到赤霉素和脱落酸。
⑤天然物质；椰子汁、香蕉泥等天然有机物质的添加，有时会有良好的效果，在这些天然有机物质中，通常含有机营养成分或生理活性物质。
⑥PH；pH过高时，培养基会变硬；pH过低时，则影响培养基的凝固⑦凝固剂：在配制固体培养基时，需要使用凝固剂。
最常用的凝固剂是琼脂⑧其他添加物：有时为了减少外植体的褐变，需要向培养基中加入一些防止褐化的物质，如活性碳、维生素C等。
此外，在灭菌比较困难的植物材料时，也可以添加一些抗生素物质，以此来抑制杂菌生长。
2、培养基的基本类型①含盐量较高的培养基：其代表是MS培养基，主要特点是无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子含量丰富，元素平衡较好，缓冲性能好，微量元素和有机成分含量齐全且丰富，是目前使用最广泛的培养基。
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16.1.1植物原生质体的分离
•常用的分离方法 •机械分离法 •酶解分离法
★ 机械分离法
• －先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细 胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球 形式，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可 以释放出完整的原生质体。
4）酶液的pH值：
• 取决于植物材料，一般在5.4-6.0；
• pH值低，酶活性强，分离快，但易于损害
细胞，原生质体产率低；
• pH值高，酶活性弱，分离慢，但不易损害 细胞，原生质体产率高；
植物材料的生理状态：
• 如株龄、发育状态、栽培条件等对取材影响很大；
• 一般选取体细胞分裂旺盛的材料； • 选取愈伤组织或胚状体效果更好。
纯化后的叶肉原生质体
植物原生质体融合
• 原生质体融合(protoplast fusion)：指通过 物理或化学方法，使遗传性状不同的两个 细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有 双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
• 还包括融合后的重组细胞分化再生形成新 物种的技术过程。
植物细胞杂交的几个重要进展
• 1960年，Cocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；
前言
• 植物原生质体的概念
• 植物原生质体融合的涵义 • 植物原生质体融合的发展
植物原生质体的概念
• 原生质体就是除去了细胞壁的裸露的球形 细胞。 • 原生质体具有一切活细胞的特性，同时具 有许多细胞完整细胞不具备的特点。这些 特点和植物细胞全能性结合起来，使植物 原生质体在遗传工程和体细胞遗传学中开 辟了一个理论和应用研究的崭新领域。
进行纯化。
2）离心沉降法
• 将上述滤出液置于离心管中，在70g100g下离心2-3分钟，原生质体将沉于管
底，细胞碎屑浮于上清液中。
• 弃上清，冲洗液冲洗，50g下离心3-5分 钟。
3）漂浮法
• 利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液做离 心液，将经过镍网初筛的过滤液置于蔗糖溶 液的顶部，在100g下离心10分钟，离心后， 碎屑沉淀，纯净的原生质体将出现在蔗糖溶 液和原生质体冲洗液的界面上。 • 利用移液管将原生质体吸出，转移到另一个 离心管中，用冲洗液冲洗3次。 • 离心质体数量和活力的因素
• • • • • • 1）材料特性与降解酶： 2）渗透压稳定剂： 3）质膜稳定剂： 4）酶液的pH值： 5）温度因子 25-27 ℃ 6）植物材料的生理状态：如株龄、发育状 态、栽培条件等对取材影响很大；
1）材料特性与降解酶：
• 不同种类植物或不同组织和细胞，其细胞 壁的组成和结构有差异； • 植物的细胞壁特性决定了分离原生质体所 用的降解酶种类与组合
• 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。
原生质体材料来源
★ 植物叶片
－取材容易 －比较容易用酶解法分离
★ 植物根尖组织
－可由各种植物的种子萌发后取得
★ 植物花粉
－产生单倍体原生质体
★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞
－细胞壁容易解离
16.1植物原生质体的制备
• 16.1.1植物原生质体的分离
刚游离出来的叶肉原生质体
16.1.3 植物原生质体的纯化
• 酶解后的混合物中将含有完整的原生质体、 亚细胞碎屑（叶绿体、维管成分）、未被消 化的细胞等，因而必须将这些杂质除去。
• 初步筛选：利用50-70µm孔径的镍丝网过滤 混合物，收集滤出液，做进一步的纯化。
1）过滤法
利用孔径更小的镍丝网过滤最初的滤出液
– －优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破 坏作用。 – －缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。
★ 酶解分离法
– 常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶类（纤维 素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果 胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、 蜗牛酶和胼胝质酶。 – 优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎 所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶 解法获得原生质体。 – 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质。影响所获原生质体的 活力。
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
• 学习目的：了解植物原生质体的制备和
融合技术，了解杂种细胞的筛选和鉴定
方法。 • 重点：植物原生质体的制备和融合技术 • 难点：植物杂种细胞筛选
内容
• • • • • • 前言 16.1植物原生质体制备 16.2植物原生质体融合 16.3植物杂种细胞筛选 16.4植物杂种细胞鉴定 16.5植物体细胞融合意义
2）渗透压稳定剂：
• 渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质
体免于膨胀破裂，而且还有助于酶和底物的结合， 原生质体从组织中加快释放。 • 常用的如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类 （KCl, MgSO4.7H2O)等；
3）质膜稳定剂：
• 增加对质膜的稳定性；促进原生质体细胞
壁再生以及细胞分裂。 • 如葡聚糖硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾、 MES( 2-N-吗啉乙烷磺酸)等
• 1970年，Power首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生 质体诱导融合；
• 1971年，Nagata和Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生 完整植株； • 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是 第一个植物细胞杂种； • 1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相 应的融合技术； • 1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）； • 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；
原生质体的分离步骤
• • • • • • • （一）取材（叶肉细胞） 充分展开的嫩叶。 洗涤、消毒、无菌水冲洗。 对禾本科植物叶片消毒时，使用苄烷铵（Zephiran） （0.1%） - 酒精（10%）溶液漂洗5分钟效果最好。 （二）酶解 原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和 浓度。 纤维素酶主要分解细胞壁纤维素。 果胶酶主要降解细胞壁间的中胶层。 有些组织在制备原生质体时，可能还会需要半纤维素酶。 离析酶是一种工程酶，可把植物组织分离成单细胞, 与纤 维素酶配合使用制备高等植物原生质体 。